FABP-5基因沉默对人胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及肿瘤干细胞标志物CD44+CD133+表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
表皮型脂肪酸结合蛋白5：是在表皮细胞中发现的脂肪酸结合蛋白，其分子质量为15 ku，在肿瘤发生及发展中发挥关键的作用。肿瘤相关的上皮细胞黏附分子可以使FABP-5基因表达上调，高表达FABP-5基因的肿瘤细胞通过脂肪酸代谢产物影响细胞的信号转导功能。
肿瘤干细胞：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长，但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞的理论，这一理论为重新认识肿瘤的起源和本质提供了新的方向和视觉角度。

摘要
背景：已有研究表明，FABPs在多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膀胱上皮癌都有不同程度的表达，与恶性肿瘤的发生、转移、侵袭和抗药性关系密切。
目的：探讨沉默FABP-5基因表达对人胶质瘤细胞U251增殖、侵袭、凋亡的影响。
方法：以人胶质瘤细胞U251细胞为研究对象，根据FABP-5 mRNA编码序列设计并合成干扰siRNA序列，瞬时转染U251细胞。将人胶质瘤细胞U251分为3组：FABP-5-shRNA组加入Lv-shRNA-FABP-5，阴性对照组加入LV-shRNA-NC，空白对照组仅行常规培养。RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平检测FABP-5的表达，CCK-8法测定细胞体外增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡及肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达，TUNEL染色检测细胞凋亡。
结果与结论：①与阴性对照组和空白对照组比较，FABP-5-shRNA组的FABP-5 mRNA和蛋白表达明显下降；②与阴性对照组和空白对照组比较，FABP-5-shRNA组细胞生长速度明显减慢，细胞周期阻滞在G₀/G₁期，S期细胞数减少；肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达比例亦显著降低(P < 0.05)；③与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5-shRNA组细胞凋亡率明显升高(P < 0.01)，增殖、侵袭力显著下降(P < 0.05)；④结果表明，FABP-5基因可能直接或间接地参与到胶质瘤细胞周期的调控和凋亡过程，其基因的表达水平改变与肿瘤细胞侵袭力关系密切。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2849-8117(刘海鹏)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胶质瘤, RNA干扰, 表皮脂肪酸结合蛋白5, 细胞周期, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: It has been demonstrated that there are different expressions of fatty acid binding proteins (FABPs) in most malignant tumors such as breast cancer, prostate cancer, liver cancer, lung carcinoma and bladder carcinoma; therefore, FABPs are closely related to the occurrence, metastasis, invasion and drug resistance of malignant tumors.
OBJECTIVE: To investigate the effects of fatty acid binding protein-5 (FABP-5) silencing on the proliferation, invasion and apoptosis of U251 cells (human glioma cells).
METHODS: siRNA molecules targeting the mRNA of FABP-5 was designed and chenically synthesized, which was transiently transfected into U251 cells. U251 cells were divided into three groups: Lv-shRNA-FABP-5 was added into FABP-5-shRNA group, LV-shRNA-NC added into negative control group, and blank control group underwent normal culture. mRNA and protein expressions of FABP-5 were detected by RT-PCR and western blot assay, respectively. The cell proliferation in vitro was determined by cell counting kit-8 assay, the cell cycle, apoptosis and expressions of CD44⁺ and CD133⁺ were detected by flow cytometry, and the apoptosis was observed using TUNEL staining.
RESULTS AND COUNCLUSION: mRNA and protein expressions of FABP-5 in the FABP-5-shRNA group were significantly lower than those in the negative control and blank control groups. Compared with the negative control and blank control groups, the cell growth rate was significantly decreased, the cell cycle arrested in the G₀/G₁ phase, and the cell number in the S phase was decreased, and moreover, the proportion of CD44⁺/CD133⁺ expression was significantly decreased in the FABP-5-shRNA group (P < 0.05). Besides, compared with the negative control and blank control groups, the apoptosis rate was significantly increased, and the cell proliferation and invasiveness were significantly decreased in the FABP-5-shRNA group (P < 0.05). In conclusion, it is possible that FABP-5 directly or indirectly regulates the cell cycle and apoptosis of glioma cells, and its expression changes share a close relationship with the invasiveness of tumor cells.

Key words: Neoplastic Stem Cells, Glioma, RNA Interference, Fatty Acid-Binding Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘海鹏，王冀伟，郑克彬. FABP-5基因沉默对人胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4142-4148.

Liu Hai-peng, Wang Ji-wei, Zheng Ke-bin. Effects of fatty acid binding protein-5 silencing on proliferation, apoptosis, invasion of human glioma cells and expressions of CD44⁺ and CD133⁺[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4142-4148.

图/表（结果） 2

2.1 shRNA下调U251细胞FABP-5 mRNA的表达水平 RNA干扰后U251细胞FABP-5 mRNA水平见图1。FABP-5-shRNA组相对表达量为0.17±0.03，与阴性对照组(0.68±0.04)和空白对照组(0.64±0.05)相比显著减少(P < 0.01)。阴性对照组与空白对照组FABP-5 mRNA表达差异无显著性意义，说明实验所设计合成的干扰序列能特异性抑制FABP-5基因的表达。

2.2 shRNA下调U251细胞FABP-5蛋白的表达 RNA干扰后U251细胞FABP-5 蛋白水平见图2。FABP-5- shRNA组相对表达量为0.39±0.06，与阴性对照组(1.78±0.12)和空白对照组(1.76±0.14)相比均有明显减少(P < 0.01)，阴性对照组与空白对照组间FABP-5蛋白表达量无明显变化(P > 0.05)，进一步表明实验设计合成的干扰序列能特异性抑制FABP-5蛋白的表达。

2.3　CCK-8法检测U251细胞增殖情况 CCK-8法检测结果见图3，表1。与空白对照组和阴性对照组相比，在转染24，48，72，96，120 h时FABP-5-shRNA组细胞490 nm处的吸光度值较低，差异有显著性意义(P < 0.05)。绘制生长曲线，可见FABP-5-shRNA组细胞增殖明显地受到了抑制。

2.4 各组细胞体外侵袭力 如图4所示，空白对照组和阴性对照组穿膜细胞数量较多，分别为65.23±8.42和63.65±7.58，FABP-5-shRNA组穿膜细胞数明显减少(27.95±5.54)，差异有显著性意义(P < 0.01)。实验结果表明特异性干扰FABP-5基因表达可使U251细胞的侵袭性减弱。

2.5 流式细胞术检测细胞周期分布 与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5-shRNA组G₁期细胞比例明显减少(P < 0.05)，S期细胞比例明显增高(P < 0.05)，G₂/M期细胞比例也有增高(P < 0.05)，阴性对照组和空白对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 见图5。FABP- 5-shRNA组中U251细胞凋亡率(26.85±0.43)%明显高于空白对照组(2.44±0.34)%和阴性对照组(2.55± 0.7)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，表明RNA干扰技术沉默FABP-5基因可以明显加快促进U251细胞的凋亡。

2.7 流式细胞仪检测细胞表面抗原表达 FABP- 5-shRNA组细胞CD44、CD133的表达明显低于阴性对照组和空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；阴性对照组和空白对照组比较差异无显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.8 TUNEL染色观察细胞凋亡 与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5-shRNA组出现较多细胞核被染成棕黄色的凋亡细胞(图6)，凋亡指数分别为(5.81± 2.25)%，(8.22±3.73)%和(38.72±6.78)%，FABP-5- shRNA组与阴性对照组和空白对照组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年6月在河北医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料 人胶质瘤细胞系(U251)购自拜力(上海)生物科技有限公司；shRNA靶点设计FABP-5基因沉默重组慢病毒颗粒LV-shRNA-FABP-5及对照空载体慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)均由吉满生物科技(上海)有限公司提供；DMEM、PBS、胎牛血清均购自南京森贝伽生物科技有限公司；反转录试剂盒购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；TRIzol购自北京百欧捷科贸有限公司；荧光定量PCR试剂盒购自美国Fermentas公司；DNA Marker购自成都法玛基因科技有限公司；IP细胞裂解液及Western blot、苯甲基磺酰氟购自上海一研生物科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、BCA蛋白浓度测试试剂盒(增强型)购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司；PVDF膜购自美国PALL公司；碘化丙啶和RNase酶购自上海伯易生物科技有限公司；荧光显微镜购自德国Leica公司；流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；凋亡试剂盒购自美国Abcam公司；细胞侵袭实验采用Cell Invasion Assay Kit(Chemicon International Cat. No. ECM550)；FABP-5和GAPDH基因引物由吉凯(上海)基因化学技术有限公司合成并通过测序验证；兔抗人FABP-5单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自长春博迅生物技术有限责任公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养和转染^[6]胶质瘤细胞株U251细胞接种于含体积分数为10%小牛血清、100 U/mL左氧氟沙星的DMEM培养基内，培养于37 ℃、体积分数为5%CO₂密闭式孵箱内。随机选取处于对数生长期的细胞分为3组：FABP-5-shRNA组加入Lv-shRNA-FABP-5，阴性对照组加入LV-shRNA-NC，空白对照组仅行常规培养，转染前12 h将对数生长期的人胶质瘤细胞株U251细胞进行胰酶消化，将制成的细胞悬液接种于6孔板(细胞数约为6×10⁴)中，放置在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到20%-30%后再进行转染，每孔均加入等量Polybrene及感染增强液，转染的感染复数设定为10，每组均设置3个重复孔。LV-shRNA- FABP-5的靶点序列5’- TGG GAA GGA AAG CAC AAT A-3’，NC(Negative Control)的靶点序列5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’。

1.4.2 RT-PCR检测FABP-5 mRNA表达 于转染3 d后收获细胞，用TRIzol试剂盒提取出U251细胞(6×10⁵细胞)的总RNA，定量后按反转录试剂盒说明书步骤合成cDNA。应用Primer Primer 5.0软件进行引物设计，FABP-5上游引物为5’-TGA AGG AGC TAG GAG TGG GAA-3’，下游引物为5’-TGC ACC ATC TGT AAA GTT GCA G-3’，扩增片段212 bp；内参GAPDH的上游引物为5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’，其下游引物为5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’，扩增片段121 bp。PCR引物由上海生物工程公司合成，每组均设3个复孔，每次实验以相同步骤重复3次。RT-PCR的反应条件及步骤如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s；共累计40个循环。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪观测结果，应用Image-Pro Plus 7.0 软件分析条带的灰度值，用FABP-5/GAPDH比值代表FABP-5 mRNA的相对表达量。

1.4.3 Western blot检测FABP-5蛋白表达 于转染3 d后收获细胞，提取各组细胞的总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，上样总蛋白50 μg，进行8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再以湿转法将所得凝胶转移至PVDF膜上。待转膜完成后将该膜用10%脱脂奶粉于室温封闭2 h，加入FABP-5、GAPDH(1∶800稀释)一抗，放置于摇床上在4 ℃下孵育过夜，次日用TBS-T(三乙醇胺缓冲盐水溶液)洗膜3次，每次10 min，洗膜后加入二抗(1∶5 000)，置于暗室中曝光，用超敏ECL化学发光试剂检测蛋白条带，获取图像并对其进行条带灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.4.4 CCK-8法检测U251细胞的增殖能力 按4 000个/孔的细胞密度将U251细胞接种于96孔培养板上，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基200 μL，每组设5个复孔，另设空白孔作为对照。转染24，48，72，96，120 h后每孔加入CCK-8 20 μL，于培养箱中孵育4 h，酶标仪检测490 nm处的吸光度值，取平均值，并绘制出生长曲线。

1.4.5 细胞划痕损伤实验 于转染3 d后收获细胞，将对数生长期细胞以5×10³/孔的细胞密度接种于6孔板上，待所培养细胞生长至90%融合后，用10 μL移液枪头或无菌牙签在单层细胞上做呈“一”字型划痕，0.01 mol/L PBS冲洗3次以去除表面的漂浮细胞，然后分别用2 mL培养基重悬并于37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下继续培养48 h，倒置显微镜在100倍视野下观察细胞的迁移情况。

1.4.6 流式细胞仪检测细胞周期分布 于转染3 d后收获细胞，胰酶消化，PBS冲洗2次，加入1 mL预冷(4 ℃)的体积分数为70%乙醇，在4 ℃恒温下固定过夜，次日再用PBS洗涤2次，配制成1.0×10⁸ L^-¹的细胞悬液，混匀后，以细胞悬液∶碘化丙啶=1∶1加入适量的碘化丙啶液，4 ℃条件下避光孵育30 min，用300目筛网过滤细胞悬液以去除粘连的细胞，流式细胞仪分析DNA含量，软件分析G₀/G₁、S、G₂/M各期的细胞数及每期细胞所占比例。

1.4.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 于转染3 d后收获细胞，用不含EDTA的胰酶消化，移入无菌1.5 mL Ep管中，4 ℃、2 000 r/min条件下离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，加入500 μL binding buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V -FITC混匀，再加入5 μL碘化丙啶混匀，室温、避光反应5-15 min，1 h内用流式细胞仪检测，激发波长(Ex)为488 nm，发射波长(Em)为530 nm。

1.4.8 流式细胞术检测细胞表面抗原表达 于转染3 d后分别收集各组1×10⁷个细胞，PBS冲洗3次，分装入5 mL流式检测管中，每管定量300 μL，将CD133-PE、CD44-APC抗体溶液(1 g/L)按1︰20的比例混合稀释后加入样本中，轻轻摇匀后冰上孵育20 min，用含体积分数为2%胎牛血清的PBS冲洗2遍，然后制备细胞悬液，每管300 μL，冰上避光孵育，每15 min用吸管轻轻吹打1次，孵育30 min后离心，PBS洗涤2遍，用含体积分数为2%胎牛血清的冰PBS重悬，然后以流式细胞仪检测CD133，CD44的表达。各组实验均重复3次。

1.4.9 TUNEL染色检测细胞凋亡 于转染3 d后收获细胞，进行细胞爬片，吸弃培养液，自然晾干后用40 g/L多聚甲醛溶液固定，经新鲜配制体积分数为3%H₂O₂室温处理，0.1% TritonX-100(溶于0.1%枸橼酸钠溶液)打孔，按TUNEL试剂盒步骤说明操作，DAB显色，苏木精轻度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，再以中性树胶封固，显微镜下观察。每张切片选取3个视野，每个视野连续计数300个细胞，计数凋亡细胞百分比即为凋亡指数。凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 主要观察指标 ①FABP-5 mRNA表达；②FABP-5蛋白表达；③U251细胞的增殖情况；④细胞的迁移情况；⑤细胞周期；⑥细胞凋亡情况；⑦细胞表面抗原表达。

1.6 统计学分析 应用SPSS16.0统计软件进行统计及分析，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。实验数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胶质瘤起源于神经胶质细胞，按病理类型分类包括星形细胞肿瘤、室管膜肿瘤、少突胶质细胞肿瘤和混合性胶质细胞肿瘤，其恶性度分级差异很大，除了Ⅰ级胶质瘤手术效果相对较理想外，其他类型虽经以手术为主的综合治疗，其疗效仍非常不理想，寻求新的治疗策略势在必行^[7-8]。FABPs是一组高度保守的小胞质蛋白，广泛表达于哺乳动物的多种细胞。FABPs在许多恶性肿瘤中表达增高，FABPs通过结合转运脂肪酸及其衍生物以及激素、致癌物质和类固醇等配体影响着肿瘤组织的发生和发展^[9-10]。近年来越来越多的研究表明，FABPs在多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膀胱上皮癌都有不同程度的表达，与恶性肿瘤的发生、转移、侵袭和抗药性关系密切^[11-14]。

研究发现细胞表达的FABPs除了通过转运脂肪酸为细胞生长提供能量及原材料之外，还能够结合和转运各种配体，在与肿瘤生长相关的信号转导中发挥作用，此机制可能与抗原提呈作用有关。在乳腺癌^[15-16]、肺鳞状细胞癌中，FABP-5基因均有显著上调，促进肿瘤的发生发展。在非小细胞肺癌原发癌组织中，FABP-5的表达与肿瘤的病理分级以及有无转移相关。病理分级愈高或有转移的患者，FABP-5的表达愈明显。研究发现膀胱癌中FABP-5的表达水平与其分化程度呈正相关，FABP-5的表达水平随着膀胱癌分化程度的降低而降低^[17-18]。体外及体内实验证实FABP-5下调能降低肿瘤细胞转移和抑制肿瘤生长^[19-20]。肝内胆管细胞癌和口腔鳞状细胞癌中FABP-5能够促进肿瘤细胞的增殖并增强细胞的侵袭能力^[21-23]。课题组前期对胶质瘤组织的免疫组化研究显示，胶质瘤病理组织中FABP-5基因表达明显升高，提示FABP-5基因表达上调可能促进胶质瘤的发生与发展。

实验将FABP-5-shRNA表达载体转染进入人胶质瘤U251细胞中，FABP-5-shRNA组FABP-5基因和蛋白的相对表达量较阴性对照组和空白对照组明显降低，说明实验设计合成的干扰序列能特异性抑制FABP-5基因的表达。CCK-8检测得出FABP-5-shRNA组细胞增殖活力明显受到抑制。流式细胞仪及TUNEL染色检测发现，FABP-5基因沉默后可以明显促进U251细胞的凋亡。流式细胞仪检测显示FABP-5基因沉默后U251细胞分裂阻滞在G₂/M期附近，抑制胶质瘤U251细胞的增殖。研究表明CD44⁺CD133⁺可做为胶质瘤干细胞的表面标志物。流式细胞仪检测肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达比例显著降低，FABP-5-shRNA组的细胞侵袭力明显低于空白对照组和阴性对照组，表明FABP-5基因沉默降低胶质瘤细胞的侵袭力。

总之，慢病毒RNA干扰技术敲除FABP-5基因后可影响胶质瘤细胞的增殖和促进其凋亡，而且能明显抑制胶质瘤细胞的侵袭力和干细胞生物学特性，提示FABP-5基因可能直接或间接地参与到胶质瘤细胞周期的调控和凋亡过程，其基因的表达水平改变与肿瘤细胞侵袭力关系密切。因此，FABP-5基因有望成为胶质瘤的新的治疗靶点。