针刺对脑性瘫痪模型大鼠神经细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
小儿脑性瘫痪：俗称小儿脑瘫。是指从出生后1个月内脑发育尚未成熟阶段，由于非进行性脑损伤所致的以姿势各运动功能障碍为主的综合征。是小儿时期常见的中枢神经障碍综合征，病变部位在脑，累及四肢，常伴有智力缺陷、癫痫、行为异常、精神障碍及视、听觉、语言障碍等症状。
针刺治疗脑性瘫痪的作用及机制：改善脑血流量，恢复大脑组织形态，减轻大脑萎缩，减少氧自由基的形成，影响突触结构，影响神经递质的含量，影响神经营养因子的表达，减少大脑神经细胞凋亡，在多个环节上发挥作用。

摘要
背景：研究表明针刺可以影响脑瘫动物的脑血流量、减轻大脑组织水肿、改善大脑微循环、减少神经细胞凋亡。
目的：进一步验证针刺对脑瘫大鼠神经细胞凋亡的影响。
方法：SD大鼠45只，随机分为3组：假手术组、模型组、针刺组，每组15只大鼠。模型组和针刺组大鼠结扎左侧颈总动脉建立脑瘫大鼠动物模型；假手术组找到左颈总动脉后不结扎。针刺组从造模后第2天开始进行针刺治疗，1次/d，连续针刺20 d，假手术组和模型组不予任何处理。手术后第21天观察大鼠治疗后的神经功能变化；取大鼠脑组织病理形态学改变，以及神经细胞的凋亡情况。
结果与结论：①运动功能评分：模型组大鼠的均明显低于假手术组(P < 0.05)，针刺组在第21天时的运动功能评分明显高于模型组(P < 0.05)。②苏木精-伊红染色结果：模型组大鼠大脑显示细胞排列紊乱，局部有炎症细胞浸润，见囊性变，神经细胞数量减少，并有变性坏死，胶质细胞增生，细胞核固缩，部分神经细胞有空腔形成，胞体缩小，结构模糊或者消失；假手术组大鼠大脑神经细胞形态和结构正常；针刺组大鼠大脑神经细胞的形态和结构改变介于假手术组和模型组之间。③细胞凋亡数目：模型组的神经细胞凋亡明显高于假手术组(P < 0.05)；针刺组的神经细胞凋亡数目也明显高于假手术组(P < 0.05)，但明显低于模型组(P < 0.05)。④结果表明：针刺治疗可以改善脑性瘫痪大鼠的神经功能，减少脑性瘫痪大鼠的神经细胞凋亡，对脑性瘫痪大鼠的神经细胞有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-9490-7636(介小素)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 针刺, 脑性瘫痪, 神经细胞, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Acupuncture has been shown to impact cerebral blood flow, relieve cerebral edema, improve microcirculation and reduce neural cell apoptosis in animals with cerebral palsy.
OBJECTIVE: To further verify the effect of acupuncture on neuronal apoptosis in cerebral palsy rats.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model group and the acupuncture group, with 15 rats in each group. In the model and acupuncture groups, rat models of cerebral palsy were established by ligating the left common carotid artery. In the sham surgery group, the left common carotid artery was not ligated. Rats in the acupuncture group received acupuncture from 2 days after model induction, once a day, for 20 consecutive days. Rats in the sham surgery and model groups were left intact. At 21 days after surgery, neurological functions, pathomorphological changes and neuronal apoptosis were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Motor function score was significantly lower in the model group than in the sham surgery group (P < 0.05). Motor function score was significantly higher in the acupuncture group than in the model group at 21 days (P < 0.05). (2) Hematoxylin-eosin staining: In the model group, cells were scattered. Inflammatory cell infiltration and cystis degeneration were found. The number of nerve cells was reduced. Degeneration, necrosis, gliosis and karyopyknosis were detected. Cavitation was visible in some cells. Cell bodies became small. The structure was not distinct or disappeared. In the sham surgery group, the morphology and structure of nerve cells were normal. In the acupuncture group, the changes in morphology and structure of nerve cells were found between the sham surgery and model groups. (3) The number of apoptotic cells was significantly greater in the model group than in the sham surgery group (P < 0.05). The number of apoptotic nerve cells was significantly higher in the acupuncture group than in the sham surgery group (P < 0.05), but significantly lower than in the model group (P < 0.05). (4) Results confirmed that acupuncture therapy can improve neurological function, reduce nerve cell apoptosis, and play a protective effect on nerve cells of rats with cerebral palsy.

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Key words: Acupuncture, Cerebral Palsy, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

介小素，侯玉晋. 针刺对脑性瘫痪模型大鼠神经细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4036-4042.

Jie Xiao-su, Hou Yu-jin. Effect of acupuncture on neural cell apoptosis of cerebral palsy rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 4036-4042.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程 造模动物流程表见图1。
2.2 模型更接近人类 新生鼠缺血缺氧后出现的神经病理特征与人类的表现类似。此类模型制作的方法之一是将动物置于极度缺氧环境中一定时间制成脑瘫模型。单纯结扎单侧颈总动脉后同侧大脑半球的血流量并不减少，然而在联合缺氧条件下该侧半球血流量明显减少并造成缺血性病理损害。此类模型制作方法相对简单，实验条件较容易控制重复性好，研究结果发现该模型动物脑室周围白质损伤与人类早产儿脑白质病理损伤相似^[3]。

2.3 各组大鼠运动功能评分情况比较 由表1可以看出：模型组大鼠第7天、第14天和第21天的运动功能评分均明显低于假手术组(P < 0.05)，表明大鼠脑瘫模型制作成功。针刺组大鼠第7天、第14天和第21天的运动功能评分也明显低于假手术组(P < 0.05)。假手术组的运动功能评分随着时间的延长没有明显变化，模型组和针刺组随着时间的延长运动功能评分有所增加，其中模型组增加不明显，针刺组第21天时运动功能评分增加比较明显，表明针刺治疗可以改善大鼠的运动功能评分，针刺组在第7天时的运动功能评分和模型组没有差别 (P > 0.05)，针刺组在第14天时的运动功能评分高于模型组，但两者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，针刺组在第21天时的运动功能评分明显高于模型组，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。表明针刺治疗可以改善脑瘫大鼠的运动功能评分。

2.4 各组大鼠大脑组织苏木精-伊红染色结果 结果显示模型组大鼠大脑组织细胞排列紊乱，局部有炎症细胞浸润，见囊性变，神经细胞数量减少，并有变性坏死，胶质细胞增生，细胞核固缩，部分神经细胞有空腔形成，胞体缩小，结构模糊或者消失；假手术组大鼠大脑组织细胞排列整齐，层次清楚，细胞形态和结构正常，细胞染色深，密度大；针刺组大鼠大脑组织细胞形态和结构比较清晰，细胞变性坏死减轻，偶见有细胞核固缩。见图2。

2.5 各组大鼠大脑组织神经细胞凋亡数目由表2可以看出在手术后第21天时，模型组的神经细胞凋亡数目明显高于假手术组(P < 0.05)；针刺组的神经细胞凋亡数目也明显高于假手术组(P < 0.05)；但针刺组的神经细胞凋亡数目明显低于模型组，两者比较差异有统计学意义(P < 0.05)。表明针刺治疗可以减少大鼠神经细胞的凋亡。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料 实验于2014年5至2015年6月在河南省中医院第二附属医院实验室完成。

实验动物：健康、清洁级、7 d龄雄性SD大鼠45只，体质量11-19 g，实验动物由河南实验动物中心提供。饲养相对湿度为60%-80%，温度在22-26 ℃，按照清洁级实验动物标准进行进食和饮水。实验大鼠符合卫生部一级动物标准，经动物伦理学委员会批准。

主要试剂：多聚甲醛(天津市化学试剂研究所)，95%乙醇(北京博奥森生物技术有限公司)，无水乙醇(北京博奥森生物技术有限公司)，PBS磷酸盐缓冲液粉末(武汉博士德生物工程有限公司)，凋亡试剂盒(瑞士Roche 公司)，抗体稀释液(武汉博士德生物工程有限公司)，苏木素(美国Novocastra)，BCIP/NBT显色液(福州迈新生物技术开发有限公司中国，梓檬酸盐缓冲液粉末(武汉博士德生物工程有限公司)，GVA水溶性封片胶(北京中杉金桥生物技术有限公司中国等。

主要设备和仪器：生物组织显微镜(日本OLYMPUS)，纯水仪(美国Millipore 公司)，移液器(大龙)，电热恒温箱(上海精宏公司)，眼科用手术剪(北京中兴名业科技发展有限公司)，幸福牌不锈钢压力锅18 cm (广州兴福金属制品有限公司)，石蜡包埋机(德国Leica 公司)，石蜡切片机(德国SLEE公司)，美的电磁炉(美的)，冰箱(海尔公司)，华佗牌针灸针(苏州医疗用品有限公司)等。

主要试剂配制：①PBS：1包PBS磷酸盐缓冲液粉+ 2 000 mL蒸馏水溶解，pH值调为7.2，保持备用。②TritonX100：将PBS稀释成0.1%稀释液。③标记混合物和转换液：凋亡试剂盒中自带。④体积分数75%乙醇：17份的无水乙醇和3份蒸馏水混合配制。⑤体积分数85%乙醇：17份的无水乙醇和5份蒸馏水混合配制。

1.2 造模方法 将45只大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、针刺组，每组15只大鼠。采用改良式的建模方法建立脑瘫大鼠动物模型^[1]。大鼠用乙醚吸入麻醉后，固定于手术台上，常规消毒，切开颈正中皮肤，分离出左侧颈总动脉并结扎，缝合切口后放回母鼠笼中恢复 2 h，然后放入封闭的缺氧箱内，向缺氧箱内通入低氧气体(氧气体积分数8%，氮气体积分数92%)，2.5 h将大鼠取出，保温2 h后测定大鼠的行为，左旋、不能翻身、平衡异常视为造模成功。假手术组按照上述手术手术操作，找到左颈总动脉后不结扎，直接缝合切口，不予低氧处理。

1.3 造模成功的检测标准 建模后2 h测定大鼠的行为，左旋、不能翻身、平衡异常视为造模成功。

1.4 处理方法 针刺组从手术后第2天开始进行针刺治疗，每天针刺1次，连续针刺20 d，假手术组和模型组不予任何处理，所有大鼠均与正常饮食饮食，自由活动。手术后第21天处死大鼠取材。

1.5 针刺处理 穴位选取参照《实验针灸学》^[2]，选择内关、涌泉、曲池、足三里、百会以及患侧颞I针进行针刺，针刺方法：先针刺涌泉穴和内关穴，然后针刺四肢穴位和头部穴位。

1.6 大鼠运动功能评估 各组大鼠在建模后第7天、第14天和第21天，根据BBB功能评分进行运动功能评估^[1]，实验环境安静、光线好，实验中对大鼠的步态、趾爪、足部持重、后肢运动、躯干运动及肢体运动协调等进行评分。

1.7 标本取材 大鼠造模成功后第21天，将大鼠固定到手术台上，麻醉后逐层开腹暴露心脏，向大鼠左心室内注射生理盐水至大鼠右心耳逐渐鼓起，剪开右心耳，待右心耳流出液体为无色透明时，用多聚甲醛固定，待大鼠颈部变硬后，剪开大鼠颅骨，取出大脑，清洗干净后，在多聚甲醛中固定，石蜡包埋脑组织，进行切片，切片后5 μm。

1.8 各组大鼠大脑组织苏木精-伊红染色 二甲苯脱蜡，乙醇洗脱二甲苯，自来水和蒸馏水浸洗，苏木精染色，自来水洗涤，盐酸分化，蒸馏水洗涤，稀氨水返蓝，蒸馏水洗涤，伊红染色，蒸馏水洗涤，乙醇脱水，中性树胶封固。镜下观察各组大鼠的脑组织病理学变化，镜下细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色。

1.9 各组大鼠脑皮质神经细胞凋亡的检测 将大鼠脑组织经体积分数4%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切成 5 μm厚切片，二甲苯脱蜡，乙醇洗涤二甲苯，蒸馏水和PBS洗涤，浸入TritonX100液中8 min，蒸馏水和PBS洗涤，加入标记混合物进行标记，其中一张切片加入稀释液做对照，滴加转换液，PBS洗涤，BCIP-NBT显色液显色，蒸馏水和PBS洗涤，GVA封片剂封固。镜下观察8个不同视野，计算8个视野内神经细胞凋亡数目，计算平均值，镜下凋亡细胞呈紫蓝色或者黑色，细胞体缩小，细胞核消失，细胞膜光滑。

1.10 主要观察指标 ①各组大鼠运动功能评分。②各组大鼠大脑组织苏木精-伊红染色结果。③各组大鼠大脑组织神经细胞凋亡数目。

1.11 统计学分析 所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用方差分析，多组计量资料均数比较采用随机区组方差分析。取P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

研究表明，设计幼鼠脑池内注射脂多糖，联合颈内动脉结扎和低氧环境制作脑瘫模型，结果明显加重缺血缺氧所致的幼鼠脑组织损伤；在孕鼠体内注射脂多糖致宫内感染联合出生后缺血缺氧的造模方法复制脑瘫模型，结果大鼠运动功能明显异常(包括自主性和强迫性运动)，并且造成双侧大脑半球的皮质、皮质下及其附近白质，豆状核、黑质损伤。此类模型相对其他类模型制作方法更为全面的体现脑瘫的多病因联合治病的特点，从病因学角度能更全面的反映脑瘫的病理生理过程^[3-4]。

针刺在脑瘫治疗中有广泛应用，脑瘫大鼠的运动功能评估方法包括斜坡实验^[5-6]，触觉刺激实验、悬吊实验Y迷宫实验以及水迷宫实验等^[7-8]。脑瘫大鼠的神经功能低下，针刺治疗可以明显增加脑瘫动物的神经功能，针刺治疗联合其他治疗方法也可以更好的改善脑瘫动物的神经功能^[9-10]。

针刺可以影响脑瘫动物的脑血流量，增加脑血流量，并且可以减轻大脑组织水肿^[11]。

研究表明针刺治疗可以改善脑瘫的大脑微循环。脑瘫动物经过缺血缺氧损伤后，有部分细胞发生变形坏死，出现细胞凋亡，经过针刺治疗脑瘫动物的神经病细胞的变形坏死以及细胞凋亡有减轻趋势^[12]，大脑组织形态也不断恢复^[13]，大脑质量增加，萎缩减轻^[14]。

针刺治疗可以提高APT酶的活性，减轻大脑的病理变化。大脑缺血缺氧后氧自由基的产生和清楚失衡，产生大量氧自由基，引起大脑组织损伤，针刺治疗后脑组织中的氧自由基下降，可以减少对脑组织的损伤^[15-16]。

脑缺血缺氧后，大脑组织发生细胞凋亡，损伤神经细胞，参与神经细胞凋亡的有Bcl-2家族以及Caspase家族，Bcl-2家族包括促进细胞凋亡成员、抑制细胞凋亡成员以及死亡蛋白，其中促进细胞凋亡成员和抑制细胞凋亡成员的比例失衡是影响神经细胞凋亡的主要因素，脑瘫时促进细胞凋亡成员增加，抑制细胞凋亡成员减少^[17]，针刺可以提高抑制细胞凋亡成员的表达，同时降低促进细胞凋亡成员的表达，可以有效减少脑瘫神经细胞的凋亡。另外针刺可以影响突触结构^[18]、影响神经递质的含量^[19-20]、影响神经营养因子的表达等^[21]。总之针刺可以从细胞凋亡、自由基代谢、病理形态学改变等多个环节治疗脑瘫。

细胞凋亡是一个复杂的生理生化过程，在疾病的发生发展过程中起着重要作用，机体细胞凋亡受多种因素调控^[22]，过多或者过少的细胞凋亡对人体都是有害的，如何控制或者加速细胞凋亡是治疗疾病的新的方法^[23]。

细胞凋亡的检测技术有ELISA法、形态学检测法、线粒体膜电位检测法、电泳法、流式细胞术检测法、电化学法等多种方法，其中比较常用的有：①形态学检测法：形态学检测法是检测细胞凋亡的金标准，主要在光学显微镜、电镜以及原位末端缺口标记法(TUNEL)下观察细胞形态，光学显微镜借助细胞染色进行观察，电镜可以看到细胞结构的变化，是最经典的方法，是判断细胞凋亡的金标准^[24]，电镜可以却分细胞凋亡和坏死^[25]，细胞凋亡表现为核裂解、浓缩，染色体凝聚、胞浆收缩，可以见到凋亡小体。光镜和电镜只能定性，不能够进行定量。TUNEL将分子生物学与免疫组化相结合检测细胞凋亡，可以对细胞凋亡进行定量检测。②流式细胞仪检测法：流式细胞仪检测法能够区分凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和坏死细胞，除了可以对凋亡细胞定性，还可以对凋亡细胞定量，并且操作简单，但该方法使用仪器昂贵，实验比较麻烦，需要获得细胞悬液才能检测^[26]。

细胞凋亡检测技术在针刺治疗中有广泛应用，在针刺治疗神经系统疾病中，用TUNEL法检测脑缺血再灌注大鼠模型中神经元的凋亡，发现针刺可以减少神经元凋亡，对神经元有保护作用^[27-28]，TUNEL法检测大脑中动脉梗死模型中神经元的凋亡情况，发现针灸可以减少海马区细胞凋亡，改善大鼠的学习记忆能力^[29]，在大脑中动脉栓塞大鼠模型中，针刺督脉可以减少神经细胞凋亡，改善大脑缺血缺氧损伤^[30]，TUNEL法检测脑挫伤大鼠模型发现针刺能够减少大脑神经细胞凋亡，减少大脑坏死面积^[31]。

吴至凤等^[32]发现针刺可以减少宫内窘迫脑损伤大鼠的伸进细胞凋亡。

刘振寰等^[33]发现针刺可以减少脑瘫大鼠模型海马区和做大脑额叶皮质的神经细胞凋亡数量，增强神经生长因子表达，保护脑瘫大鼠的脑组织。

杨俊等^[34]发现针刺可以减少癫痫大鼠模型的海马区神经元的凋亡。

刘忠锦等^[35]和朱晶等^[36]发现电针能够改善阿尔茨海默病大鼠的神经功能，可能和抑制细胞凋亡有关。

陆征宇等^[37]发现针刺可以减少帕金森病小鼠模型的纹状体神经元细胞凋亡，改善帕金森病的症状，针刺还可以抑制帕金森大鼠旋转模型黑质神经细胞凋亡^[38-39]、抑制海洛因成瘾大鼠模型的脑海马神经细胞和VTA神经细胞的凋亡，保护神经组织的损伤^[40-43]。在细胞凋亡的多种检测方法中，对针刺作用的研究中TUNEL检测法应用的最多。

研究通过建立脑瘫大鼠动物模型，对其进行针刺治疗，观察大鼠治疗后的神经功能变化，并对脑瘫大鼠的大脑组织进行苏木精-伊红染色，观察脑瘫大鼠的大脑组织病理形态学改变，以及神经细胞的凋亡情况，结果发现：模型组大鼠各时间段的运动功能评分均明显低于假手术组(P < 0.05)，表明大鼠脑瘫模型制作成功。针刺组大鼠各时间段的运动功能评分也明显低于假手术组(P < 0.05)。假手术组的运动功能评分随着时间的延长没有明显变化，模型组和针刺组随着时间的延长运动功能评分有所增加，其中模型组增加不明显，针刺组第21天时运动功能评分增加比较明显，表明针刺治疗可以改善大鼠的运动功能评分，针刺组在第7天和第14天时的运动功能评分和模型组没有差别(P > 0.05)，针刺组在第21天时的运动功能评分明显高于模型组(P < 0.05)。表明针刺治疗可以改善脑瘫大鼠的运动功能评分。模型组大鼠大脑苏木精-伊红染色结果显示细胞排列紊乱，局部有炎症细胞浸润，见囊性变，神经细胞数量减少，并有变性坏死，胶质细胞增生，细胞核固缩，部分神经细胞有空腔形成，胞体缩小，结构模糊或者消失；假手术组大鼠大脑苏木精-伊红染色结果显示细胞的形态和结构均未见异常；针刺组大鼠大脑苏木精-伊红染色结果显示细胞形态和结构变化介于假手术组和模型组之间。在神经细胞凋亡方面，模型组的神经细胞凋亡数目明显高于假手术组(P < 0.05)；针刺组的神经细胞凋亡数目也明显高于假手术组(P < 0.05)；但针刺组的神经细胞凋亡数目明显低于模型组，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

由此可见，针刺治疗可以改善脑瘫大鼠的神经功能，减少脑瘫大鼠的神经细胞凋亡，对脑瘫大鼠的神经细胞有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程