碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化及与肌细胞的共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (6): 877-882.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.010

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碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化及与肌细胞的共培养

翟婧妍¹，段红梅¹，尚俊奎¹，杨朝阳^1，2，李晓光^1，2

¹首都医科大学神经生物学系，北京市 100069；²北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京市 100191

收稿日期:2017-01-16 出版日期:2017-02-28 发布日期:2017-03-16
通讯作者: 李晓光，博士，教授，首都医科大学神经生物学系，北京市100069；北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京市 100191
作者简介:翟婧妍，女，1987年生，黑龙江省哈尔滨市人，首都医科大学在读硕士，主要从事应用生物材料在体外构建神经肌肉接头及其影响的研究。
基金资助:
国家自然科学基金国际合作与交流项目(31320103903)；国家自然科学基金项目(31130022)

Basic fibroblast growth factor-chitosan carrier induces neural stem cells to differentiate into neurons followed by co-culture with myocytes

Zhai Jing-yan¹, Duan Hong-mei¹, Shang Jun-kui¹, Yang Zhao-yang^{1, 2}, Li Xiao-guang^{1, 2}

¹Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China; ²School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China

Received:2017-01-16 Online:2017-02-28 Published:2017-03-16
Contact: Li Xiao-guang, M.D., Professor, Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China; School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China
About author:Zhai Jing-yan, Studying for master’s degree, Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Supported by:
Fibroblast Growth Factor 2; Neurons; Tissue Engineering
Funding: the International Cooperation and Communication Project of National Natural Science Foundation of China, No. 31320103903; the National Natural Science Foundation of China, No. 31130022

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
壳聚糖载体：通过缓慢、持续释放碱性成纤维细胞生长因子长达14周，为细胞分化提供良好生长环境，并且避免了长期多次注射所带来的感染风险及水溶性生物分子的易扩散失效的弊病。
神经干细胞：成年体内中枢神经系统神经干细胞的发现为治疗脑和脊髓损伤、脑卒中、神经退行性疾病等带来了希望。但诱导神经干细胞向神经元分化成为了近年来的研究热点。应用壳聚糖载体能够体外高比例诱导神经干细胞向神经元分化，分化比例达74%。

背景：神经干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，高比例诱导其向神经元分化具有很大的应用前景。
目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体体外对神经干细胞向神经元分化的影响，及分化的神经元与肌细胞共培养是否能形成突触样联系。
方法：纯化后的神经干细胞分别与单纯壳聚糖、可溶性碱性成纤维细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体共培养。诱导7 d后，通过β-tubulinⅢ染色观察向神经元的分化；通过β-tubulinⅢ和ChaT染色观察向胆碱能神经元的分化；通过β-tubulinⅢ和MHC染色观察和肌细胞之间的突触联系。
结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体组，分化形成神经元的比例是74%，显著高于其他2组，分化的神经元与共培养的肌细胞能形成突触样联系。提示碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体体外能够促进神经干细胞的分化，且分化形成的神经元能与共培养的肌细胞形成突触样联系。

ORCID: 0000-0003-4480-3676(李晓光)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 碱性成纤维细胞生长因子, 壳聚糖, 神经干细胞, 肌细胞, 突触, 共培养, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells (NSCs) hold self-renewal and multi-directional differentiation potential. NSCs differentiation into neurons in high proportion under induction conditions exhibits broad application prospect.
OBJECTIVE: To explore the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF)-chitosan carrier on the NSCs differentiation into neurons in vitro, and whether the differentiated neurons could form synaptic-like connection with myocytes.
METHODS: After purification, the NSCs were co-cultured with chitosan, soluble bFGF or bFGF-chitosan carrier. After 7-day induction, the NSCs differentiation into neurons was observed by immunofluorescence staining of beta tubulin III. The NSCs differentiation into cholinergic neurons was observed through double immunofluorescence staining of ChaT and beta tubulin III. The synaptic-like connection between the neurons and myocytes was observed by triple staining of beta tubulin III and MHC.
RESULTS AND CONCLUSION: The percentage of differentiated neurons in the bFGF-chitosan carrier group was 74%, which was significantly higher than that in the other two groups. Additionally, the synaptic-like connection formed between the differentiated neurons and myocytes. To conclude, the bFGF-chitosan carrier promotes the NSCs differentiation into neurons to form synaptic-like connection with the co-cultured myocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

中图分类号:

R318

翟婧妍，段红梅，尚俊奎，杨朝阳，李晓光. 碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化及与肌细胞的共培养[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 877-882.

Zhai Jing-yan, Duan Hong-mei, Shang Jun-kui, Yang Zhao-yang, Li Xiao-guang. Basic fibroblast growth factor-chitosan carrier induces neural stem cells to differentiate into neurons followed by co-culture with myocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 877-882.

图/表（结果） 3

2.1 神经干细胞向神经元的分化体外培养的神经干细胞具有自我更新和多项分化的潜能，在分化培养条件下，能够分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。研究发现，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体组，神经干细胞向神经元分化的比例达74%，大于单纯碱性成纤维细胞生长因子组和单纯壳聚糖组。因此，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体促进神经干细胞向神经元的分化(图1)。

2.2 神经元的形态 3种培养条件下均能诱导分化形成多极神经元、双极神经元和假单极神经元，其中碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体组分化形成的神经元有多级、双极和假单极神经元(图1)。

2.3 神经元的突起生长情况 3种分化条件下，分化的神经元的胞体表面积接近，而其中碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体组神经元具有更多的突起，且突起长度明显高于其他2组。因此，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体促进神经元的生长(图1)。

2.4 神经干细胞分化形成胆碱能神经元碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够高比例诱导神经干细胞向神经元分化。脊髓前角运动神经元为运动传递的最后通路，其为胆碱能神经元。因此，实验进一步探索神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况。研究发现神经干细胞可以分化为ChaT阳性的胆碱能神经元(图2)。

2.5 神经干细胞与肌细胞的共培养正常人体内，脊髓前角运动神经元能够和骨骼肌纤维形成功能性突触，称为神

经肌肉接头^[13-14]。碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体可以诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化。因此，进一步研究碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体培养体系中，神经干细胞和肌细胞是否形成突触样联系。研究发现，神经干细胞分化的神经元能够和肌细胞之间形成突触样联系。因此，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元，且分化形成的胆碱能神经元能够和肌细胞形成突触样联系(图3)。

参考文献

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引言

中枢神经系统损伤后会发生一系列的病理改变，主要包括神经元坏死、轴突变性、髓鞘崩解、胶质瘢痕形成、血管系统破坏、炎性细胞浸润等。这些病理改变营造了一种非常恶劣的环境，不利于轴突的再生和内源性神经发生^[1-2]。中枢神经系统损伤后，胶质瘢痕的形成曾被认为是阻碍轴突再生和神经发生的物理性屏障和化学性屏障^[3-4]。中枢神经损伤后活化的星形胶质细胞和非星形胶质细胞可分泌多种抑制再生的细胞因子，形成不利于再生的微环境^[4-6]。应用神经科学和组织工程学相结合的组织再生策略，尤其是应用生物材料持续向损伤区输送生物活性分子的方法，在动物实验中已经取得了显著的成果^[7]。作者所在实验室前期研究已证实，神经营养因子3-壳聚糖生物材料支架可在体外可以缓慢释放神经营养因子3，长达14周，这为损伤后的再生创造良好的微环境，同时，神经营养因子3-壳聚糖载体能够激活内源性神经干细胞，并促进其向神经元分化，从而在损伤区形成新的神经网络，最终使运动和感觉功能恢复^[8-9]。

碱性成纤维细胞生长因子，即成纤维生长因子2，是成纤维生长因子家族的一员，具有促进神经组织生长发育、血管生成、创伤愈合和组织修复等作用^[10]。作者所在实验室既往研究发现，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够诱导神经干细胞高比例向神经元分化，且分化形成的神经元能够形成功能性神经网络^[11]，并证明碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体通过缓释碱性成纤维细胞生长因子，可能通过上调碱性成纤维生长因子受体1的表达，进而激活ERK/MAPK信号通路，来促进神经干细胞向神经元的高比例分化^[12]。

因此，作者拟进一步研究碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体对体外诱导神经干细胞向神经元分化的形态影响及向胆碱能神经元的分化情况，并通过神经干细胞与肌细胞共培养，探讨神经干细胞分化的神经元和肌细胞之间能否形成新的突触样联系，为下一步应用生物材料修复神经系统损伤提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7月至2016年7月在首都医科大学动物部完成。

1.3 材料新生24 h内Wistar大鼠80只和7 d的Wistar大鼠5只，SPF级，雌雄不限，由首都医科大学实验动物部提供，许可证号：SYXK(京) 2013-0004。所有实验都经首都医科大学实验动物中心批准，并按照首都医科大学实验动物中心和北京实验动物协会的标准执行。

主要试剂及仪器：D-hanks液、DMEM/F12、胎牛血清、马血清购自Gibco公司；B27、胰蛋白酶购自Invitrogen公司；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、青链霉素、左旋多聚赖氨酸、壳聚糖、Ⅰ型胶原酶、DAPI(1∶2 000)购自Sigma公司；正常羊血清购自中杉金桥生物技术有限公司；兔来源抗大鼠β-tubulinⅢ(Tuj1)多克隆抗体(1∶200)来观察神经干细胞向神经元分化、兔来源抗大鼠ChaT多克隆抗体(1∶200)购自 Millipore公司；鸡来源抗大鼠β-tubulinⅢ多克隆抗体(1∶500)、小鼠来源抗大鼠MHC多克隆抗体(1∶50)购自abcam公司；山羊抗小鼠Alexa Fluor 488(1∶200)、山羊抗兔Alexa Fluor 594(1∶200)、山羊抗鸡Alexa Fluor 633(1∶200)、山羊抗鸡Alexa Fluor 488(1∶200)购自Life Technologies公司；超净台购自上海BOXUN净化设备公司；解剖显微镜购自OLYMPUS公司；培养瓶购自COSTAR公司；激光共聚焦扫描显微镜购自Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 神经干细胞的分离培养将新生大鼠冰冻麻醉，体积分数75%乙醇中浸泡30 s消毒，于超净台里剪开背部皮肤，暴露椎骨，吹出脊髓，置于D-hanks液中清洗3次，解剖显微镜下剥离硬脊膜，剪碎脊髓，0.25%胰蛋白酶-EDTA 37 ℃消化5 min，细胞悬液用PBS清洗3次，之后过40 μm的细胞筛，最后以1×10⁵/cm²的浓度种植在含有新鲜培养基的培养瓶中。培养基成分(体积比)：96.8% DMEM/F12，2% B27，0.1%碱性成纤维细胞生长因子(20 μg/L)，0.1%表皮生长因子(20 μg/L)和1%青链霉素。将培养瓶放置于 37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中培养(即为P0)。每两三天半量换液一次，即将细胞悬液离心1 000 r/min，5 min，弃去3/4的培养基，将细胞沉淀轻轻吹打混匀，再加入新鲜培养基。神经干细胞培养1周后，经过细胞的分裂和增殖，形成神经干细胞球。神经球用含0.25%胰蛋白酶的EDTA消化液进行消化和机械分离后，再次以单细胞的形式培养，以1×10⁵/cm²的浓度种植于含新的生长培养基的培养瓶中(即为P1)。重复上述步骤，在神经干细胞培养至第3代时得到纯化的神经球^[11-12]。

1.4.2 神经干细胞的诱导分化取第3代神经球，以350球/cm²的密度中种植于包被有左旋多聚赖氨酸的盖玻片上。单纯壳聚糖组向培养基中加入10 g/L壳聚糖，可溶性碱性成纤维细胞生长因子组向培养基中加入20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体组向培养基中加入10 g/L碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体(自制)。每3 d半量换液1次。

1.4.3 肌细胞的培养取7 d的Wistar大鼠，冰冻麻醉，体积分数75%乙醇中浸泡30 s消毒，于超净台仰卧固定，分离取出后肢的胫骨前肌。放入无菌培养皿中，立即用体积分数70%乙醇漂洗1 min，PBS洗3次。去除筋膜、血管以及脂肪组织。将肌肉块剪成约1 mm³大小，PBS洗3次，吹打后静置1 min，弃掉漂浮物，将剩余物加入离心管中， 2 700 r/min离心1 min。弃上清及漂浮物，重复离心1次，加入0.1%Ⅰ型胶原酶5mL，吹打混匀。37 ℃水浴消化 90 min，每隔10 min振荡一次，肉眼可见被胶原酶消化后的呈絮状肌肉，显微镜下可见单个的肌束结构。将消化产物2 000 r/min离心10 min，取出肌束放到滤网上用PBS冲洗后收集。按1∶5的体积比加入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化40 min，其间反复吹打，加入等体积含20%胎牛血清的培养基终止消化。将消化液移入带烧杯的滤网，将过滤得到液体1 500 r/min离心8 min，弃上清，加入PBS离心洗细胞2次。将2 mL培养液加入试管底部，吹打后制成单细胞悬液，将细胞悬液接种于左旋多聚赖氨酸处理后的培养皿，差速贴壁2次，每次1 h。未贴壁细胞每24 h差速帖壁1次，均接种于左旋多聚赖氨酸处理后的培养皿，共5次。纯化后的细胞进行锥虫蓝染色计数，接种到多聚赖氨酸处理的培养皿中，用含体积分数20%胎牛血清的生长培养基进行培养，3 d后换液，细胞进入对数生长期后每日换液1次。倒置显微镜下每日观察细胞的生长形态。

1.4.4 共培养肌细胞培养5 d后增殖、融合、分化成肌管细胞，与神经干细胞诱导分化的神经元共培养。将神经元细胞密度调整到3×10⁸L^-1，分别种植至还有分化5 d后的肌管细胞的35 mm培养皿中，用含有体积分数2%马血清的DMEM培养基培养，将培养瓶放置于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中培养，每两三天半量换液^[13]。应用Image-Proplus 6.1软件，测量分化神经元的比例和突起长度。

1.4.5 免疫荧光染色 40 g/L多聚甲醛4 ℃固定40 min，0.3% TritonX-100破膜5 min，体积分数1%正常山羊血清室温封闭30min，加入相应一抗，37 ℃孵育2 h，加入相应的荧光二抗，37 ℃避光孵育1 h，DAPI复染核，50%PB-甘油封固，激光共聚焦扫描显微镜下观察。

1.5 主要观察指标神经干细胞分化的神经元比例、细胞形态和肌细胞共培养形成的突触样联系。

1.6 统计学分析所有的数据以x(_)±s表示，统计处理采用SPSS17.0软件包进行单因素方差分析。采用Bonferroni法进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体高比例促进神经干细胞向神经元分化实验发现，应用碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够诱导神经干细胞高比例向神经元分化，分化比例达74%。碱性成纤维细胞生长因子是重要的促有丝分裂因子，具有诱导细胞分化、成熟，促进神经外胚层来源细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞和神经细胞等存活和生长的特性^[10]。碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体，通过缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子，提供了良好的生长环境，促进了神经干细胞的分化。且分化形成的神经元具有更加成熟的形态结构。中枢神经系统损伤常常导致神经元丢失。尽管在某种程度上可能会自发出现新的内源性神经发生，但损伤后的炎性环境不利于形成足够的神经发生。相反，这促进了胶质瘢痕的形成^[15]。胶质瘢痕中的星形胶质细胞和非星形胶质细胞分泌多种抑制再生的分子，如髓磷脂相关蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖^{[4, 16]}。研究人员探究了多种促进神经发生的有效方法，如应用神经组织工程技术，向损伤区持续输送支持神经发生和轴突生长的因子，这些因子在损伤区是不存在的，从而提供了良好的生长环境，为治疗中枢神经系统损伤提供了新的思路^[7]。作者所在实验室已发现，神经营养因子3-壳聚糖生物材料支架能够激活内源性神经发生，促进血管形成和抗炎的作用^[8-9]。

3.2 碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够诱导分化形成胆碱能神经元脊髓前角运动神经元是控制运动的最后公路。脊髓前角运动神经元为胆碱能神经元，对来自下行传导束、脊髓中间神经元和周围感觉神经纤维的突触输入进行整合，进而传递神经冲动到所支配的肌肉，引起肌肉收缩，从而产生运动^[17-26]。

脊髓前角的胆碱能神经元能够和肌细胞之间形成化学性突触联系，即神经肌肉接头。实验首先证明，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化，进而证明分化的神经元能够和肌细胞形成突触样联系。体外证明了，神经干细胞诱导分化的神经元和肌细胞形成的突触样联系，为进一步研究形成神经肌肉接头的形态和功能提供了依据。

3.3 体外构建神经肌肉接头中枢神经系统其他部位的突触在丧失活动后会发生一定的形态结构变化，这些变化反应了某些神经系统退行性疾病的发病机制^[27-30]。而神经肌肉接头是全身最大的突触，是脊髓前角运动神经元和肌纤维之间沟通的桥梁，研究神经肌肉接头的形态和功能改变为研究中枢神经系统其他部位的突触改变提供了重要依据^[31-34]。体外构建神经肌肉接头培养体系，使对神经肌肉接头的研究具有更好的可操作性。研究者已经应用了多种体外构建神经接头形成的培养体系^[13-14]。而应用碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体能够使诱导分化的神经元和肌细胞之间建立突触样联系，这一突触样联系，可能是胆碱能神经元和肌细胞之间形成的神经肌肉接头。因此，后续的研究会对这一结构进行形态和功能上，更加全面的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化及与肌细胞的共培养

Basic fibroblast growth factor-chitosan carrier induces neural stem cells to differentiate into neurons followed by co-culture with myocytes

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