骨形态发生蛋白2/Osterix信号通路调控的前成骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
转录因子：能够识别并结合在某个基因上游启动子上的特定的碱基序列上的蛋白质，这种蛋白质能够调控该基因以特定的强度在特定的时间与空间进行转录翻译蛋白质。转录因子不但能够单独与基因启动子结合，也能够与其他的转录因子形成复合体来调控基因的转录。
基因过表达：通过人工构建的方式将目的基因连接到特定载体上，将基因导入到目的细胞中，目的基因在其上游启动子的作用下在细胞中大量的转录翻译，实现了目的基因的过表达，从而达到获取大量目的基因或者研究目的基因生物学功能的目标。

摘要
背景：研究发现Osterix基因的表达能够受到骨形态发生蛋白2信号通路的调控，从而调节骨的形成发育。
目的：分析骨形态发生蛋白2/Osterix信号通路对小鼠前成骨细胞分化的调控作用。
方法：将骨形态发生蛋白2作用于前成骨细胞，利用实时定量RT-PCR法及免疫印迹法检测不同时间段Osterix mRNA和蛋白的表达水平；构建pcDNA3.1/myc-Osterix真核表达载体，并转染至前成骨细胞，利用实时定量RT-PCR法检测转染Osterix真核表达载体和骨形态发生蛋白2作用后碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)的mRNA表达水平。
结果与结论：①实时定量RT-PCR法检测结果表明骨形态发生蛋白2上调Osterix mRNA在小鼠前成骨细胞中的表达水平，并在24 h时上调作用最为显著；②免疫印迹法检测骨形态发生蛋白2显著上调Osterix蛋白的表达水平；③成功构建了pcDNA3.1/myc-Osterix真核表达载体，在转染小鼠前成骨细胞和以骨形态发生蛋白2作用后检测到碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达显著增强；④结果说明，骨形态发生蛋白2通过上调小鼠前成骨细胞中Osterix的表达来调控碱性磷酸酶、细胞外基质磷酸化糖蛋白等成骨标志基因的合成，表明骨形态发生蛋白2/Osterix这一信号通路在骨发育过程中具有重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4531-6856(李成琳)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 骨形态发生蛋白2, Osterix, 前成骨细胞, 实时定量RT-PCR, 信号通路, 免疫印迹

Abstract:

BACKGROUND: Bone formation and development are reported to be regulated by bone morphogenetic protein 2 (BMP2)-induced Osterix expression.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of BMP2/Osterix signaling pathway on differentiation of preosteoblasts in mice.
METHODS: mRNA and protein expression of Osterix was determined by real-time RT-PCR and western blot assay, respectively at various time points after mouse preosteoblasts were treated with BMP2. pcDNA3.1/myc-Osterix eukaryotic expression vector was constructed and transducted into preosteoblasts, and then mRNA expression of alkaline phosphatase, bone sialoprotein, and matrix extracellular phosphoglycoprotein was detected by real-time RT-PCR after transduction and BMP2 treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Osterix mRNA expression was up-regulated when treated with BMP2 in mouse preosteoblasts, and reached the peak at 24 hours. In addition, the protein expression of Osterix was increased after BMP2 treatment. Alkaline phosphatase, bone sialoprotein, and matrix extracellular phosphoglycoprotein mRNA expression was up-regulated after transfection of mouse preosteoblasts with pcDNA3.1/myc-Osterix eukaryotic expression vector and BMP2 treatment. Our results indicate that BMP2 regulates the synthesis of genetic markers of osteogenesis, such as alkaline phosphatase, matrix extracellular phosphoglycoprotein via up-regulating Osterix expression in mouse preosteoblasts, suggesting BMP2/Osterix signaling pathway plays a critical role in bone development.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Signal Transduction, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李成琳，陈书兰，任伟伟. 骨形态发生蛋白2/Osterix信号通路调控的前成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(24): 3581-3587.

Li Cheng-lin, Chen Shu-lan, Ren Wei-wei. Bone morphogenetic proteins-2/Osterix signaling pathway regulates the differentiation of preosteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(24): 3581-3587.

图/表（结果） 1

2.1 实时定量RT-PCR检测骨形态发生蛋白2调控小鼠前成骨细胞中Osterix mRNA的表达根据实时定量RT-PCR检测结果发现，骨形态发生蛋白2上调小鼠前成骨细胞中Osterix基因的mRNA表达，并且在刺激细胞 24 h后Osterix基因的mRNA表达最为显著(图1，P < 0.05)。

2.2 免疫印迹法检测骨形态发生蛋白2调控小鼠前成骨细胞中Osterix蛋白的表达根据免疫印迹法检测结果发现，骨形态发生蛋白2上调小鼠前成骨细胞中Osterix基因的蛋白表达水平，72 h的蛋白表达量比48 h升高(图2)。

2.3 转录因子Osterix基因的克隆及重组质粒pcDNA3.1/myc-Osterix的构建结果测序成功后，将pcDNA3.1/myc-Hisa真核载体和经测序正确的重组质粒pMD18-T Simple-Osterix。分别用EcoRⅣ及Hind Ⅲ进行双酶切后割胶回收。割胶回收后的pcDNA3.1/ myc-Hisa真核载体与Osterix基因片段进行连接。连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，挑取单克隆，37 ℃振荡培养，小量质粒提取，经EcoR Ⅳ及Hind Ⅲ进行酶切鉴定正确者，将构建的重组真核质粒命名为pcDNA3.1/myc-Osterix(图3)。

2.4 实时定量RT-PCR检测转染质粒pcDNA3.1/ myc-Osterix后小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平根据实时定量RT-PCR检测结果发现，转染质粒pcDNA3.1/myc-Osterix后小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平上调，其中碱性磷酸酶、骨涎蛋白的mRNA表达水平在Osterix转染100 ng时上调最为显著(图4A，B，P < 0.05)，细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平在Osterix转染50 ng时上调最为显著(图4C，P < 0.05)。

2.5 实时定量RT-PCR检测骨形态发生蛋白2作用下小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平根据实时定量RT-PCR检测结果发现，相对于空白对照组，碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平在骨形态发生蛋白2作用下得到显著上调(图5，P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年10月在青岛大学医学院实验室完成。

1.3 实验方法

1.3.1 实时定量RT-PCR检测骨形态发生蛋白2调控小鼠前成骨细胞中Osterix mRNA的表达在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃体积分数5%CO₂培养箱中进行小鼠前成骨细胞的复苏培养及传代。将传代至4代以上的小鼠前成骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化，按7 000/cm²的密度接种于6孔板，继续培养20 h后待细胞密度长至80%-85%时进行骨形态发生蛋白2刺激细胞。

实验共分5组，每组分别加入100 μg/L的骨形态发生蛋白2，空白对照组为PBS。组1：培养刺激6 h后收

前成骨细胞调控实验用细胞及试剂：
试剂及细胞	来源
小鼠前成骨细胞	购自解放军第四军医大学
RNA提取试剂盒、pMD18-T Simple Vector、T₄ DNA Ligase	TaKaRa公司
pcDNA3.1(+)/myc-Hisa真核表达载体	invitrogen公司
UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒	Bio Basic Inc公司
限制性内切酶Hind III、EcoRⅠ、质粒转染试剂盒	Promega公司
质粒中抽试剂盒	QIA-GEN公司
胰蛋白酶、DMEM培养基	Hyclone公司
胎牛血清	杭州四季青公司
兔抗鼠Osterix多克隆抗体	Santa Cruz公司

集细胞；组2：培养刺激12 h后收集细胞；组3：培养刺激24 h后收集细胞；组4：培养刺激48 h后收集细胞；组5：培养刺激72 h后收集细胞。以此前成骨细胞的总mRNA反转录的cDNA为模板，进行实时定量PCR。

引物序列：

内参对照GAPDH，F：5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’，R：5’-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3’；扩增片段长度为150 bp。

Osterix，F：5’-GCC AGA AGC TGT GAA ACC TC-3’；R：5’- GCT GCA AGC TCT CCA TAA CC-3’；扩增片段长度为161 bp。

实时定量RT-PCR反应条件：95 ℃/4 min 1个循环；95 ℃/10 s，55 ℃/15 s，72 ℃/25 s，80 ℃/15 s采集荧光，共40个循环；最后72 ℃/1 min 1个循环。RT-PCR反应在IQ5 ^TM PCR仪中进行，每个样本6个复孔，每次实验重复3次。

1.3.2 免疫印记法检测骨形态发生蛋白2调控小鼠前成骨细胞中Osterix蛋白的表达将传代至4代以上的小鼠前成骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化，按7 000/cm²的密度接种于培养皿中，继续培养20 h后待细胞密度长至80%-85%时进行骨形态发生蛋白2刺激细胞。实验分为3组，组1为空白对照组PBS作用72 h，组2中加入 100 μg/L的骨形态发生蛋白2作用48 h，组3中加入 100 μg/L的骨形态发生蛋白2作用72 h。继续培养细胞72 h后收集并裂解细胞，加入50 μL的1×SDS凝胶上样缓冲液吹打混匀，将混合液在沸水浴中煮沸10 min，离心后取上清液10 μL。然后依次在SDS-PAGE上进行凝胶电泳、转膜、封闭液封闭、一抗免疫反应、二抗免疫反应、化学发光反应、拍照，以确定Osterix基因在骨形态发生蛋白2作用下的蛋白表达水平。

1.3.3 提取小鼠前成骨细胞总mRNA 将前成骨细胞复苏并培养至铺满瓶底约80%时，可按照试剂盒说明书提取前成骨细胞的总mRNA，实验步骤如下：①将培养好的前成骨细胞中加入适量的RNAiso Plus试剂进行裂解细胞；②在细胞混合液中加入氯仿，充分混匀后溶液乳化无分相，在4 ℃下离心使溶液分为3层液体，从上至下依次为：上层无色的上清液、中间为白色的蛋白层，最下层的有机相；③吸走上层的上清液转移至新的试管中，加入与上清液同体积的异丙醇，充分混匀后在冰上静置，再进行离心；④离心后可在离心管底见少量沉淀物，弃掉上清液，加入体积分数75%乙醇洗涤沉淀，再离心，弃去上清液；⑤将离心管在室温干燥5 min，然后加入适量的DEPC水溶解沉淀；⑥紫外分光光度计测定细胞总mRNA：分别测定细胞总RNA在260 nm和 280 nm处的吸光度值，最后计算mRNA的含量和纯度。

1.3.4 小鼠Osterix基因的克隆及重组质粒pcDNA3.1/myc-Osterix的构建利用上述的mRNA反转录合成cDNA以作为PCR反应的模板。根据Genbank中登记的小鼠Osterix基因序列及引物设计原则，利用Primer primer5.0软件进行设计引物。Osterix上游引物：5’-GC-AAG CTT-TCG CCA CCA TGG CGT CCT CTC TGC TTG AGG A-3’(Hind Ⅲ)，下游引物：5’-AT- GAA TTC-TTC TAT TAT CAG ATC TCT AGC AGG TTG C-3’(EcoRⅠ)。引物送至大连TaKaRa公司合成。预计扩增Osterix的1 375个碱基DNA片段。

Osterix的PCR扩增条件：98 ℃/2 min 1个循环；98 ℃/10 s，57 ℃/15 s，72 ℃/ 3 min 35个循环；最后72 ℃/ 10 min1个循环。PCR产物经DNA琼脂糖凝胶电泳，UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒进行回收纯化。回收纯化的PCR产物，经Taq酶72 ℃ 15 min加A，之后连接于 pMD18-T Simple载体。连接产物转化入感受态细胞E.coli DH5α，挑取单克隆，进行质粒小量提取，经EcoRⅠ及Hind Ⅲ酶切鉴定并送至南京金斯瑞公司进行测序。

1.3.5 实时定量RT-PCR检测转染质粒pcDNA3.1/ myc-Osterix后小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平将传代至4代以上的小鼠前成骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化，按7 000/cm²的密度接种于6孔板，继续培养20 h后待细胞密度长至80%-85%时进行转染质粒pcDNA3.1/ myc-Osterix。

实验共分4组，组1：转染空质粒pcDNA3.1/ myc- Hisa 100 ng；组2：转染pcDNA3.1/ myc-Osterix 20 ng+ pcDNA3.1/myc-Hisa80 ng；组3：转染pcDNA3.1/myc- Osterix 50 ng+pcDNA3.1/myc-Hisa 50 ng；组4：转染pcDNA3.1/myc-Osterix 100 ng。转染完成24 h后以此前成骨细胞的总mRNA反转录的cDNA为模板，进行实时定量PCR。

引物序列：

内参对照GAPDH，F：5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’；R：5’-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3’；扩增片段长度为150 bp。

碱性磷酸酶，F：5’-CTC GTT GAC ACC TGG AAG AGC TTC AAA CCG-3’；R：5’- GGT CCG TCA CGT TGT TCC TGT TCA GC-3’；扩增片段长度为168 bp。

骨涎蛋白，F：5’-AAA ACG AAG AAA GCG AAG C-3’；R：5’-TAT TCA TTG ACG CCC GTG TA-3’；扩增片段长度为331 bp。

细胞外基质磷酸化糖蛋白，F：5’-GTC TGT TGG ACT GCT CCT CTT-3’；R：5’- CAC CGT GGG ATC AGG ATA CA-3’；扩增片段长度为130 bp。

实时定量RT-PCR反应条件：同1.3.1。

1.3.6 实时定量RT-PCR检测骨形态发生蛋白2作用下小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平培养细胞完成后，将其分2组，一组加入100 μg/L 的骨形态发生蛋白2，另一组加入PBS作为空白对照。利用碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白引物进行实时定量RT-PCR检测。实验方法步骤按照上述进行，RT-PCR反应在IQ5 ^TM PCR仪中进行，每个样本6个复孔，每次实验重复3次。

1.4 主要观察指标 ①骨形态发生蛋白2调控小鼠前成骨细胞中Osterix基因mRNA和蛋白的表达。②转录因子Osterix基因的克隆及重组质粒pcDNA3.1/myc- Osterix的构建结果。③转染质粒pcDNA3.1/myc- Osterix后小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平。④骨形态发生蛋白2作用下小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达水平。

1.5 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，组间比较用配对t 检验进行统计学分析实时定量RT-PCR结果。

讨论

骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白酸性糖蛋白家族中的成员，广泛分布于骨基质中。骨形态发生蛋白2

能够通过特异的信号通路刺激间充质干细胞分化成成骨细胞，并调控成骨细胞分化成骨细胞^[7-8]，从而调节骨的形成、发育、重建等过程。研究发现低强度光照^[9]、雷奈酸锶^[10]、铈等外源性刺激能够激活骨形态发生蛋白2信号通路^[11]，上调成骨的标志物的表达，影响骨成骨分化。而当骨形态发生蛋白2信号通路中的信号因子的阻断或者丢失，能够导致骨密度降低、骨折发生率升高、各种骨性疾病增多等等^[12-13]。因牙周病导致的牙槽骨破坏，正畸过程中因牙齿位移导致的牙槽骨的吸收，对口腔环境的影响很大。因此探讨骨形态发生蛋白2信号通路调控骨形成分化对牙槽骨的重建修复具有重要意义。

Osterix是由Nakashima等^[14]在2002年发现的一种含有锌指结构的转录因子，由428个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为46 000，属于XKLF转录因子家族Sp亚家族成员。其羧基端包含有3个C₂H₂型锌指结构组成的DNA结合域。Osterix是与成骨有关的重要的转录因子，能够调控成骨细胞的形成与分化。在胚胎期敲除掉Osterix基因的小鼠无法形成骨性组织，出生后敲除掉Osterix基因的小鼠成骨细胞的形成与分化受阻^[15-16]。Matsubara^[17]发现Osterix基因的表达能够受到骨形态发生蛋白2信号通路的调控，从而调节骨的形成发育。

作者首先通过实时定量RT-PCR检测发现骨形态发生蛋白2作用于前成骨细胞后，细胞中的Osterix mRNA表达量相对于PBS空白对照组得到显著升高，并且在骨形态发生蛋白2刺激细胞24 h左右时，Osterix mRNA表达量升高最为显著，这说明骨形态发生蛋白2能够从细胞外通过一定的信号通路将信号传导作用至Osterix基因，并能够促进其表达。骨形态发生蛋白2上调Osterix基因的作用时间在24 h的时间段达到高峰，然后逐渐减弱，mRNA的表达量亦随之降低。免疫印迹法检测中骨形态发生蛋白2刺激作用下的前成骨细胞中Osterix基因蛋白表达量显著升高，并随着时间增长蛋白的表达量也随之增加。这些结果表明Osterix基因处在骨形态发生蛋白2信号通路调控作用之中，从而对前成骨细胞的增殖分化产生影响。

碱性磷酸酶是成骨细胞分泌的代表成骨细胞分化的特异性酶蛋白，它主要结合于细胞膜上，在细胞进行骨向分化的开始阶段就能够大量表达，是一种标志性的糖蛋白。骨涎蛋白是成骨细胞分化成熟，并具有矿化功能的标志^[18]，其广泛分布在骨、牙齿之中。细胞外基质磷酸化糖蛋白则在骨骼、肾脏、大脑中能够检测到，其在调节骨发育的过程中具有双重性能，既能抑制骨的矿化^[19]，同时又在新生小鼠的牙槽骨中阳性表达，参与了牙槽骨的形成^[20-21]。骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白都属于短整联蛋白黏合性配体互动糖蛋白家族，这个家族的所用成员都能够参与骨骼、牙齿的发育、矿化，同时又能够调节人体内的钙磷等微量元素的平衡。

通过PCR方法在小鼠前成骨细胞提取的cDNA中成功扩增出Osterix基因片段，并构建了pcDNA3.1/ myc-Osterix真核表达载体。扩增的成功可能与前成骨细胞中Osterix基因的表达量较高有关。将pcDNA3.1/ myc-Osterix真核表达载体转染前成骨细胞并过表达，实时定量RT-PCR检测到碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白等成骨标志基因的mRNA表达量显著升高。其中碱性磷酸酶、骨涎蛋白的mRNA表达量随着Osterix基因转染量的增多而逐渐升高，说明Osterix基因能够提升成骨基因的表达，促进前成骨细胞的骨向分化。细胞外基质磷酸化糖蛋白的mRNA表达量在Osterix基因转染至50 ng时最显著，但随着Osterix基因转染量继续增多其mRNA表达量则逐渐降低。这一情况说明Osterix基因在前成骨细胞中低量表达时对细胞外基质磷酸化糖蛋白起到促进表达作用，而在高表达时细胞外基质磷酸化糖蛋白的表达没有继续提升反而受到一定的抑制。根据推测细胞外基质磷酸化糖蛋白在前成骨细胞中的表达是一定的，50 ng的Osterix基因与其启动子结合能够促进表达，并且在表达的程度之内。但是100 ng的Osterix基因与细胞外基质磷酸化糖蛋白启动子结合，可能启动子上的Osterix基因结合位点已经结合完毕，也可能数量过多形成同源二聚体，在与启动子结合中代替了Osterix基因，从而抑制了细胞外基质磷酸化糖蛋白的表达。实验直接用骨形态发生蛋白2作用于前成骨细胞，然后检测碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白等基因的mRNA表达量，表达水平是显著升高的。根据以上的结果发现骨形态发生蛋白2通过一定的信号通路能够促进Osterix基因在小鼠前成骨细胞中的表达，而Osterix基因过表达又能够增强碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白等成骨标志基因的合成，最终调节了前成骨细胞的骨向分化。这一条调控通路对于临床上开展治疗牙周病，重建牙槽骨的研究提供了理论指导。但是实验还有很多需要解决的问题，比如骨形态发生蛋白2调控Osterix基因的信号通路是哪些，Osterix基因在调控成骨细胞分化的过程中是否有其他的转录因子参与等等都有待研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程