猪小肠黏膜下基质海绵的制备

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.010

摘要/Abstract

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文题释义：
小肠黏膜下基质：是一种富含胶原并类似于细胞外基质的天然生物材料，细胞及组织相容性好，机械强度较高，表面形态近似三维状结构，还含多种细胞营养因子，如碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子等。
小肠黏膜下基质海绵：采用冷冻保存、EDC化学交联等方法对小肠黏膜下基质进行改性，制备小肠黏膜下基质海绵支架，支架呈蜂窝状，具有立体结构，结构比较规整，没有极性，孔隙分布均匀，内部和外部的结构一致，没有分层现象，具有均匀的三维孔隙。

背景：研究发现将小肠黏膜下基质直接应用于损伤部位，对体内外细胞的生长、分化还不是非常有效，而且其孔径很小，通透性不良，治疗效果不够理想。
目的：构建小肠黏膜下基质海绵，了解其形态学特征。
方法：采用物理及顺序化学浸泡脱细胞法制备猪小肠黏膜下基质。以不同质量分数的小肠黏膜下基质(1%、2%、3%、4%)，不同浓度的交联剂EDC(50，100，150 mmol/L)制备小肠黏膜下基质海绵，光学显微镜及扫描电镜观察海绵结构。将小肠黏膜下基质海绵(实验组)与小肠黏膜下基质(对照组)分别置入大鼠背部肌肉中，置入1，2，3周后组织学观察组织反应及材料降解。
结果与结论：①以质量分数1%小肠黏膜下基质、100 mmol/L EDC交联制得的小肠黏膜下基质海绵，空间结构弹性好，结构规整，孔径均匀一致，无空洞现象，所以肌肉置入实验选择此组材料；②置入1周后，实验组海绵网孔状结构保持完整，在材料周围可见轻微炎细胞浸润，少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞反应，支架边缘可见周围软组织增殖移行；对照组炎细胞浸润明显，其下创面有粘连，周围软组织增殖移行较少。置入3周后，实验组置入部位炎症基本消退，可见成纤维样细胞及血管成分，胶原纤维束较细小，平行排列，海绵处呈结缔组织样结构；对照组仍然存在炎性细胞浸润，胶原纤维含量较少；③结果表明：小肠黏膜下基质海绵结构合理，具备作为组织工程皮肤支架的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0001-7254-7759(孙慧哲)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 小肠黏膜下基质海绵, 形态学观察, 孔径, 交联

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that small intestinal submucosa that is directly implanted into the lesion cannot effectively promote cell growth and differentiation in vivo and in vitro, because of its small pore size and poor permeability.

OBJECTIVE: To establish the small intestinal submucosa sponge and to explore its morphological characteristics.

METHODS: Porcine small intestinal submucosa was prepared by physiochemical method. Then the small intestinal submucosa with the mass fraction of 1%, 2%, 3% and 4% was cross-linked by 50, 100 and 150 mmol/L 1-ehyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, respectively, so as to obtain small intestinal submucosa sponge, whose morphology was detected by lighting and scanning electron microscope. In the meanwhile, small intestinal submucosa as control group, and small intestinal submucosa sponge as test group were intramuscularly implanted into the back of rats, respectively. At 1, 2 and 3 weeks after implantation, histological changes and implant degradation were observed by hematoxylin-eosin staining.

RESULTS AND CONCLUSION: The small intestinal submucosa sponge, which was prepared by the small intestinal submucosa with the mass fraction of 1% and 100 mmol/L cross-linking agent, had elastic and close space structure, uniform pore size and regular structure, so it was selected as the implant into the muscle. At 1 week after implantation, in the test group, the mesh sponge had the complete structure with few neutrophils, lymphocytes and giant cell reaction, and soft tissue hyperplasia and migration surrounding the implant appeared; in the control group, there were numerous inflammatory cells, and wound adhesion and little migration of surrounding tissues could be found. At 3 weeks, inflammatory cells mostly disappeared, and fibroblast-like cells and vascular components appeared, with thinner and regular collagen fiber bundles, and connective tissue-like structures could be found. In contrast, the control group still had numerous inflammatory cells and few collagen fibers. In conclusion, small intestinal submucosa sponge is a potential material used as the tissue-engineered skin scaffold.

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Key words: Biocompatible Materials, Cross-linking Reagents, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙慧哲，田伟，曾亮，王效杰，王正东，任玥，匡宝平. 猪小肠黏膜下基质海绵的制备[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(21): 3110-3116.

Sun Hui-zhe, Tian Wei, Zeng Liang, Wang Xiao-jie, Wang Zheng-dong, Ren Yue, Kuang Bao-ping . Preparation of the small intestinal submucosa sponge[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(21): 3110-3116.

图/表（结果） 7

2.1 大体观察及苏木精-伊红染色结果

大体观察：交联前，小肠黏膜下基质外观呈白色，柔韧适度，具有许多孔隙，孔与孔之间相互连通；交联后，小肠黏膜下基质成海绵状，韧性强，见图1。

苏木精-伊红染色：光镜下显示，交联前，小肠黏膜下基质存在分层现象，没有均匀的孔隙结构；交联后，小肠黏膜下基质海绵呈蜂窝状，具有立体结构，结构比较规整，没有极性，孔隙分布均匀，内部和外部的结构一致，没有分层现象，具有均匀的三维孔隙(与小肠黏膜下基质对照)，未发现蓝染的核物质和细胞碎片，见图2。

2.2 电镜观察结果交联后，扫描电镜下小肠黏膜下基质海绵材料呈三维网孔状结构，孔间相通，随着小肠黏膜下基质质量分数的升高，出现了小肠黏膜下基质海绵孔径大小和密度的变化。在EDC浓度增加的过程中，海绵内部逐渐从松散过渡为互相交织的现象，形成大量较均匀的三维孔隙，尤其以100 mmol/L显著；但随着EDC浓度的升高，在孔隙交界处出现了空洞，见图3。在小肠黏膜下基质质量分数1%组孔径为100-150 µm，小肠黏膜下基质质量分数2%组孔径大小为150-200 µm，但随着小肠黏膜下基质质量分数的增加，孔径值逐渐下降，而且结构出现松散现象，因此质量分数1%的小肠黏膜下基质以100 mmol/L EDC交联效果较好。

2.3 小肠黏膜下基质海绵经不同浓度EDC交联后的孔径变化随着小肠黏膜下基质质量分数的增加，小肠黏膜下基质海绵孔壁厚度增加，并且出现了孔径大小和密度的变化。当小肠黏膜下基质质量分数为1%时，小肠黏膜下基质海绵孔径大小为(125±25) μm，但随着小肠黏膜下基质质量分数的增加，小肠黏膜下基质海绵孔径值明显减小，而且出现结构松散现象，尤其以质量分数4%时最为显著。通过实验结果可以得出，当小肠黏膜下基质质量分数在1%-2%时，经100 mmol/L EDC交联制得的小肠黏膜下基质海绵空间结构弹性好，结构规整，无空洞现象。小肠黏膜下基质海绵的孔径与正常小肠黏膜下基质比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4，表1。

2.4 免疫原性观察结果术后两组动物状态良好，活动和进食正常，手术切口无红肿、渗血和渗液等，切口一期愈合，无动物死亡，材料周围肌组织均无肿胀、坏死或硬结形成。

置入1周后，可见实验组小肠黏膜下基质海绵网孔状结构保持完整，在材料周围可见轻微炎细胞浸润，少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞反应，支架边缘可见周围软组织增殖移行；对照组炎细胞浸润明显，其下创面有粘连，周围软组织增殖移行较少。置入2周后，实验组大小未见明显变化，材料内部可见较多成纤维样细胞、新生血管，见图5；对照组可见明显的粘连，炎性细胞浸润明显，弹性下降，出现局部降解，新增长上皮层次较少，增生欠活跃。置入3周后，实验组置入部位炎症基本消退，可见成纤维样细胞及血管成分，胶原纤维束较细小，平行排列，海绵处呈结缔组织样结构，见图6A；对照组仍然存在炎性细胞浸润，胶原纤维含量较少，见图6B。

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引言

20世纪80年代以来，组织工程学迅猛发展，大量科研工作者开始将目光集中于新型理想生物材料的开发，希望能够应用于临床器官的修复^[1]。目前生物材料在皮肤、角膜、肌腱、软骨、骨、血管、尿道、神经系统等领域均取得了巨大进展，甚至有一些已应用于临床。组织工程三要素包括种子细胞、支架材料、细胞因子，选取合适的支架材料是构建组织工程组织的关键。天然材料的开发和利用无疑给科学研究提供了一个广阔的空间。研究表明，理想的支架材料应具有良好的生物相容性、可降解性及一定的孔隙率，为种子细胞的增殖分化提供必要的三维空间及力学支撑。猪小肠黏膜下基质是将小肠浆膜层、肌层及黏膜层去除，经一系列加工和消毒处理后，获得的一种不含细胞的细胞外基质，具有与人细胞外基质非常接近的网架结构，是一种理想的组织工程学材料。目前大量研究已证实，猪小肠黏膜下基质可用于临床上多种疾病的治疗^[2]，例如运动系统、消化系统疾病等，它在大型组织缺损修复案例中成效颇为显著，如肌腱、血管、软骨、骨损伤等^[3]。但如将单纯脱细胞方法得到的小肠黏膜下基质直接应用于损伤部位，对于体内外细胞的生长、分化还不是非常有效，而且小肠黏膜下基质的孔径很小，通透性不良，治疗效果不够理想^[4]。实验通过改变结构特性重建了小肠黏膜下基质，构建成具有三维立体结构的小肠黏膜下基质海绵，观察其形态学改变和应用于体内的免疫原性反应，进一步为组织工程皮肤支架材料的构建提供实验依据。

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材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2013年3月至2014年10月在沈阳医学院基础医学院实验中心完成。

1.3 材料猪小肠由河北省蓟州肉食加工公司购买；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)和pepsin胃蛋白酶购自sigma公司；TritonX-100购自美国圣路易斯化工有限公司；Luzex-F实时图象分析系统由中国医科大学提供。

实验动物：12月龄Wistar大鼠10只，雌雄不拘，体质量150-200 g，由中国医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK[辽]2013-0009。

1.4 实验方法

猪小肠黏膜下基质的准备^[^5-6]：取猪的新鲜近段空肠，挑选管腔粗细均匀、管壁无破损、无淋巴结的部位，剪成10 cm肠段，用40 ℃去离子水反复冲洗，采用机械法刮除黏膜层、浆膜层和肌层组织；顺序化学浸泡脱细胞法，以100 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH溶液浸泡16 h，1 mmol/L HCl和1 mmol/L NaCl溶液浸泡6-8 h，含1 mmol/L NaCl的PBS浸泡16 h，PBS浸泡2 h，在含0.1%C₂H₂O₃的体积分数20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05% NaN₃的PBS清洗2 h，期间用去离子水反复冲洗，之后将猪小肠黏膜下基质在-55 ℃冷冻48 h并使用。

猪小肠黏膜下基质海绵的制备：将准备好的小肠黏膜下基质用剪刀剪成1 cm²大小的组织块，放入含有0.2%胃蛋白酶的3%乙酸水溶液中，设置小肠黏膜下基质的质量分数为1%-4%，在37 ℃磁力搅拌器中搅拌72 h，等到小肠黏膜下基质充分溶解以后，倒入培养皿中，在-80 ℃冷冻24 h后，在-55 ℃，1 641 kPa冷冻干燥机中24 h，将小肠黏膜下基质海绵剪成直径1 cm圆形，放入12孔培养板中，分成3组，分别以含有不同浓度EDC(50，100，150 mmol/L)的乙醇水溶液(积比95∶5)交联24 h。交联完成后取出，在40 ℃水浴中反复冲洗，同时取出未反应的小肠黏膜下基质，再次冷冻干燥，并使用环氧乙烷消毒(沈阳市中心医院)，4 ℃冰箱中保存^[7]。

1.5 主要观察指标

猪小肠黏膜下基质海绵的的形态学观察：①取实验制备的各组小肠黏膜下基质海绵，切成1 cm×2 cm大小，观察苏木精-伊红染色后的石蜡切片，以小肠黏膜下基质作对照组。②取部分小肠黏膜下基质海绵材料，离子溅射仪真空镀金，扫描电镜观察表面结构。取不同浓度EDC交联制备的小肠黏膜下基质海绵，行苏木精-伊红染色，3组制作石蜡切片，每组随机抽取10个切片，每个切片选4个视野进行形态学观察。

小肠黏膜下基质海绵孔径大小的测量：取苏木精-伊红染色的石蜡切片，每组随机抽取10个切片，每个切片4个视野，用Luzex-F实时图像分析系统对实验结果进行图像分析，系统测量每孔孔径大小，经统计分析获得小肠黏膜下基质海绵的平均孔径，计算孔径大小及孔径率，以小肠黏膜下基质为对照。

小肠黏膜下基质海绵的置入：取Wistar大鼠30只，用0.4%戊巴比妥麻醉(40 mg/kg)，切开大鼠背部皮肤，钝性分离脊柱两侧肌肉，制备肌肉囊，分别置入大小 1 cm×2 cm的小肠黏膜下基质海绵材料(小肠黏膜下基质质量分数为1%，EDC交联浓度为100 mmol/L)与小肠黏膜下基质材料，缝合肌肉、筋膜及皮肤。置入1，2，3周后，每个时间点取3只大鼠，麻醉后，取出材料及周围肌肉组织，然后处死。组织经中性甲醛液固定，梯度脱水、透明后石蜡包埋，常规切片，切片厚度5 μm，苏木精-伊红染色观察组织反应及材料降解结果。

1.6 统计学分析用SPSS 13.0软件，采用One-way ANOVA对数据进行统计学分析，差异性显著性检验采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

近十几年来，组织工程发展很快，在皮肤、角膜、肌腱、软骨、骨、血管、尿道、神经系统等领域均取得了巨大进展，甚至有一些已被应用于临床。组织工程3要素包括种子细胞、支架材料、细胞因子，选取合适的支架材料是构建组织工程组织的关键。支架材料分为天然生物衍生类、人工合成类及两者的复合物等^[8]。研究表明，理想的支架材料应具有良好的生物相容性、可降解性及一定的孔隙率，为种子细胞增殖分化提供必要的三维空间及力学支撑。在这样的科研氛围中，关于猪小肠黏膜下基质的研究迅速发展起来^[9]。小肠黏膜下基质既可作为理想的细胞支架材料用于组织工程研究又可单纯用于组织缺损的修复。

小肠黏膜下基质是一种富含胶原并类似于细胞外基质的天然生物材料，细胞及组织相容性好，机械强度较高，表面形态近似三维状结构^[10]，还含多种细胞营养因子(如碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子等) ^[11]，可促进细胞的增殖及分裂。但通过大量的研究发现，小肠黏膜下基质的通透性较低，吸水性较低，弹性较差，作为以胶原蛋白为主要成分的薄膜，在修复有大型皮肤损伤中治疗效果较差^[12-13]。为了解决这个问题，本实验采用冷冻保存、EDC化学交联等方法制备小肠黏膜下基质海绵敷料。对小肠黏膜下基质海绵的形态学研究表明，海绵呈三维网孔状结构，而且孔径达到了(175±25) μm，空间结构合理，孔与孔之间存在着大量的交通，孔壁呈薄膜状，随着小肠黏膜下基质质量分数的增加，孔壁厚度增加，孔径则有所减小，而且结构出现松散的现象，尤其以质量分数4%为显著^[14]。

在实验中还观察到交联时间的长短对于支架材料的稳定性也十分重要，这可能与乙醇的对于蛋白的固定作用有关。通过实验发现，交联剂的选择非常关键。戊二醛是最常用的氨基酸交联剂，但戊二醛残留质量浓度在低至3.0 mg/L时仍有毒性，而且也有报道显示戊二醛交联会促进材料钙化，将戊二醛交联的小肠黏膜下基质置入大鼠皮下，其矿化范围和钙浓度显著高于未交联的小肠黏膜下基质矿化范围和钙浓度^[15]。所以实验没有使用戊二醛，而是使用EDC进行交联。EDC是一种新型无毒、生物相容性良好的交联剂，在水溶液或有机溶液中，水溶性EDC能激活胶原的羧基，促发胶原发生交联，而被激活的羧基可与伯胺或羟基反应，形成酰胺键或酯键^[16]；交联过程中EDC不进入最终产物中，利用其交联胶原，使酶无法和胶原分子充分接触，酶的分解作用只能在胶原分子表面进行，不作为连接的一部分滞留在交联物分子中，而是转变为水溶性脲衍生物，这种衍生物具有极低细胞毒性，这样就可避免解聚作用和残留有毒物质的释放^[17-18]。由于EDC的细胞毒性很小，以之作为交联剂制备的支架材料有望在生物相容性及提高细胞形态、功能方面得到优化。而且实验结果中可以看到，EDC对于三维结构的重建起到非常好的效果。

实验制备了海绵状小肠黏膜下基质支架材料，大体观察为乳白色微粒聚合体，经扫描电镜可见到支架内部的纤维互相交织，形成较均匀的大量三维孔隙。大量研究发现，理想的支架材料应无免疫原性、细胞毒性，而炎性细胞浸润无疑对支架本身的生物学特性会有影响^[19-20]。实验制备的小肠黏膜下基质海绵在大鼠体内肌肉表面皮下埋置1周后，可见小肠黏膜下基质海绵网孔状结构保持完整，在材料周围可见轻微炎细胞浸润，部分细胞渗入海绵内部，可见少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨噬细胞反应，实验结果与之前的有关报道类似。Hodde等^[21-23]研究证实小肠黏膜下基质置入宿主体内后，能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主细胞的长入和分化，产生的再生组织在结构和功能上均与原有组织相似，其确切机制不清楚。实验第2周左右，支架内出现大量血管腔，大小不一。大体观察术后各组动物状态良好，活动和进食正常，手术切口无红肿、渗血和渗液等，切口一期愈合，无动物死亡，材料周围肌组织均无肿胀、坏死或硬结形成。Liatsikos等^[24-26]已证明小肠黏膜下基质含有多种调节因子，如糖胺聚糖、纤维连接素、成纤维细胞生长因子和转化生长因子β复合物等，这些因子可为移植部位组织再生提供适宜的激活信号，促进组织生长。实验结果在移植2周后组织生长也较好。

体外实验发现，重新塑形后的海绵状小肠黏膜下基质可促进骨髓间充质干细胞来源软骨样细胞的生长增殖和软骨化，为软骨组织工程的种子细胞提供了适宜的三维生长空间和机械支撑，可成为构建组织工程软骨或修复软骨缺损的新型生物衍生支架材料^[27-28]。

综上所述，作者认为小肠黏膜下基质海绵结构合理，柔韧适度，具有许多孔隙，具备一定程度的弹性，可作为组织工程皮肤的支架。

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