骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞凋亡：细胞凋亡指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束自己生命的过程。细胞凋亡属于一种细胞程序性死亡，从基因角度进行分析，在一定的条件下，细胞内一些相关基因被启动，便会激活相应的内源性DNA内切酶，导致细胞的主动性死亡。
癫痫：是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。

摘要
背景：癫痫与细胞凋亡之间密切相关，癫痫的发生会导致海马神经元出现丢失现象和凋亡，引发一系列程序性细胞死亡的出现。
目的：观察骨髓基质干细胞移植治疗癫痫对细胞凋亡产生的影响。
方法：45只SD大鼠制备癫痫模型，随机分为3组，即癫痫未移植组、生理盐水组和骨髓基质干细胞组，分别实施未移植治疗和生理盐水注射治疗以及骨髓基质干细胞移植治疗。造模后1，2，4周，免疫组织化学法检测3组动物脑组织Bax阳性细胞数、Bcl-2阳性细胞数及Bax/Bcl-2情况。
结果与结论：①不同时间生理盐水组Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2值均未出现明显的改变；②造模后1，2，4周，骨髓基质干细胞组与癫痫未移植组和生理盐水组比较，骨髓基质干细胞组Bax阳性细胞数、Bax/Bcl-2值均出现显著的下降，Bcl-2阳性细胞数则出现显著的增加(均P < 0.05)，骨髓基质干细胞组造模后不同时间组内比较，差异有显著性意义(均P < 0.05)；③结果表明，骨髓基质干细胞移植能下调癫痫大鼠脑组织促凋亡因子Bax阳性细胞数，上调抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数，提示其对癫痫所导致的细胞凋亡产生一定的影响，可能减少癫痫所致细胞凋亡的出现。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-5383-9235(王浩)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 癫痫, 骨髓基质干细胞, 干细胞移植, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: There is a close relationship between epilepsy and apoptosis. The appearance of epilepsy can lead to the loss of neurons in the hippocampus, triggering a series of programmed cell death.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow stromal stem cell transplantation on apoptosis in epilepsy.
METHODS: After modeled to be of epilepsy 45, Sprague-Dawley model rats were randomly divided into three groups, followed by given no intervention (moldel group), normal saline (normal saline group) or bone marrow stromal stem cell transplantation (transplantation group). At 1, 2 and 4 weeks after modeling, the number of Bax-positive cells, Bcl-2-positive cells and Bax/Bcl-2 were detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of Bax-positive cells, Bcl-2-positive cells and Bax/Bcl-2 presented no obvious changes in the normal saline group at different time points. However, the number of Bax-positive cells and Bax/Bcl-2 in the transplantation group was significantly decreased, while the number of Bcl-2-positive cells significantly increased compared with the other two groups at 1, 2 and 4 weeks after modeling (P < 0.05). Moreover, the above indicators varied significantly in the transplantation group at different time points after modeling (P < 0.05). These results show that bone marrow stromal stem cell transplantation can affect the apoptosis and effectively reduce the apoptosis in rats with epilepsy by up-regulating the number of Bax-positive cells and down-regulating the number of Bcl-2-positive cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Epilepsy, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王浩，任向阳，马聪敏，黄超，周海涛. 骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4117-4122.

Wang Hao, Ren Xiang-yang, Ma Cong-min, Huang Chao, Zhou Hai-tao. Correlation between bone marrow stromal stem cells and apoptosis in epilepsy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4117-4122.

图/表（结果） 3

2.1 实验流程与动物数量分析 入组动物均全部进行进入最终的结果分析，未出现中途死亡动物。

2.2 骨髓基质干细胞生长形态学观察 对骨髓基质干细胞进行原代培养，培养4 h后，可见到细胞开始贴壁。培养1 d，贴壁细胞胞体明显增大，胞内出现较多颗粒，培养2 d，出现大量梭形生长细胞，培养3 d，梭形生长细胞更多，见图1。

2.3 各组不同时间Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2值统计 对各组不同时间的Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2值进行检测和统计，可得生理盐水组各项指标在不同时间均未出现明显的改变，但骨髓基质干细胞组Bax阳性细胞数、Bax/Bcl-2值均随时间推移呈现出不断下降的情况，而Bcl-2阳性细胞数则呈现出不断增加的情况，见图2，表1。经过统计学比较可以发现，术后1，2，4周，较之癫痫未移植组与同时间生理盐水组，骨髓基质干细胞组Bax阳性细胞数、Bax/Bcl-2值均出现显著的下降，Bcl-2阳性细胞数则出现显著的增加(均P < 0.05)。骨髓基质干细胞组术后不同时间比较，差异也存在显著性意义(均P < 0.05)。

2.4 免疫组织化学结果 对3组进行免疫组织化学检测：

癫痫未移植组：造模后2周观察，可以观察到存在大量的Bax阳性细胞数和少量的Bcl-2阳性细胞，细胞浆着色均为棕褐色(见图3A，B)。

生理盐水组：造模后2周观察，可以观察到存在大量的Bax阳性细胞数和少量Bcl-2阳性细胞，细胞浆着色均为棕褐色，较之癫痫未移植组Bax阳性细胞数数量出现少量的减少，Bcl-2阳性细胞出现少量的增加(见图3C，D)。

骨髓基质干细胞组：造模后2周观察，可以观察到存在少量的Bax阳性细胞数和大量的Bcl-2阳性细胞，细胞浆着色均为棕褐色，较之癫痫未移植组和生理盐水组数量出现显著的改变(见图3E，F)。

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引言

癫痫是一种严重危害人体健康的疾病，但是，长期以来缺乏治疗癫痫有效的方法^[1]。自从癫痫在人类中出现之后，人们就饱受着病痛的折磨。以往的治疗大多采用药物或者手术方式，但均无法对受损的神经细胞予以有效的修复，无法获得理想的治疗效果^[2]。随着细胞生物技术的发展，干细胞移植治疗癫痫成功的解决了病变的大脑神经元异常放电的情况^[3]。

干细胞是一类具有自我复制能力的未充分分化细胞，医学界称为“万用细胞”。通过干细胞移植，具有分化能力的细胞可以在特定部位发生分化，并对疾病所致受损细胞予以良好的修复。因此，利用干细胞移植方式治疗癫痫等神经性疾病，可以从病变的基础上修复异常放电的大脑神经元，获得良好的且持久的效果，有效避免病情反复发作等的出现。干细胞移植过程中，骨髓基质干细胞移植是一种常用的细胞来源。癫痫与细胞凋亡之间密切相关，癫痫的出现会导致海马神经元出现丢失现象和凋亡，引发一系列程序性细胞死亡的出现^[4-5]。以往有学者报道，癫痫大鼠会出现神经元凋亡现象^[6]，分析其分子机制，是因为在海马CA3区凋亡相关蛋白p-c-Jun的介导下，形成应的核通路，并与Bcl-2介导的非核通路一起，共同对海马神经元细胞产生影响，并导致其凋亡。通过干细胞移植治疗，可能会对疾病所致神经细胞凋亡产生一定的影响，进而达到治疗疾病的目的。但是，以往关于骨髓基质干细胞移植对癫痫所致细胞凋亡的影响相关研究较少。为此，实验通过检测细胞凋亡相关指标Bax阳性细胞数、Bcl-2阳性细胞数及Bax/Bcl-2情况，探讨骨髓基质干细胞移植治疗癫痫对细胞凋亡产生的影响。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验观察。

1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在郑州大学附属洛阳中心医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SD大鼠45只，雌雄不限，体质量300 g左右，健康状况均良好，并饲养于郑州大学附属洛阳中心医院动物中心SPF环境，许可证号SYXK(京)2015- 0008。GFP转基因小鼠5只，雌雄不限，6-8周龄，体质量40 g左右，用于进行骨髓基质干细胞分离培养。研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

试剂与仪器：青霉素广州白云山天心制药股份有限公司)；胰蛋白酶(上海信帆生物科技有限公司)；多聚甲醛(上海甄准生物科技有限公司)；蔗糖溶液(南京安培化工科技有限公司)；立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；倒置显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)；光学显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠癫痫模型制备^[7] 45只SD大鼠均制备癫痫模型，用生理盐水稀释青霉素至浓度为80×10⁴ u/mL，对动物进行腹腔注射，每只动物均连续注射7 d。观察大鼠行为改变情况，每次癫痫发作按照Racine标准进行评分，发作过程均利用摄像机进行记录。最终，所有动物均成功制备癫痫模型。

1.4.2 实验分组 将动物随机分为3组：癫痫未移植组(15只)、生理盐水组(15只)、骨髓基质干细胞组(15只)，分别实施未移植治疗和生理盐水注射治疗以及骨髓基质干细胞移植治疗。

1.4.3 骨髓基质干细胞分离培养与鉴定^[8] 脱颈法处死小鼠，乙醇中浸泡5 min，获得GFP转基因小鼠股骨，利用PBS进行冲洗后，提取骨髓基质细胞，对细胞进行常规培养与鉴定。传代培养，并收集P3细胞，添加抗体CD44和CD45，进行免疫组化染色和观察。收集P5代细胞添加胰蛋白酶进行消化，制备细胞悬液。对细胞悬液进行离心，调整细胞浓度为1×10⁵ L^-¹，保存备用。

1.4.4 分组治疗^[9] 生理盐水组与骨髓基质干细胞组均在大鼠模型癫痫发作7 d后进行治疗。骨髓基质干细胞组利用立体定位仪进行准确定位，利用微量注射器对海马区进行骨髓基质干细胞悬液注射，细胞浓度为1×10⁵ L^-¹，注射剂量5 μL，生理盐水组按照上述相同的方法注射5 μL生理盐水。癫痫未移植组仅制备动物模型，模型建立完毕后不予以治疗。

1.4.5 免疫组织化学检测^[10] 术后1，2，4周分别处死各组5只大鼠，即刻获得完整脑组织标本，置于多聚甲醛中进行固定，并利用不同浓度蔗糖溶液进行梯度脱水。常规制备切片后进行凋亡细胞相关基因bax和bcl-2免疫组化染色：20 μm的脑组织切片，采用二步法，按照bax(1∶300)bcl-2(1∶400)加入抗体，DAB显色，裱片，脱水，中性树胶封固，置于镜下进行观察。

1.5 主要观察指标 3组动物脑组织Bax阳性细胞数、Bcl-2阳性细胞数及Bax/Bcl-2情况。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件分析。计量资料利用x(_)±s形式表示，采用t 检验和单因素方差分析，计算P 值，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

癫痫容易出现反复发作的情况，临床治疗难度很大。以往对癫痫患者进行治疗的时候，大多采用口服西药、中药和针灸以及开颅手术等方式。但往往无法获得理想的效果，治疗结束再次发作^[11-12]。

随着干细胞理论和技术的发展，临床开始积极的通过干细胞移植方式进行癫痫治疗。通过干细胞移植治疗，所移植的干细胞可以对癫痫所致受损神经细胞予以有效的恢复，达到恢复细胞功能，提高治疗效果的目的^[13-15]。王焕明等^[16]建立大鼠颞叶癫痫模型，并利用骨髓源性神经干细胞海马移植方式进行治疗。术后通过观察发现，模型动物的海马脑电图波幅显著下降，获得了理想的治疗效果。尤凤华等^[17]制成大鼠难治性癫痫模型，并通过尾静脉注射骨髓基质细胞方式进行治疗。术后观察发现，模型动物的海马周围典型“卫星灶”显著缩小。较之治疗前，细胞间隙明显减小，细胞数量增加且排列十分整齐，获得了理想的病灶修复效果。在移植治疗中，可以选择不同的治疗方法，其中，骨髓基质干细胞是一种重要的细胞来源。骨髓基质干细胞在适当环境下，通过诱导因子的作用能分化为多种细胞，如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、上皮细胞、神经元及神经胶质细胞。以往王晓霞等^[18]制备大鼠癫痫模型，对骨髓基质干细胞进行诱导分化，获得神经元样细胞，并利用其进行大鼠癫痫模型脑内移植治疗。通过观察发现，利用骨髓基质干细胞来源的神经干细胞移植治疗癫痫大鼠，可以在动物的海马内存活，并发生迁移与整合。

癫痫与细胞凋亡之间密切相关，癫痫的出现会导致海马神经元出现丢失现象和凋亡，引发一系列程序性细胞死亡的出现^[19]。细胞凋亡指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束自己生命的过程^[20-24]。细胞凋亡属于一种细胞程序性死亡，从基因角度进行分析，在一定的条件下，细胞内一些相关基因被启动，便会激活相应的内源性DNA内切酶，导致细胞的主动性死亡^[25-29]。在整个过程中，细胞凋亡的发生由不同的基因进行控制，其中包括Bax等促凋亡基因以及Bcl-2等抗凋亡基因。促凋亡基因可以对细胞凋亡产生促进作用，加快其凋亡^[30-33]。而抗凋亡基因则可以发挥出抑制作用，对细胞凋亡产生有效的抑制^[34]。

实验结果显示，对各组不同时间的Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2值进行检测和统计，骨髓基质干细胞组Bax阳性细胞数、Bax/Bcl-2值均随时间推移呈现出不断下降的情况，而Bcl-2阳性细胞数则呈现出不断增加的情况。经过统计学比较可以发现，术后1，2，4周较之癫痫未移植组与同时间生理盐水组，骨髓基质干细胞组Bax阳性细胞数、Bax/Bcl-2值均出现显著的下降，Bcl-2阳性细胞数则出现显著的增加(均P < 0.05)。Bax是凋亡因子，介导细胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡因子，抑制细胞凋亡^[35-37]。而经骨髓基质干细胞移植治疗之后，显著提高了Bcl-2水平，并促进BAX凋亡因子阳性细胞数的下降，因此可以发挥出抑制细胞凋亡的效果^[38-39]。结果还显示，骨髓基质干细胞组术后不同时间比较，也存在显著差异，均P < 0.05。上述结果表明，随着干细胞移植治疗时间的推移，上述变化越明显。即提示，骨髓基质干细胞移植治疗对癫痫动物脑组织细胞凋亡产生了十分有效的抑制作用；且随着移植时间的增加，所移植的骨髓基质干细胞还可以使宿主神经干细胞发生一定的改变，达到促进抑制凋亡的效果。