脑白质损伤模型中Lingo-1的动态变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.013

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (27): 4043-4048.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.013

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脑白质损伤模型中Lingo-1的动态变化

索磊¹，杨印祥²，汤文燕²，栾佐¹

1南方医科大学第三临床医学院，广东省广州市 510515
2解放军海军总医院儿科，北京市　100048

修回日期:2016-04-08 出版日期:2016-06-30 发布日期:2016-06-30
通讯作者: 栾佐，硕士，主任医师，博士生导师，南方医科大学第三临床医学院，广东省广州市 510515
作者简介:索磊，男，1989年生，陕西省西安市人，汉族，南方医科大学在读硕士，医师，主要从事儿童神经系统疾病以及干细胞移植方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81471486)

Dynamic expression of Lingo-1 in a model of white matter injury

Suo Lei¹, Yang Yin-xiang², Tang Wen-yan², Luan Zuo¹

1Third Clinical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
2Department of Pediatrics, Navy General Hospital of People’s Liberation Army, Beijing 100048, China

Revised:2016-04-08 Online:2016-06-30 Published:2016-06-30
Contact: Luan Zuo, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Third Clinical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Suo Lei, Studying for master’s degree, Physician, Third Clinical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81471486

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脑白质损伤：近年来随着新生儿重症监护病房的建立和发展，早产儿的存活率显著提高，早产儿是脑白质损伤的高危人群。由于胎儿成熟度、感染、缺氧缺血、营养等危险因素所致的早产儿出现脑室周围及皮质下白质出现广泛损伤，最终导致神经系统后遗症，如脑瘫、认知障碍、视听功能异常、癫痫等。遗憾的是，目前国际上对于脑白质损伤没有任何有效的治疗方法。
Lingo-1蛋白：是一个614个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于富含亮氨酸重复片段结构域蛋白家族一员，其家族成员还有Lingo-2、Lingo-3以及Lingo-4等。研究证实Lingo-1是一种特异性表达于中枢神经系统的神经元和少突胶质细胞中的重要功能蛋白，尚未在星形胶质细胞中发现Lingo-1蛋白的存在。早期研究发现Lingo-1可以抑制轴突生长，近年来研究表明Lingo-1在神经元轴突的髓鞘化过程中也发挥了重要的负调控作用。

摘要
背景：Lingo-1在少突胶质细胞分化和髓鞘形成过程中发挥了重要的负调控作用，其与脑白质损伤可能密切相关，但目前关于脑白质损伤后Lingo-1动态变化的研究，国内尚未见系统报道。
目的：观察Lingo-1在脑白质损伤模型不同时间窗的动态表达变化情况。
方法：将78只3 d龄SD大鼠随机等分为假手术组和模型组，模型组采用单侧结扎右颈总动脉联合缺氧方法建立脑白质损伤模型，假手术组仅分离右颈总动脉，不作结扎缺氧处理。
结果与结论：造模7 d后苏木精-伊红染色以及免疫荧光髓鞘碱性蛋白染色证实模型大鼠白质损伤区呈现选择性白质损伤，提示造模成功。荧光定量qPCR及Western blot结果显示，造模1 d后Lingo-1 mRNA及蛋白表达水平即开始明显增高，7 d时达到峰值，此后逐渐降低，至28 d时已基本接近假手术组水平。提示Lingo-1蛋白与脑白质损伤髓鞘损伤密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0003-2703-9741(栾佐)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 脑白质损伤, 脑损伤, Lingo-1, 新生鼠, 髓鞘碱性蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Lingo-1 has been identified as a negative regulator of oligodendrocyte differentiation and myelination, which may be closely related to the white matter damage, but there is no systematic report on the dynamic changes of Lingo-1 after white matter damage.
OBJECTIVE: To explore the dynamic expression of Lingo-1 at different time points after white matter injury in newborn rats.
METHODS: Seventy-eight Sprague-Dawley rats aged 3 days old were equally and randomly divided into sham operation group and model group. In the model group, models of white matter injury were established by unilateral ligation of the right common carotid artery combined with hypoxia. In the sham operation group, the right common carotid artery was isolated only, without ligation or hypoxia.
RESULTS AND CONCLUSION: At 7 days after model induction, hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining for myelin basic protein showed that a selective white matter injury was seen at the injury site of a rat model, suggesting successful model establishment. Fluorescent quantitative PCR and western blot assay results demonstrated that the expression levels of Lingo-1 mRNA and protein were significantly up-regulated at 1 day and reached a peak at 7 days post-surgery. After 7 days, above expression was gradually decreased and the up-regulation of Lingo-1 protein lasted to the 28 days post-surgery compared to the sham operation group. These results show that Lingo-1 protein was closely related to the brain white matter injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Myelin Sheath, Anoxia, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

索磊，杨印祥，汤文燕，栾佐. 脑白质损伤模型中Lingo-1的动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4043-4048.

Suo Lei, Yang Yin-xiang, Tang Wen-yan, Luan Zuo . Dynamic expression of Lingo-1 in a model of white matter injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 4043-4048.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年在解放军海军总医院动物实验中心及儿科实验室完成。

1.3 材料 清洁级SD大鼠78只，雌雄不限，鼠龄3 d，体质量约9 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2012-0001。动物维持12 h明暗交替环境饲养。动物实验经海运总医院伦理学委员会批准，实验符合动物伦理学要求。

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组 78只SD大鼠随机等分为2组：假手术组和模型组。

1.4.2 脑白质损伤模型的制备 模型组SD大鼠无菌环境下戊巴比妥钠麻醉后，四肢仰卧位固定于手术台，医用碘伏消毒颈部皮肤，行颈部正中切口，逐层分离右侧皮下组织，找到与颈内静脉及迷走神经相伴行的颈总动脉并游离，用电凝笔切断血管永久性结扎右侧颈总动脉，分层缝合皮肤切口。假手术组仅游离出右颈总动脉，不做结扎处理；2组大鼠术后均置37 ℃恒温水浴箱内，待幼鼠麻醉复苏后，置于体积分数6%氧气、94%氮气的37 ℃恒温缺氧箱中缺氧70 min后返回母鼠笼中继续喂养^[6-7]。

1.4.3 苏木精-伊红染色和免疫组化荧光染色 造模 7 d后，模型组和假手术组大鼠分别随机取3只幼鼠，行戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经左心室缓慢注射4 ℃灭菌生理盐水，10 min，再用 40 g/L多聚甲醛(约200 mL)灌注固定，20 min；断颅取脑后，脑组织立即保存于40 g/L多聚甲醛固定24 h后，经10%、20%、30%蔗糖梯度脱水(每次间隔约24 h至组织块沉底后换液)。制备冠状冰冻切片，片厚10 μm，每间隔5张取1张。

通过苏木精-伊红染色和免疫组化荧光染色检验脑白质损伤模型是否制作成功：模型组和假手术组动物分别取相同层面切片，进行苏木精-伊红染色后光镜下观察大脑皮质下组织的病理形态学变化，比较各组形态学改变程度；免疫荧光染色检测动物模型大脑皮质下白质损伤区髓鞘碱性蛋白表达情况。

1.4.4 荧光定量qPCR分析 造模后根据实验设计时间窗，每组各取6只大鼠，麻醉处死取脑，组织块匀浆后转入无菌、无RNA酶PCR管中，加入适量Trizol反应5 min后置于-80 ℃冰箱备用；RNA反转录得到cDNA，SYBRGreenⅠ法进行荧光定量qPCR。

引物序列：Lingo-1上游引物：5’-CAA CCT GGA GAC GCT CAT T-3’(156 bp)；下游引物5’-GGG AAG TTC TTG AAC TCC TTG-3’；内参β-actin上游引物：5’-GCC AAC ACA GTG CTG TCT-3’；下游引物：5’-AGG AGC AAT GAT CTT GAT CTT-3’。实验引物由北京信诺金达公司合成。

PCR反应条件：95 ℃、15 s，55 ℃、15 s，72 ℃、45 s，共35个循环。72 ℃、10 min后放置4 ℃保存备用；扩增产物上样电泳，凝胶成像系统对条带进行扫描分析。采用相对基因表达量比较Ct方法分析数据，实验重复3次。

1.4.5 Western blot分析 造模后1，3，7，14，21，28 d，每组各取3只幼鼠，行戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在冰盒里将幼鼠端头迅速取脑，将右侧大脑半球中央部皮质下白质(脑室周围白质，取材约0.2 g)取下置于预冷生理盐水中冲洗，滤纸吸干表面液体称质量后置于匀浆器内研磨，加入适量裂解液充分裂解组织后提取总蛋白并进行蛋白定量。定量蛋白样品采用10%SDS-PAGE电泳，100 V电压转膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加Anti-Lingo-1一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h后，对应二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，ECL发光显影，定影。

运用Image J软件分析目的条带灰度值(β-actin标准内参对照)作为Lingo-1相对表达水平。实验重复3次。

1.5 主要观察指标 幼鼠大脑皮质下组织的病理形态学变化；白质损伤区髓鞘碱性蛋白表达及不同时间点Lingo-1的表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计软件对实验数据进行统计分析。计量资料采用x(_)±s表示，采用重复测量方差分析进行统计学分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脑白质损伤是导致早产儿认知缺陷和脑性瘫痪等神经发育障碍的主要原因，目前尚无有效治疗方法。脑白质损伤患者的发病机制主要是由于脑血流的改变和脑组织代谢的改变，造成内源性成髓鞘细胞前体细胞大量丢失而出现轴突髓鞘化障碍；神经系统的自我修复一直以来都是世界难题，研究发现中枢神经生长微环境是影响神经元、轴突再生的一个关键因素^[8]；近年来从改善神经再生微环境入手，寻找促进轴突再生的有效靶点成为神经修复研究的新方向^[9]。研究者现已发现多种神经再生抑制因子在神经再生过程中发挥着重要的作用^[10]，而Lingo-1就是其中的典型代表之一，Lingo-1是一个由LRRN6A基因表达的614个氨基酸组成的跨膜蛋白^[11]，特异性表达于中枢神经系统的神经元和少突胶质细胞，但不存在于星形胶质细胞中^[12]；研究发现Lingo-1在神经元轴突的髓鞘化过程中发挥了重要的调控作用，是成髓鞘细胞分化和髓鞘化的一个关键的负调节因素^[13]。研究证实脊髓损伤模型中Lingo-1的mRNA和蛋白水平都较未损伤组有明显提高^[14-22]；而国内关于脑白质损伤疾病中的Lingo-1变化的系统研究甚少。因此，探究Lingo-1在脑白质损伤中的动态表达变化，以选择合适的时间窗来拮抗Lingo-1的表达，对于Lingo-1的拮抗性研究和脑白质损伤的修复治疗研究均具有重要的指导意义。

实验选择3 d龄SD大鼠，采用结扎单侧右颈总动脉联合缺氧的方法，通过苏木精-伊红染色和髓鞘碱性蛋白免疫荧光染色鉴定模型，建立了能够精准模拟临床患儿的脑白质损伤动物模型，并从不同时间窗系统化地观察了大脑皮质下白质区域Lingo-1mRNA和蛋白的动态表达变化。造模7 d后苏木精-伊红染色结果：缺血缺氧70 min后幼鼠损伤侧选择性白质损伤，而海马发生轻微损伤，染色结果与人类脑白质损伤病理学特征类似；脑白质损伤患儿脑内少突胶质前体细胞受损，致使脑白质髓鞘化延迟或被破坏，而髓鞘碱性蛋白作为少突胶质细胞的重要标志物，其不同部位的含量变化可以反映白质损伤的范围和程度^[23-24]；免疫组化髓鞘碱性蛋白染色结果显示损伤侧皮质下髓鞘碱性蛋白明显丢失，两者结合证实作者通过单侧结扎联合缺氧的方式成功建立了脑白质损伤模型。造模后不同时间窗qPCR结果显示，模型组动物造模1 d后Lingo-1 mRNA表达即开始明显增高，7 d时表达量达峰值，此后开始呈下降趋势，21 d时表达量较高峰期以大幅下降，且差异有显著性意义，至28 d时模型组表达已基本接近假手术组。Western blot结果同样证实术后7 d时Lingo-1蛋白表达上调至高峰，其表达变化趋势与mRNA基本相同。造模后7 d损伤侧白质已出现明显损伤，免疫荧光染色提示少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白也相应减少，与Lingo-1蛋白高峰表达相对应，这些实验结果提示Lingo-1蛋白与脑白质损伤髓鞘损伤密切相关。

综上所述，实验探究了脑白质损伤模型中Lingo-1蛋白的动态变化过程，Lingo-1蛋白作为细胞髓鞘化的一个重要负调节因素，实验结果也提示其表达升高可能与脑白质损伤损伤病理改变密不可分。掌握Lingo-1蛋白的动态变化以及与脑白质损伤的关系，对于轴突损伤，髓鞘化机制的探索都有着重要的意义，为探究Lingo-1在神经再生中的治疗作用奠定了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Dynamic expression of Lingo-1 in a model of white matter injury

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