丰富环境对血管性痴呆模型大鼠梨状皮质未成熟神经元表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (27): 4006-4012.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.008

• 脑及脊髓损伤动物模型 Animal models of brain and spinal cord injuries • 上一篇下一篇

丰富环境对血管性痴呆模型大鼠梨状皮质未成熟神经元表达的影响

黄俊¹，吴帆帆²，贺旭^2，3，李建平⁴，严小新³，潘爱华³，李志远³

1邵阳医学高等专科学校解剖教研室，湖南省邵阳市 422000
2益阳医学高等专科学校解剖教研室，湖南省益阳市 413000
3中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物学系，湖南省长沙市 410013
4遵义医学院人体解剖学系，贵州省遵义市 563000

修回日期:2016-04-12 出版日期:2016-06-30 发布日期:2016-06-30
通讯作者: 贺旭，博士，讲师，益阳医学高等专科学校解剖教研室，湖南省益阳市 413000；中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物学系，湖南省长沙市 410013
作者简介:黄俊，男，1982年生，湖南省邵阳市人，汉族，2006年南华大学毕业，硕士，讲师，主要从事中枢神经系统疾病的基础研究。
基金资助:
湖南省教育厅课题(13C958)；2015年湖南省大学生研究性学习和创新性试验计划项目

Effects of enriched environment on immature neurons in piriform cortex of a rat model of vascular dementia

Huang Jun¹, Wu Fan-fan², He Xu^{2, 3}, Li Jian-ping⁴, Yan Xiao-xin³, Pan Ai-hua³, Li Zhi-yuan³

1Department of Human Anatomy, Shaoyang Medical College, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
2Department of Human Anatomy, Yiyang Medical College, Yiyang 413000, Hunan Province, China
3Department of Human Anatomy and Neurobiology, XiangYa School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
4Department of Human Anatomy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Revised:2016-04-12 Online:2016-06-30 Published:2016-06-30
Contact: He Xu, M.D., Lecturer, Department of Human Anatomy, Yiyang Medical College, Yiyang 413000, Hunan Province, China; Department of Human Anatomy and Neurobiology, XiangYa School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Huang Jun, Master, Lecturer, Department of Human Anatomy, Shaoyang Medical College, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
Supported by:
the Project of Hunan Provincial Department of Education, No. 13C958; the Students’ Research Learning and Innovative Pilot Project of Hunan Province in 2015.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管性痴呆：是由缺血性脑卒中或出血性脑卒中等脑血管疾病引起的学习记忆和空间定位能力下降的一种认识功能障碍综合征。血管性痴呆是一种渐进式的慢性疾病，其发病机制多样且相互联系，其中包括大脑神经元数目的减少。
丰富环境：是相对标准环境而言。通过增大动物的饲养空间，和(或)添置新奇的物品，从而增加感官、触觉及其他感觉的刺激和动物之间的社会交往。丰富环境可加速大脑的神经发生而改善学习记忆能力。

摘要
背景：研究表明丰富环境可改善血管性痴呆大鼠的认识功能障碍，但是目前国内外关于其作用机制的报道较少。
目的：从行为学水平观察丰富环境对血管性痴呆大鼠认知功能的影响，并探讨其作用机制。
方法：采用永久性结扎两侧颈总动脉方法建立血管性痴呆模型，将痴呆大鼠分成血管性痴呆组(n=8)和丰富环境组(n=12)。血管性痴呆组置于常规饲养环境里饲养30 d，丰富环境组进行丰富环境刺激30 d。运用Morris水迷宫检测两组大鼠的认知功能，免疫组织化学和免疫印迹技术检测两组大鼠梨状皮质微管相关蛋白(DCX，未成熟神经元的标记物)阳性细胞数目和蛋白水平，免疫荧光观察微管相关蛋白与NeuN(神经元特异性核抗原)共表达细胞的数目。
结果与结论：①血管性痴呆组逃避潜伏期显著长于丰富环境组(P < 0.05)，跨越平台次数少于丰富环境组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②血管性痴呆组梨状皮质微管相关蛋白阳性细胞数目和微管相关蛋白水平与丰富环境组相比，均显著下降(P < 0.05)；③血管性痴呆组梨状皮质微管相关蛋白与NeuN的共表达细胞显著低于丰富环境组(P < 0.05)；④结果提示，丰富环境可能通过促进梨状皮质未成熟神经元的表达及分化而改善血管性痴呆大鼠的认知功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-8497-9775(贺旭)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 丰富环境, 血管性痴呆, 大鼠, 认知, 梨状皮质, 未成熟神经元

Abstract:

BACKGROUND: Researches showed that the enriched environment could improve the cognitive dysfunction of rats with vascular dementia. However, there are few reports regarding its mechanism of action.
OBJECTIVE: To explore the effect of enriched environment on the cognitive dysfunction of rats with vascular dementia from the behavioral level.
METHODS: Vascular dementia models were made by permanent ligation of bilateral common carotid arteries and were divided into vascular dementia group (n=8) and enriched environment group (n=12). Vascular dementia group was taken care under conventional breeding environment for 30 days, while the enriched environment group was subjected to the enriched environment for 30 days. Morris water maze test was adapted to test the cognitive function of rats between two groups. Immunohistochemistry and immunoblotting were applied to observe the number of DCX⁺ cells and DCX protein level in both groups. The number of DCX^-labeled cells co-expressing NeuN was observed using immunofluorescence technique.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The escape latency in the vascular dementia group was longer than that in the enriched environment group (P < 0.05). The times across the platform was less in the vascular dementia group than that in the enriched environment group (P < 0.05). (2) In comparison with the enriched environment group, the number of DCX-positive cells and its protein level in the piriform cortex were significantly decreased in the vascular dementia group (P < 0.05). (3) The number of DCX/NeuN co-labeled cells in the piriform cortex was significantly less in the vascular dementia group than in the enriched environment group (P < 0.05). (4) These findings suggested that enriched environment could improve the cognitive dysfunction of rats with vascular dementia through promoting the expression and differentiation of the immature neurons.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Models, Animal, Dementia, Vascular, Environmental Medicine, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄俊，吴帆帆，贺旭，李建平，严小新，潘爱华，李志远3. 丰富环境对血管性痴呆模型大鼠梨状皮质未成熟神经元表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4006-4012.

Huang Jun, Wu Fan-fan, He Xu, Li Jian-ping, Yan Xiao-xin, Pan Ai-hua, Li Zhi-yuan. Effects of enriched environment on immature neurons in piriform cortex of a rat model of vascular dementia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 4006-4012.

图/表（结果） 1

2.1 造模成功动物数量 共造模26只大鼠，由于术后感染及其他不明原因，死亡6只，最后进入结果分析的大鼠为20只。

2.2 材料、方法的改进 考虑到同时结扎两侧颈总动脉动物的存活率低^[9]，借鉴黄文革等^[10]报道，作者先结扎一侧颈总动脉，1周后再结扎另外一侧。

2.3 模型稳定性 血管性痴呆主要由缺血性脑血管疾病引起，采用二血管法制作痴呆模型后引起学习记忆功能逐步下降，能较好模拟由缺血性脑卒中而引起的血管性痴呆。

2.4 丰富环境减少血管痴呆大鼠的逃避潜伏期，增加其跨越平台的次数 Morris水迷宫行为学实验结果显示，血管性痴呆组大鼠第2，3，4，5天的逃避潜伏期分别为(84.4±4.1)，(73.6±6.7)，(65.0±4.5)，(58.6± 6.5) s；丰富环境组依次为(74.6±3.8)，(61.6±4.9)，(49.2±5.1)，(35.8±4.0) s。两组逃避潜伏期在同一时间点比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1A。

空间探索实验结果表明血管性痴呆大鼠的游泳轨迹混乱，路线较长，而丰富环境组游泳轨迹相对简单和路程较短，见图1C，D。

血管性痴呆组跨越平台次数与丰富环境组相比(4.2±0.9 vs. 5.8±1.1)，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1B。

2.5 丰富环境增加血管性痴呆大鼠梨状皮质DCX⁺细胞数目及其蛋白含量 两组大鼠DCX⁺细胞的胞体明显，发出许多突起，突起相互交织且伸向梨状皮质第Ⅰ层，见图2A(a，b)。血管性痴呆组梨状皮质DCX⁺细胞数目为(31.0±3.8)个，给予丰富环境干预后，梨状皮质 DCX⁺细胞数目显著增加，为(39.8±4.8)个，两组细胞数目相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2B。

免疫印迹实验结果显示：与血管性痴呆组相比，丰富环境组DCX蛋白条带相对较粗，见图3A。丰富环境组与血管性痴呆组梨状皮质DCX蛋白含量分别为0.51± 0.01，0.32±0.02，两组大鼠梨状皮质DCX蛋白水平差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3B。

2.6 丰富环境增加血管性痴呆大鼠梨状皮质DCX与NeuN共表达细胞 实验结果显示丰富环境增加了血管性痴呆大鼠梨状皮质DCX⁺细胞数目，因此作者想探讨丰富环境是否能增加血管性痴呆大鼠梨状皮质 DCX⁺细胞转化成NeuN⁺细胞。结果显示DCX与NeuN的共表达细胞在梨状皮质有少量分布，且主要是DCX⁺细胞的胞浆存在共表达，见图4A。

血管性痴呆组大鼠梨状皮质DCX/NeuN细胞为(5.5±1.1)个，丰富环境组为(8.8±1.5)个，两组大鼠梨状皮质DCX与NeuN的共表达细胞差异有显著性意义(P < 0.01)，图4B。

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引言

材料方法

1.1 材料

1.1.1 造模动物 出生2个月的雄性SD大鼠26只，SPF级，体质量为(260±15) g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。动物房室温保持在(23±1) ℃，相对湿度55%，通风条件好，饲养于光照/黑暗为12 h/12 h的环境，自由饮水，给予标准饮食。

1.1.2 实验主要试剂和仪器 Double-cortin(微管相关蛋白)(美国Santa Cruz公司)；NeuN(神经元特异性核抗原)(美国Chemicon公司)；ABC Kit(抗生物素蛋白-生物素复合物)(美国Vector公司)；二氨基联苯胺(美国Sigma公司)；偶联HRP标记兔抗羊二抗(Bio-Rad公司)；Olympus BX67荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，珊顿冰冻切片机(英国Shan Don公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 血管性痴呆模型的建立 采用双侧颈总动脉永久性结扎建立血管性痴呆大鼠模型。所有大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，仰卧固定在Kopf脑立体定位仪上。消毒后从颈部一侧做手术切口，分离颈总动脉和迷走神经，然后用7号手术线永久性结扎，1周后，从颈部另一侧做一切口，分离该侧颈总动脉和迷走神经，永久性结扎。模型制作过程中尽量减少大鼠的疼痛和动物的使用数量。造模成功痴呆大鼠的行为表现：血管结扎后呼吸缓慢而深，体温下降，瞳孔放大，翻正反射消失。大鼠苏醒后表现为毛色差，反应迟缓，自主活动差，有少数大鼠出现转圈现象。

1.2.2 实验设计 造模成功20只大鼠随机分成2组：血管性痴呆组和血管性痴呆+丰富环境组。

血管性痴呆组大鼠共8只，每笼4只，置于常规饲养环境里饲养30 d。

血管性痴呆+丰富环境组大鼠共12只，每天放入长、宽、高均为1.5 m的木质旷场进行丰富环境刺激8 h (8：30-16：30)，连续接受丰富环境干预30 d。木质旷场内提供标准鼠粮以及水，放置五颜六色的管道、小桶、滑轮、塑料房子以及乒乓球等，矿场内的玩具每天更换同时用体积分数为75%乙醇擦洗，每天更换大鼠垫料和擦洗旷场内壁和地板，保持清洁。

比较两组大鼠梨状皮质DCX⁺细胞、DCX/NeuN细胞的数目及DCX蛋白水平，同时运用Morris水迷宫检测两组大鼠的认知功能。

1.2.3 行为学评估 两组大鼠在干预后30 d进行Morris水迷宫检测学习记忆能力。Morris 水迷宫实验系统(上海吉量软件科技有限公司)由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和处理分析系统组成。

水迷宫游泳能力筛选和适应训练：正式实验开展前1 d，撤掉平台，选择水池壁某一固定入水点放入大鼠，让其自由游泳2 min以适应实验环境，与此同时对大鼠的游泳能力进行初步的评估，剔除游泳能力明显异常的大鼠。

定位航行实验检测大鼠在水迷宫中学习记忆的获取能力：每天固定时间从4个不同象限入水，对大鼠训练4次，连续训练5 d。每次检测时间为120 s，记录大鼠寻找并爬上圆形柱状平台所需时间即逃避潜伏期(EL)，以逃避潜伏期作为大鼠的学习和记忆成绩。如果在120 s内寻找平台失败，则由实验操作者将大鼠引上平台休息30 s。大鼠在规定时间找到圆形柱状平台后，在上面停留30 s后再继续下一个回合训练。计算每天各组大鼠4次逃避潜伏期，然后取均值。

空间探索实验检测大鼠学习记忆的保持能力：在定位航行实验结束后既第6天撤除平台，将大鼠分次从西北象限池壁弧形中点面向水迷宫池壁放入水中，记录大鼠在120 s内的游泳轨迹及穿越平台位置的次数。

1.2.4 脑组织标本的制备 干预30 d后，每组取4只大鼠，过量腹腔注射体积分数为10%的水合氯醛，麻醉成功后，用无菌生理盐水快速灌注，然后应用多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注；当大鼠四肢僵直后，停止灌注；取出脑组织，用多聚甲醛后固定过夜；梯度沉糖以防止冰晶出现；包埋。采用邻切法，首先切1套12张30 μm切片放入12孔组织培养板，然后切1套12张6 μm切片，接着弃取12×30 μm组织，然后再收集下一轮脑片。每套片子的间隔距离大约为800 μm(12×30×2+12×6)，依次类推，每个脑组织共收集6套30 μm和6套6 μm梨状皮质切片。

1.2.5 免疫组织化学染色 采用ABC(Avidin-biotin- complex)法对厚度为30 μm的脑片进行免疫组织化学染色。0.01 mol/L PBS(pH=7.3)漂洗，10 min×3次；体积分数为3%H₂O₂处理30 min以消除内源性过氧化物酶，漂洗，10 min×3次；体积分数为5%马血清+0.1% tritonX-100孵育2 h；加入一抗Doublecortin(DCX；Santa Cruz；sc-8066；1︰1 000) 4 ℃孵育过夜；漂洗，10 min×3次；加入生物素化马抗山羊IgG(1︰400，Vector Company，USA)室温孵育2 h；抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC Kit)(1︰400，Vector Company，USA)：A液与B液提前30 min混匀，室温孵育2 h；DAB显色免疫反应产物；乙醇脱水、二甲苯脱脂、中性树脂封固。

1.2.6 免疫荧光组织化学染色 选取6 μm脑片进行免疫双重荧光染色，0.01 mol/L PBS洗涤，10 min×3次；体积分数为5%驴血清+0.1% tritonX-100磷酸盐缓冲液室温下孵育2 h，抑制非特异性抗体结合；加入山羊抗DCX (1︰1 000)和小鼠抗抗NeuN (1︰2 000) 4 ℃冰箱下过夜；复温30 min，0.01 mol/L PBS-T溶液漂洗，10 min× 3次；Alexa Fluor 488与Alexa Fluor 594偶联驴抗小鼠和驴抗山羊IgG(1︰200；Invitrogen，Carlsbad，CA)室温下孵育2 h；0.01 mol/L PBS-T溶液漂洗，10 min×3次；Bisbenzimide(双苯酰亚胺，Hoechst33342，1︰5 000；Sigma-Aldrich)染核10 min；0.01 mol/L PBS溶液漂洗，10 min×3次，贴片；50%甘油封固，荧光显微镜下观察。

1.2.7 免疫印迹(Western blot)检测DCX蛋白水平 干预后30 d，每组取4只大鼠，给予SD大鼠腹腔注射过量10%水合氯醛，冰上迅速将鼠脑的梨状皮质取出；根据组织/蛋白提取剂=1 g/10 mL的比例稀释，用电动匀浆器(PRO200，Pro-scientific公司)进行组织碎解；4 ℃低温离心，12 000 r/min离心20 min，收集上清液，测定蛋白浓度。用SDS-PAGE凝胶电泳，泳道上样20 μg。电泳分离蛋白转移至PVDF膜上(Bio-Rad公司)，转膜DCX约1 h。将含有目的蛋白(DCX)的相应一抗孵育，4 ℃过夜；1×TBST溶液漂洗，15 min×3次；与偶联HRP标记的兔抗山羊IgG(1︰5 000，Bio-Rad公司)室温下作用 2 h；1×TBST漂洗，15 min×3次；ECL化学发光法显影，以GAPDH作为内参，采用Image J对DCX进行条带平均吸光度分析。

1.2.8 图像处理 所有切片均在奥林巴斯(BX60)显微镜下完成，拍照时同一倍数下组织的曝光度和象素保持一致。免疫组织化学和免疫荧光片子在目镜×20下拍照，每套组化片子取相同的部位进行细胞计数，取均值。使用NIH Image J分析Western blot条带，最终数据是指DCX的平均吸光度与内参GAPDH的平均吸光度比值。

1.3 主要观察指标 ①两组大鼠学习记忆和空间定位等认知功能的改变；②两组大鼠梨状皮质 DCX⁺细胞的表达差异和DCX蛋白水平变化；③两组大鼠梨状皮质DCX与NeuN共表达细胞数目。

1.4 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，通过成对学生t 检验比较组间差异。实验结果采用Prism GraphPad 5.0统计软件进行统计分析和处理。以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

二血管阻断法是制作血管性痴呆模型的可靠方法^[11]，大鼠是最适合该模型的动物^[12]，许多研究通常采用将大鼠两侧颈总动脉永久性结扎，这种模型制作方法的一大缺点是大鼠生存率低，生存时间短^[13]。为此需要对这种模型制作方法进行改进，在不同时间点分别结扎两侧颈总动脉符合血管性痴呆的病理生理过程^[14-15]。此研究中，作者结扎一侧颈总动脉1周之后，再结扎另一侧。丰富环境作为一种经典的行为学干预方式，被用来研究其对动物的行为、心理变化以及神经系统的可塑性和脑的发育^[16-18]。梨状皮质是具有3层结构的旧皮质，在大脑的发育过程中具有高度的突触可塑性^[19-20]。实验研究从行为学水平观察了丰富环境对血管性痴呆大鼠认知功能的影响，同时从形态学和分子水平上观察了丰富环境对血管性痴呆大鼠梨状皮质DCX⁺细胞数目及DCX蛋白水平的影响。实验结果显示丰富环境可缩短血管性痴呆大鼠的逃避潜伏期，增加跨越平台次数，同时丰富环境增加血管性痴呆大鼠梨状皮质DCX⁺细胞的数目、DCX的蛋白含量以及DCX与NeuN的共表达细胞数目。因此丰富环境可通过增加血管性痴呆大鼠梨状皮质未成熟神经元的表达及分化，从而改善血管性痴呆大鼠的认知功能障碍。

3.1 丰富环境改善血管性痴呆大鼠的认知功能障碍血管性痴呆表现为记忆和学习能力下降。Morris水迷宫实验结果表明丰富环境组较血管性痴呆大鼠的逃避潜伏期缩短，跨越平台次数增加(P < 0.05)，这表明丰富环境可能通过加强长时程的突触可塑性而改善大鼠的学习记忆能力，提高空间定位能力。实验结果与先前的报道一致^[5^，^21]。

3.2 丰富环境增加血管性痴呆大鼠梨状皮质未成熟神经元的表达 Doublecortin(DCX)是一种微管蛋白，是新生的未成熟神经元和神经再生的标记物^[22-23]，参与神经突的外生和突触发生^[24-25]。在神经细胞的迁移过程中，DCX对于维持双极神经元的形态和在核转运中起着不可替代的作用^[26]。实验结果显示丰富环境组梨状皮质DCX⁺细胞数目显著多于血管性痴呆组(P < 0.05)，这表明通过丰富环境可以促进血管性痴呆大鼠梨状皮质未成熟神经元的表达和神经再生，并且这些神经元被整合到大脑的功能环路，参与大脑的修复，恢复脑的神经可塑性。为了进一步论证实验结果，开展了分子生物技术进行蛋白定量。Western blot结果显示丰富环境可以增加血管性痴呆大鼠梨状皮质DCX蛋白水平，这再一次证明丰富环境可促进血管性痴呆大鼠梨状皮质未成熟神经元的表达。

3.3 丰富环境加速血管性痴呆大鼠梨状皮质未成熟神经元分化为成熟神经元当新生的未成熟神经元从形态和生化开始发育和成熟后，成熟神经元的标记物NeuN的表达出现和增加^[27]，因此，DCX与NeuN的共表达水平在一定程度上体现梨状皮质DCX⁺细胞的神经分化成熟程度。实验结果显示，与血管性痴呆组相比，丰富环境显著增加梨状皮质DCX/NeuN细胞(P < 0.05)，这表明丰富环境能驱使未成熟神经元分化成更多的成熟神经元，从而参与大鼠的认知等生理功能。

综上所述，丰富环境可通过增加血管性痴呆大鼠梨状皮质未成熟神经元的表达及分化，从而发挥改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

丰富环境对血管性痴呆模型大鼠梨状皮质未成熟神经元表达的影响

Effects of enriched environment on immature neurons in piriform cortex of a rat model of vascular dementia

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