游离脂肪酸与全膝关节置换后隐性失血的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.26.005

摘要/Abstract

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文题释义：

游离脂肪酸：游离脂肪酸是导致氧化应激的物质之一，高游离脂肪酸刺激的后果是高活性反应分子性氧簇和活性氮簇生成增多，从而启动了氧化应激机制(高活性反应分子产生和抗氧化作用之间长期失衡而引起组织损伤)。这些活性分子可直接氧化和损伤DNA、蛋白质、脂类,还可作为功能性分子信号，激活细胞内多种应激敏感信号通路，这些信号通路与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关。

隐性失血：隐性失血常见于髋膝关节置换后，其造成的置换后贫血，在自体血回输或根据肉眼可见出血量进行异体输血后依然存在。虽然已有多种学说尝试解释这一现象，隐性失血的发生机制尚不清楚。隐性失血量可以根据Gross方程计算得出，即总失血量中减去显性失血量。

摘要

背景：人工全膝关节置换后隐性失血是临床关注的焦点，关于隐性失血的病因有很多假说，然而没有一种能够合理的解释其作用机制。

目的：分析游离脂肪酸与全膝关节置换后隐性失血的关系，探讨全膝关节置换后隐性失血的病因机制。

方法：收集42例骨关节炎行初次单侧全膝关节置换患者的临床资料，记录置换术中及置换后显性失血量，分别收集患者置换前以及置换后24，48，72，96 h的血液样本，检测血液中血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积和游离脂肪酸的变化趋势，应用Gross方程得出隐性失血量；同时对血液样本行涂片染色，在显微镜下观察红细胞形态变化。

结果与结论：①血红蛋白和红细胞计数在置换后24，48 h明显下降，与置换前相比差异有显著性意义(P < 0.01)；②游离脂肪酸含量在置换后24 h内明显升高，在72，96 h后逐步降低恢复至置换前水平，同时在置换后24，48 h发生了显著的隐性失血，与游离脂肪酸含量呈正相关；③显微镜下可以观察到大量异型性红细胞在置换后24，48 h主要表现为细胞皱缩及破坏，在置换后96 h红细胞形态无明显异常；④结果提示，游离脂肪酸水平与全膝关节置换后隐性失血密切相关，置换术中应积极控制通过髓腔高压进入血液循环的脂肪颗粒，从而减少围置换期总失血量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

ORCID: 0000-0001-5888-5073(王绍刚)

关键词: 骨科植入物, 人工假体, 游离脂肪酸, 全膝关节置换, 隐性失血, 总失血量, 活性氧, 红细胞形态, 血红蛋白, 过氧化氢, 氧化应激, 脂肪小滴

Abstract:

BACKGROUND: Hidden blood loss, after total knee arthroplasty, attracts surgeons’ attention. There are various hypotheses about etiopathogenisis of hidden blood loss, but no one can reasonably explain its mechanism.

OBJECTIVE: To research the correlation of free fatty acids and hidden blood loss after total knee arthroplasty, and explore the etiology and mechanism of hidden blood loss after total knee arthroplasty.

METHODS: Clinical data of 42 osteoarthritis patients who underwent primary unilateral total knee arthroplasty were collected in this study. Intraoperative and postoperative dominant blood loss was recorded. Blood samples were collected preoperatively and 24, 48, 72, and 96 hours postoperatively. Changes in hemoglobin, erythrocyte count, hematocrit and free fatty acids were detected in blood. Hidden blood loss was obtained by Gross equation. Simultaneously, stains were added to the blood smear. Changes of cells morphology were observed under a microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hemoglobin and erythrocyte count decreased significantly at 24 and 48 hours postoperatively, and significant differences were determined as compared with that preoperatively (P < 0.01). (2) Free fatty acids levels increased significantly within 24 hours after surgery, and decreased to preoperative levels at 72 and 96 hours later. Hidden blood loss was also significant at 24 and 48 hours after surgery, which showed positive correlation with free fatty acids content. (3) A plenty of abnormal erythrocytes were observed under the microscope. At 24 and 48 hours postoperatively, erythrocyte shrinkage and damage were mainly presented. At 96 hours, no significant abnormality was found. (4) These results indicated that free fatty acids were strongly associated with postoperative hidden blood loss. Surgeon should pay attention to the fatty droplets which may enter into the circulation in the process of reaming the femoral canal so as to reduce intraoperative total blood loss.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

Key words: Arthroplasty, Replacement, Knee, Hemoglobins, Blood Loss, Surgical, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王绍刚，陶忠亮，汪胜，唐佶颖. 游离脂肪酸与全膝关节置换后隐性失血的相关性 [J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(26): 3830-3836.

Wang Shao-gang, Tao Zhong-liang, Wang Sheng, Tang Ji-ying. Correlation of free fatty acids and hidden blood loss after total knee arthroplasty[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(26): 3830-3836.

图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析 53例患者纳入试验，1例患者在置换后发生下肢深静脉血栓；1例患者置换后发生感染；9例患者围手术期接受输血治疗。最终共42例患者纳入结果分析，其中男15例，女27例，且所有患者均完善了相关检查资料。
2.2 患者体征情况 患者平均身高为163.5 cm(154- 179 cm)，体质量65.5 kg (47-88 kg)。从而可以计算得出血容量为(3.74±0.48) L(3.12-5.28 L)。根据置换术中出血量及置换后引流量得知显性失血量为(686±125) mL (715-992 mL)；置换前平均红细胞压积为36.3% (25.4%-51.2%)，置换后红细胞压积为29.3% (21.1%-40.9%)；通过Gross方程得出总失血量为(1 482± 325) mL (1 376-1 854 mL)，隐性失血量为(717±168) mL (801- 1 023 mL)，隐性失血约占总失血量的54.8%。

2.3 置换前后观测指标变化趋势 置换前患者的血红蛋白为125.6 g/L(105-161 g/L)，红细胞计数为4.15× 10¹² L^-¹(3.81-4.95)×10¹² L^-¹，置换后连续3 d血红蛋白含量和红细胞计数与置换前相比每天下降分别为(11.5±3.2) g/L，(0.35 ± 0.12) ×10¹² L^-¹，与置换前相比差异有显著性意义(P < 0.05，图1)。

游离脂肪酸含量在置换前平均为0.48 mmol/L (0.26-0.73 mmol/L)，在置换后24 h内与置换前相比升高(0.47±0.21) mmol/L，置换前后差异有显著性意义 (P < 0.01，图2)，在置换后96 h恢复至置换前水平。由此分析得知，游离脂肪酸含量在置换后24 h内明显升高，在72，96 h后逐步降低恢复至置换前水平，同时隐性失血量在置换后24，48 h明显，与游离脂肪酸含量呈正相关(P=0.006)。

2.4 红细胞形态学变化 显微镜下观察到置换前红细胞形态正常，置换后24 h后出现部分红细胞异型性变化，主要表现为红细胞壁皱缩，部分细胞壁破裂甚至细胞裂解；置换后48 h后红细胞损伤持续存在，在96 h后则破坏情况基本消失，红细胞形态无明显异性变(图3)。

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引言

人工全膝关节置换过程中及置换后失血是最常见的并发症之一，大量失血会导致的众多并发症并影响置换后康复和疗效^[1-2]。隐性失血则是外科医生目前比较关注的焦点，然而其发病原因机制并不明确。隐性失血量可以根据Gross方程计算得出，即总失血量中减去显性失血量得出^[3]。有研究报道指出人工膝关节置换围手术期隐性失血量约占总失血量的50%^[4]，有多篇报道隐性失血量在膝关节置换围手术期可达到547-1 473 mL，但其发生机制尚不清楚^[5-6]。

有研究发现游离脂肪酸可通过刺激中性粒细胞，诱导出大量的活性氧簇如过氧化氢(H₂O₂)、超氧阴离子(O₂^-)、OH^-及其代谢产物^[6-7]。当生成的过氧化物超过了体内的代谢平衡时，血液中红细胞膜脂质层和胞浆内的血红蛋白则易发生病理性损伤，使得红细胞膜的渗透脆性增加，造成红细胞的变性而变形或破裂分解^[8-9]。与此同时，Polash等^[10-11]提出脂肪栓塞综合征的诊断标准指出，难以解释的红细胞压积降低是其次要标准之一，而且短时间内发生的不明原因性贫血常出现在典型的肺部和脑部症状之前。值得关注的一点是，脂肪栓塞综合征与人工全膝关节置换的共同特点是血液中的脂肪颗粒会明显增加。在行人工全膝关节置换修复骨关节炎患者时，术中假体插入股骨髓腔用于定位的截骨板导向杆、人工全膝关节置换中打入股骨髓腔的髓腔挫以及股骨柄假体均会造成髓腔压力增高^[6^，^12-13]。髓腔内脂肪小滴通过血循环进入心、脑、肺等器官的病理过程中起重要作用，这一点通过经食管超声心动图已得到证实，同时也有临床证据表明心肺功能异常与栓塞事件之间有密切相关性^[14-16]。袁涛等^[17-19]通过向大鼠体内注入游离脂肪酸替代物成功构造出了动物隐性失血模型，研究发现隐性失血与亚油酸、花生四烯酸等多不饱和脂肪酸密切相关，并指出其作用机制与氧化应激密切相关。

文章重在监测膝关节置换后患者体内游离脂肪酸、血红蛋白、红细胞计数的变化趋势，观察在此过程中红细胞的形态学变化，通过临床研究判断游离脂肪酸与隐性失血的相关性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计 自身对照实验。

1.2 时间及地点 与2013年6月至2015年6月在宣城市人民医院骨科完成。

1.3 材料 纳入研究的患者使用的人工关节假体为国产TC.Dynamic后稳定型人工膝关节假体(26例)及美国史塞克公司生产的Scorpio single Axis后稳定型人工膝关节假体(16例)，均为钛合金材料，具有良好的生物相容性。

血涂片瑞氏(Wright)染色法试剂盒(北京弘博康医药科技有限公司)；4XC-MS偏振光显微镜(“B-yes”邦亿精密量仪(上海)有限公司)；XE-5000全自动血液分析系统(日本 SYSMEX公司)；下肢静脉血栓治疗仪(北京环球优合商贸有限公司)。

1.4 对象 纳入2013年6月至2015年6月宣城市人民医院骨科收治的全膝关节置换患者53例，年龄56-79岁，平均68.3岁。

纳入标准：①患者为膝关节疼痛、不稳、畸形、日常生活活动严重障碍，经过保守治疗无效或效果不显著的无菌性膝关节炎，无其他基础疾病；②手术前后病历资料完整，采集血液样本符合测量要求；③患者对试验方案知情同意。

排除标准：①年纪轻、术后活动很多、肥胖、手术耐受力差者及有较严重的糖尿病、心肺功能不全患者；②血脂高出正常值、术前贫血或患有血液系统疾病的患者；③术前3个月患有脑梗死或者有下肢静脉曲张的患者；④有肝肾功能疾病或者肝肾功能障碍的患者。

1.5 方法

1.5.1 人工全膝关节置换围手术期处理所有手术均为同一主刀医生完成，围手术期管理均为同一主治医师负责，置换前记录患者的身高、体质量、体质量指数等基本情况。所有患者置换前0.5 h常规予以抗生素防治感染，使用止血带(压力以足背动脉波动减弱消失为准)，采用椎管内联合麻醉；手术时间为87.2-103.4 min，平均95.6 min。

置换术中充分止血，使用高速脉冲枪冲洗松质骨面及伤口，对胫骨平台及股骨远端进行截骨以适合假体大小、恢复力线、平衡软组织及保持髌骨轨迹为基本原则；置换后放置引流管，从脚踝至大腿中段加压包扎患肢，置换后24 h后口服利伐沙班(拜耳)抗凝治疗，指导患者在床上行患肢功能锻炼，使用下肢静脉血栓治疗仪理疗防止深静脉血栓，48 h后拔除引流管并做细菌培养。围手术期常规补液，维持血容量，保持出入量平衡；置换后第2天根据体质情况指导患者扶拐下地活动康复功能锻炼。

1.5.2 指标测定血液样本分别在置换前、置换后24，48，72，96 h采集，将采集的血液标本置于肝素抗凝管混匀后备用，取适量血液样本瑞氏法(Wright’s)染色制备红细胞血涂片，并在偏振光显微镜下观察红细胞形态变化；2 h内将血液样本送检，通过全自动血液分析系统测量红细胞计数、血红蛋白含量及游离脂肪酸含量。

1.6 主要观察指标 记录置换术中失血量(负压吸引器、无菌单、术中纱布)、置换后引流量(引流管引流量)、隐性失血量。

根据置换前测量的患者身高、体质量，可得知患者体质量指数，估算患者的血容量可以通过以下方法进行估计^[20]：

血容量=k1×身高(m³)+k2×体质量(kg)+k3

男性：k1=0.366 9，k2=0.032 19，k3=0.604 1；

女性：k1=0.356 1，k2=0.033 08，k3=0.183 3。

总失血量可以通过Gross方程进行计算：

总失血量=血容量×(H₀-H₁)/Hav

其中，H₀为置换前的红细胞压积，H₁为置换后的红细胞压积，血容量×(H₀-H₁)是置换前后红细胞的丢失量，Hav=(H₀+H₁)/2，即置换前后平均红细胞压积。

隐性失血量(mL)=总失血量-显性失血量。

监测血液样本中的血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积、游离脂肪酸和红细胞血涂片的形态。

1.7 统计学分析 对收集的计量样本资料采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据以x(_)±s表示，对符合正态分布的数据比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

讨论

关于隐性失血的研究假说有很多，Park 等^[21]提出隐性失血可能是体内部分溶血的所致，然而具体的溶血机制并未合理的解释。与此同时，有临床随机对照试验研究发现，隐性失血在自体血回输组与非输血组之间差异无显著性意义。由于止血的在术中的使用，部分学者报道指出膝关节置换术中使用止血带会增加隐性失血的风险^[22]，有研究将患者分为使用止血带和未使用止血带组进行观察研究^[23-24]，结果表明2组之间手术时间差异无显著性意义；未使用止血带组的显性失血量与使用组相比术中失血量增加约180 mL；但未使用止血带组的隐性失血丢失量较使用者低约16%，其隐性失血的绝对值可达到550 mL。除此之外，“第三间室”理论也解释了部分隐形失血的原因^[25-26]，Boswell等^[27]通过使用标记的红细胞发现，在下肢组织间歇发现了大量被标记的红细胞，因此他们认为人工全膝关节置换后所发生的隐性失血是由于组织出血或渗血渗液进入了周围组织间隙(即第三间隙)的原因。然而，人工全膝关节置换后常规会对术侧肢体从脚踝至大腿进行加压包扎减少出血，并且通常会使用负压引流球引流血液，所以血液渗入了高压的周围软组织间隙很困难，通过此途径引发的失血量很有限。尽管有如此多的理论假说，隐性失血的病理机制仍需更多的研究去探讨。

由于止血带在膝关节手术中的广泛使用，使得术中出血量非常小，甚至可以忽略不计；人工全膝关节置换围手术期显性出血量主要分为术中出血和术后关节腔血液引流量。原则上回收术中失血及术后引流量并处理回输入体内，通过自体血回输能够矫正围手术期患者失血状况，但临床实践研究发现，全膝关节置换后自体血回输并不足以纠正围手术期失血，并且回输血量所矫正的血液损失仅相当于50%的总失血量^[28-29]。隐性失血所导致的不明原因性血红蛋白快速下降往往使得患者贫血，而有时需要接受血库库存血改善贫血状况。Berra等^[30]则发现溶血可由自体血回输引起，他们的研究报道提出回输大于1.2 L的自体血，人体内的血红蛋白质可回升约65 mg/L，理论上讲，红细胞溶血可通过检测尿液样本得以发现，但是由于体内结合珠蛋白的存在，该水平的溶血不足以造成血红蛋白尿，然而可造成自体回输血容量不足情况。

邱旭升等^[20]对48例因原发性骨关节炎患者，行全膝关节置换后隐性失血危险因素的分析指出，围手术期显性失血量与手术时间、术中出血量和置换后引流管引流量呈正相关，与其他因素无明显相关性；患者的身高、体质量也与隐形失血存在正相关，然而与体质量指数无相关性，与此同时他们的研究还指出隐性失血与置换后引流管引流量呈负相关性；总的失血量则与体质量、术中失血、手术时间之间都有明显正相关，另外，不同的术者所行的全膝关节置换总失血量有差异，类风湿性关节炎的患者总失血量相对较大^[31]。在本研究中为了避免自体血回输可能对隐性失血的影响，将置换后接受自体血回输的患者排除在研究范围外。同时，感染和深静脉血栓等因素也可能对试验结果产生不必要的干扰^[32]，在试验设计过程中予以剔除，尽可能保持研究对象变量的可控性。手术开展及围手术期管理均为同一手术小组，有效的控制了手术时间及术中术后的出血量。

隐性失血发生的因素有很多，但在本研究中发现，所有患者在置换后均出现游离脂肪酸浓度明显升高，随之发生相应变化的是红细胞计数及血红蛋白含量置换后72 h的持续下降，血液中游离脂肪酸的浓度与红细胞降低程度正相关。根据袁涛等^[17-18]的研究中提出游离脂肪酸可能诱导机体内发生氧化应激反应，其代谢产物可刺激中性粒细胞使活性氧簇增加，当活性氧簇的产生超过机体代谢时则会对细胞、组织、器官等造成不同程度的损伤。活性氧对细胞的损伤主要通过氧化破坏细胞膜表面的脂质，导致细胞膜的通透性发生改变或者在强氧化剂的作用下直接氧化破坏细胞膜。作者对红细胞形态学的观察研究也发现在置换后24 h内发现大量红细胞损伤，主要表现为大量的异形性红细胞以及红细胞壁的皱缩，破裂等，在置换后48 h红细胞情况无明显好转持续破坏，在给药后72 h红细胞破坏情况好转，红细胞形态基本正常，这可以认为是红细胞蛋白质的氧化和细胞膜脂质层的氧化破坏，导致细胞膜通透性改变出现了皱缩及异形性改变，随着游离脂肪酸的代谢，其诱导的氧化应激作用逐步减弱，红细胞的损伤情况得以缓解。

游离脂肪酸成分复杂，然而有研究指出其包含大量多不饱和脂肪酸，其不饱和脂肪酸结构中的双键的存在相对容易受到氧自由基的攻击，最终诱导产生大量的自由基和活性物质^[33]。游离脂肪酸对红细胞的氧化应激作用可能的途径为：膝关节术中操作导致髓腔内压力升高，髓腔内大量的脂肪小滴随之进入血液循环，脂肪颗粒代谢产生游离脂肪酸，后者能够刺激中性粒细胞产生大量活性氧，作用于红细胞及血红蛋白，导致红细胞膜损伤及血红蛋白的不可逆性氧化，使红细胞失血携氧能力。谷胱甘肽过氧化物酶是广泛的存在于机体内参与H₂O₂分解的酶，可催化还原型谷胱甘肽对H₂O₂的还原反应，间接保护细胞组织免遭氧化损伤^[34-35]。超氧化物歧化酶主要作用是平衡机体内氧化还原系统，可特异性清理超氧阴离子(O²^-•)，有效减少细胞组织的直接氧化损伤，血液中的超氧化物歧化酶对超氧阴离子自由基有特异性抑制作用，通过对超氧化物歧化酶活力的测定可得知机体清理氧自由基的能力^[36-38]。H₂O₂受Mn-超氧化物歧化酶和Zn-超氧化物歧化酶的作用转化为H₂O和O₂，或经谷胱甘肽作用直接转化为H₂O^[39]。血红蛋白是红细胞血色素的重要组成部分，Fe(Ⅱ)血红蛋白主要负责组织之间氧气的输送^[40]；在体外，它可以通过自身缓慢的氧化为Fe(Ⅲ)血红蛋白和超氧化物，Fe(Ⅲ)血红蛋白在血液中往往不能运输氧，其所占的比例不足3%，Ferryl血红蛋白是高铁血红蛋白在强氧化剂作用下生成的四价铁(Fe⁴⁺=O²⁻)血红蛋白，从而失去了携带运输氧的功能^[41]。与此同时，有研究表明，血红蛋白被氧化为Ferryl血红蛋白过程中往往会诱发脂质过氧化反应，加重脂质细胞膜的破坏^[42]。由此，本研究可通过进一步检测谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、H₂O₂以及Ferryl血红蛋白在围手术期的变化情况探讨验证血液中升高的游离脂肪酸对红细胞损伤的机制。

通过此次研究可以初步确认游离脂肪酸在膝关节置换后隐性失血中发挥一定的作用，其具体作用机制为游离脂肪酸诱导的氧化应激损坏红细胞。研究的不足之处是没能对血液样本中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、H₂O₂、Ferryl血红蛋白进行监测，在下一步的研究中将进一步对这些指标进行动态检测，以明确隐性失血的病理机制。这也提示，术中积极减少进入髓腔的脂肪颗粒可能会有效减轻置换后隐形失血发生，抗氧化剂的使用则可以有效防治隐性失血。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程