多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预对人肝癌细胞株SMMC-7721的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
多西紫杉醇：是以紫杉树中的化学物质为基础而合成出来的一种药物。药物作用机制与紫杉醇相似，即抑制微管的解聚，抑制细胞分裂。适用于局部晚期非小细胞性肺癌或转移性乳腺癌的治疗。
间充质干细胞：是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。

摘要
背景：多西紫杉醇为细胞周期特异性抗肿瘤药，单药抗肿瘤具有较好的缓解率，但对于化疗相对不敏感的肿瘤，多西紫杉醇单一化疗有效率较低。研究报道，利用骨髓间充质干细胞可以提高靶向药物局部富集肿瘤的能力。
目的：验证多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预人肝癌细胞株SMMC-7721的作用。
方法：体外培养骨髓间充质干细胞，选取对数生长的SMMC-7721肝癌细胞，将其随机分为空白组，骨髓间充质干细胞组及联合组(多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合)。采用流式细胞技术检测肝癌SMMC-7721细胞的周期变化；利用MTT法检测肝癌SMMC-7721细胞的生长率；采用聚合酶链法及免疫印迹法检测抑癌基因PTEN、p53的mRNA及蛋白表达情况。
结果与结论：①流式细胞技术检测显示：多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预可以抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，与空白组比较，骨髓间充质干细胞组及联合组处于G0/G1期的细胞明显增多；②MTT检测显示：干预48 h后，与空白组比较，骨髓间充质干细胞组肝癌SMMC-7721细胞的生长率得到抑制，与骨髓间充质干细胞组比较，联合组肝癌SMMC-7721细胞的生长率得到显著抑制(P < 0.05)；③RT-PCR检测显示：抑癌基因PTEN、p53的mRNA表达量在联合组明显高于空白组及骨髓间充质干细胞组；④Western blot检测显示：与其他2组比较，联合组明显上调抑癌基因PTEN、p53的蛋白表达量(P < 0.05)；⑤结果提示，骨髓间充质干细胞能够抑制体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的生长，联合多西紫杉醇干预后，肝癌SMMC-7721细胞的生长率可以得到显著抑制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0042-1705(李京云)

关键词: 组织构建, 组织工程, 肝癌, SMMC-7721细胞, 骨髓间充质干细胞, 干预, 干细胞, 生长率, 抑制

Abstract:

BACKGROUND: Docetaxel, a cell cycle specific anti-tumor drug, is a drug that is used primarily for treating breast cancer; however, its efficacy is low when used for treatment of cancer not sensitive to radiotherapy. Bone marrow mesenchymal stem cells have been shown to strengthen the effects of tumor-specific targeting chemotherapy drugs.
OBJECTIVE: To investigate the effects of docetaxel combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on human hepatoma cell line SMMC-7721.
METHODS: BMSC cells were cultured in vitro. The logarithmic growth of SMMC-7721 hepatoma cells were randomly divided into blank control group, BMSCs group and combined treatment group (combined treatment of BMSCs and docetaxel). SMMC-7721 cell cycle was detected using flow cytometry. Cell growth rate of SMMC-7721 was determined by MTT assay. mRNA and protein expressions of tumor suppressor genes PTEN and p53 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Combined treatment of docetaxel and BMSCs inhibited SMMC-7721 cell proliferation. Compared with the blank control group, the number of cells at the G0/G1 phase was significantly increased in BMSCs group and combined treatment group. The cell growth rate of SMMC-7721 was significantly inhibited in BMSCs group compared with the blank control group, and that was further inhibited in combined treatment group (P < 0.05). mRNA and protein expression of PTEN and p53 were significantly increased in combined treatment group compared with BMSCs group and blank control group (P < 0.05). Our results suggest that BMSCs inhibit the growth of SMMC-7721 cells, and combined use of docetaxel and BMSCs strengthens the antitumor effect of BMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Liver Neoplasms, Mesenchymal Stem Cells, Stem Cells

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

近些年来，肝癌的发病率见长，根据统计资料显示，在全球每年大概有60万的新发肝癌患者出现，中国也是肝癌高发国之一，可见肝癌已对人类的健康与生命造成很大威胁，值得国人高度关注和重视^[1-3]。对于肝癌的发病机制还未十分明确，目前认为，肝癌发病可能与肝癌细胞的过度增殖及细胞凋亡受抑有关。因此，阻断肝癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡可能会成为一种新的治疗策略^[4-6]。

多西紫杉醇为细胞周期特异性抗肿瘤药，据相关研究报道，多西紫杉醇单药抗肿瘤的效果具有较好的缓解率^[7-8]，但对于化疗相对不敏感的肿瘤，采用多西紫杉醇单一化疗的有效率却较低，且临床使用过程中发现有许多不良反应出现，进而影响了多西紫杉醇的抗肿瘤效率。研究报道称骨髓间充质干细胞具有分化为不同细胞及组织类型的潜能^[9-10]，能够定向诱导分化向肝细胞移植，是细胞移植的理想来源。另有研究发现体内移植骨髓细胞后，可发育为肝样细胞和肝干细胞^[11-12]，且具有肝细胞的功能特点，能促进受损肝组织的修复及肝细胞再生能力的恢复^[13-14]。另有研究报道，利用骨髓间充质干细胞作为荷载肿瘤治疗药物的工具，可以提高靶向药物局部富集肿瘤的能力^[15]。

随着再生医学及组织工程的发展，人们不断探索新的治疗肝癌的手段，以提高预后。骨髓间充质干细胞为这一目的展示了广阔的前景^[16-17]，但目前关于骨髓间充质干细胞治理肝癌还处于初级阶段。实验旨在探讨骨髓间充质干细胞会对肝癌细胞生长的作用和影响，研究中将多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预，探讨二者联合干预后对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的影响作用。

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材料方法

1.4 实验方法

1.4.1 体外培养骨髓间充质干细胞及肝癌SMMC-7721细胞采用原代培养后冻存的大鼠骨髓间充质干细胞(由河北大学附属医院实验室提供)，将冷冻管从液氮中取出。立即投入38-40 ℃水浴中，充分摇动，使其迅速熔化，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免污染，不定时搅拌加速解冻。融化后采用含体积分数70%乙醇的消毒棉消毒冷冻管，将骨髓间充质干细胞球悬液转移至4 ℃预冷的完全培养液中，以1 000 r/min，离心15 min。机械吹打，将骨髓间充质干细胞球分散为单细胞。加入PBS洗涤，1 000 r/min，离心10 min，弃去上清，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，调整细胞浓度为1×10⁹L^-1接种于培养瓶中，于37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度条件下培养。24 h后全量更换培养基，去除未贴壁细胞，以后每3 d全量更换新鲜培养液。当细胞生长至80%-90%融合时，予消化传代。以1∶3比例进行传代，并记为P1，传代时使用 D-Hank’s液冲洗培养瓶3-5次，适度消化后离心收集细胞。大鼠骨髓间充质干细胞鉴定参考文献[12]中的方法进行。

人肝癌细胞株采用含体积分数10%胎牛血清的RPMIl640培养液，1 mmol/L L-glutamine，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素培养基置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞，经 0.25%胰酶消化成单细胞悬液，分瓶传代培养。

1.4.2 流式细胞技术检测肝癌SMMC-7721细胞的周期变化实验随机分为空白组(5 mL SMMC-7721细胞5×10⁶L^-1)，骨髓间充质干细胞组(4 mL SMMC-7721细胞5×10⁶L^-1+1 mL骨髓间充质干细胞5×10⁶ L^-1干预)及联合组(在骨髓骨髓间充质干细胞组干预的基础上加入多西紫杉醇剂量25 μmmol/L)。收集3组的肝癌SMMC-7721细胞，并将细胞浓度调整为1×10⁶L^-1，利用PBS清洗细胞2遍后，加入体积分数70%冷乙醇 (4 ℃)1 mL，于4 ℃下固定过夜；采用冷PBS清洗2遍，以体积分数70%的冷乙醇(4 ℃)将细胞沉淀后混匀，备用，洗涤细胞后再将细胞浓度调整为1×10⁶L^-1(用PBS)与含50 mg/L RNA 酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共同孵育20 min。置入100 mg/L PI液(1∶1)，放置避光环境下于4 ℃孵育30 min；以300目筛网过滤细胞悬液，弃去粘连的细胞；经流式细胞仪测算DNA含量分布，并进行G₀/G₁、S、G₂/M各期的细胞数及所占比例的分析。

1.4.3 MTT法检测肝癌SMMC-7721细胞的生长率对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，经胰酶消化，按3.0×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96 孔板，每个样本做3个复孔，4 h后，待SMMC-7721肝癌细胞全部贴壁后，加入MTT 20 μL/孔(两种药物按体积1∶1加入，总体积一样)，空白对照为只加入完全培养基，继续放入培养箱中培养 4 h，弃上清，加入10%的SDS(十二烷基磺酸钠)200 μL，过夜。振荡至MTT完全溶解，置于酶联免疫检测仪上，检测490 nm处的吸光度值(A值)，按公式计算细胞生长率，生长率=实验组平均A值/对照组平均A值×100%。取4孔平均数，重复实验3次，取均值。

1.4.4 RT-PCR检测抑癌基因PTEN、p53的mRNA的表达选取处于对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，接种于10 cm²培养皿，置于37 ℃，体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱至90%左右，根据TRIzol法提取总RNA；依据cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。反应结束后将产物cDNA作为PCR反应模板，置于-20 ℃冰箱保存备用。分别扩增PTEN、p53和内参GAPDH。

PCR仪反应参数为：93 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33个循环后终末延伸72 ℃、6 min。通过2%的琼脂糖凝胶电泳提取PCR产物，电泳后置GDSS000凝胶自动成像仪上显像拍照保存图像，紫外线灯下观测电泳结果，Image-Pro Plus 8.0 软件分析条带灰度值，用PTEN、p53/GAPDH代表PTEN、p53 mRNA的相对表达量。

1.4.5 Westem blot检测抑癌基因PTEN、p53的蛋白的表达细胞经胰酶消化后收集，细胞经弃掉培养液后以PBS冲洗3次，进行总蛋白的提取，采用BCA法检测蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白。加入4%体积的BME (β-Mercaptoethenal)，一起煮沸。然后在4 ℃下， 12 000×g离心5 min。蛋白上样，经由10%SDS-PAGE分离胶分离，转印至PVDF膜上。将PVDF膜取出后浸泡入5%脱脂奶粉FIBS液中封闭，于37 ℃下孵育2 h。分别加入1∶1 000稀释的PTEN、p53兔抗人单克隆抗体，4 ℃过夜，次日加入HRP标记羊抗兔IgG二抗，37 ℃摇床孵育60 min。PBS洗涤，采用ECL法检测。暗室曝光X射线片，通过GDSS000凝胶自动成像系统摄像，采用Quantity one图像进行分析研究，PTEN、p53与GAPDH的灰度积分的比值进行分析，作为PTEN、p53蛋白表达的量。以PTEN、p53/GAPDH代表代表PTEN、p53的相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①SMMC-7721细胞生物学形态；②细胞周期检测结果；③MTT法检测肝癌SMMC-7721细胞的生长率；④RT-PCR检测沉默PTEN、p53 mRNA的表达；⑤Westem blot检测沉默PTEN、p53蛋白的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件包处理数据，计量资料均用x(_)±s表示，组间均数比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

癌细胞的扩散是肿瘤形成及发展过程中最危险的步骤，如果癌细胞在远处形成克隆时，常常会致使机体产生严重的后果。对癌细胞的生长、复发及迁移进行研究具有重要意义。许多实验研究证明骨髓间充质干细胞能够迁移且优先在肿瘤部位成活和扩增，并整合至肿瘤组织作为前体细胞发挥修复作用^[18-20]。另有研究表明骨髓间充质干细胞接种到皮下黑色素瘤后，可直接诱发癌细胞凋亡及毛细血管退化，进而抑制肿瘤生长。研究利用骨髓间充质干细胞抑制肿瘤生长的这一特点，将其与多西紫杉醇联用，探讨了它们联合后对肝癌细胞株SMMC-7721的影响作用^[21-22]。

癌症的发生和发展与癌细胞的凋亡失调密切关联，但目前对于癌细胞凋亡机制尚未明确，可能与凋亡蛋白、抗凋亡蛋白、癌基因及抑癌基因的表达相关^[23-24]。抑癌基因的缺失及突变是细胞发生癌变和恶性肿瘤形成及发展的重要机制之一。实验对抑癌基因p53及PTEN进行了研究。p53作为一种抑癌基因，在癌细胞周期变化及细胞凋亡调控中有着重要意义。实验研究发现，p53基因可以在不同生理条件下启动细胞凋亡，因此被当作癌细胞凋亡机制中关键步骤^[25-27]。由于p53蛋白的半衰期较短，在细胞内的降解速度非常快，因而p53在正常细胞中的表达是极弱的，而在肿瘤细胞中呈现高表达^[28-29]。

抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homologon chromosome ten)是近两年从染色体10q23．3区带分离到的一个新的肿瘤抑制基因，又名MMACl或TEPl，参与细胞重组及细胞转移，研究发现，在癌细胞中PTEN基因突变可致其磷酸酶活性增加，进而增强癌细胞的恶性增殖能力，此外，PTEN突变失活，会导致癌细胞凋亡途径受抑制^[30-33]。可见PTEN基因及蛋白的表达变化，与癌细胞的发展、迁移有着密切关系^[34-37]。

多西紫杉醇是是紫杉醇的衍生物，从短叶紫杉的树皮中提取，具有很高的抗癌活性作用，其主要通过作用与细胞的微管系统，干扰微管系统、阻止细胞的有丝分裂，增强其细胞毒性作用，促使肿瘤细胞凋亡，最发挥抗肿瘤作用^[36^，^38-39]。近年来临床研究发现紫杉醇对多种癌症如胃癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、恶性黑色素瘤等具有很好疗效^[40-42]。

研究通过流式细胞技术、MTT法、RT-PCR法及Western blot法对肝癌SMMC-7721细胞进行了实验研究，其结果显示：①流式细胞技术检测结果表明，多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预可以抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，与空白组比较，骨髓间充质干细胞组及联合组处于G₀/G₁期的细胞明显增多，提示多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预可以将肝癌SMMC-7721细胞阻滞于G₀/G₁期；②MTT 检测结果显示，干预48 h后，与空白组比较，骨髓间充质干细胞组肝癌SMMC-7721细胞的生长率得到抑制，与骨髓间充质干细胞组比较，联合组肝癌SMMC-7721细胞的生长率得到显著抑制；③RT-PCR技术检测结果显示，抑癌基因PTEN、p53的m RNA表达量在联合组明显高于空白组及骨髓间充质干细胞组；④Western blot技术检测结果显示，抑癌基因PTEN、p53的蛋白表达量，与空白组及骨髓间充质干细胞组比较，联合组明显上调，各组比较统计学差异显著。以上结果均可证明骨髓间充质干细胞干预可以抑制肝癌SMMC-7721细胞的生长，联合多西紫杉醇作用后效果更佳。对于骨髓间充质干细胞对肝癌的作用，目前国内外的研究还较少，且骨髓间充质干细胞对肿瘤发挥作用的机制与多种因素有关，研究结果可能会存在差异性，因此，研究仅对骨髓间充质干细胞用于体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的影响作用进行了研究，相信还会有许多机制影响肝癌SMMC-7721细胞的生长及转移。

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