抗菌止血壳聚糖/黄连素多孔干凝胶的制备及其表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (6): 899-905.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.014

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抗菌止血壳聚糖/黄连素多孔干凝胶的制备及其表征

汪芳¹，陈云平¹，苏香萍²

¹三峡大学中医临床医学院附属宜昌市中医医院，湖北省宜昌市 443000；²三峡大学化生学院，湖北省宜昌市 443000

收稿日期:2016-12-04 出版日期:2017-02-28 发布日期:2017-03-16
通讯作者: 陈云平，硕士，主治医师，三峡大学中医临床医学院附属宜昌市中医医院，湖北省宜昌市 443000
作者简介:汪芳，男，1976年生，湖北省五峰县人，汉族，2009年泸州医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事口腔种植修复研究。
基金资助:
宜昌市科技局立项(A11301-57)

Preparation of porous biodegradable chitosan/berberine hydrochloride composite xerogel and its antibacterial and hemostatic properties

Wang Fang¹, Chen Yun-ping¹, Su Xiang-ping²

¹Yichang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Clinical Medical School of Chinese Medicine of China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China; ²Chemistry and Life Science School of China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China

Received:2016-12-04 Online:2017-02-28 Published:2017-03-16
Contact: Chen Yun-ping, Master, Attending physician, Yichang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Clinical Medical School of Chinese Medicine of China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China
About author:Wang Fang, Master, Associate chief physician, Yichang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Clinical Medical School of Chinese Medicine of China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China
Supported by:
the Project of Yichang Science and Technology Bureau, No. A11301-57

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
壳聚糖：是自然界中惟一的一种带正电荷的碱性多糖，具有强止血抗菌性。止血机制如下：首先，壳聚糖能通过本身阳离子特性，吸引具有阴离子特性的红细胞发生粘连聚集反应，从而快速形成血凝块止血；其次，壳聚糖作为大分子物质，在血液中发生聚合反应，形成空间网状结构，可捕获红细胞。另外，壳聚糖止血不依赖于凝血因子和血小板，但其能刺激血小板活化，促进血凝。此外，壳聚糖抗菌谱广，能有效抑制细菌和真菌的增殖，具有抗菌活性高，对哺乳动物毒性低的优势。壳聚糖的抗菌作用主要有以下2种机制：一种是壳聚糖通过吸附在细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，从而起到抑菌杀菌作用；另外一种机制是壳聚糖通过渗透进入细胞体内，吸附细胞体内带有阴离子的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而灭杀细菌。
多孔干凝胶：具较高表面积和相互连通的孔洞结构，是制备吸附剂的首选。壳聚糖可通过很简单的冷冻干燥法制备多孔材料，且壳聚糖分子链上含有许多氨基和羟基等功能基团，是一种绿色吸附剂。壳聚糖加工成多孔状的干凝胶，可吸收大于自身质量20倍的水，同时担载黄连素，能持续稳定释放。

背景：壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性及促凝血性等特点，能促进伤口愈合和组织修复，能担载黄连素并保证其快速稳定释放，可作为良好的抗菌止血材料。
目的：制备可降解壳聚糖/黄连素干凝胶，并表征其体外抗菌止血性能。
方法：利用冷冻干燥法制备壳聚糖/黄连素干凝胶，并通过扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱表征其微观结构，MTT实验探讨其生物相容性，凝血抗菌实验检验其体外凝血抗菌效果。
结果与结论：①壳聚糖/黄连素干凝胶的孔隙率为83.1%-90.5%，72 h后基本完全降解于PBS溶液中；②壳聚糖/黄连素干凝胶的体外凝血能力、体外抗菌性能均强于壳聚糖，且随黄连素含量增高而增强；③壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶的体外抗菌止血效果最佳；④结果表明，壳聚糖/黄连素干凝胶生物相容性较好且具有较强的抗菌止血效果，可应用为抗菌止血材料。

ORCID: 0000-0003-3989-7030(陈云平)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 壳聚糖, 黄连素, 抗菌, 凝血

Abstract:

BACKGROUND: Chitosan (CS) holding a good biocompatibility, biodegradability, antibacterial property and hemostasis effect cannot only promote wound healing and tissue repair, but also exhibit sustained-control release when carrying berberine hydrochloride (Bh). Therefore it functions as an excellent antibacterial and hemostatic material.
OBJECTIVE: To prepare the porous CS/Bh composite xerogel and observe its antibacterial and hemostatic properties.
METHODS: The porous CS/Bh composite xerogel was prepared using freeze-drying method, and its microstructure was characterized by scanning electron microscope and Fourier transform infrared spectrometer. The biocompatibility was detected through MTT assay and the in vitro antibacterial and hemostatic properties were observed through antibacterial test and blood clotting index.
RESULTS AND COCNLUSION: The porosity of the CS/Bh composite xerogel was 83.1%-90.5% and almost degraded after 72 hours of immersion in PBS. The in vitro antibacterial and hemostatic properties of the composite xerogel were significantly better than those of CS, which were enhanced with the Bh content increasing. Additionally, the CS/Bh (10%) composite xerogel showed the best hemostatic and antibacterial abilities in vitro. To conclude, the CS/Bh composite xerogel possesses a good biocompatibility and strong hemostatic and antibacterial abilities, which is a promising postoperative antibacterial and hemostatic material.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Berberine, Anti-Bacterial Agents, Blood Coagulation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

汪芳，陈云平，苏香萍. 抗菌止血壳聚糖/黄连素多孔干凝胶的制备及其表征[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 899-905.

Wang Fang, Chen Yun-ping, Su Xiang-ping. Preparation of porous biodegradable chitosan/berberine hydrochloride composite xerogel and its antibacterial and hemostatic properties[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 899-905.

图/表（结果） 10

2.1 壳聚糖及壳聚糖/黄连素结构表征对比研究壳聚糖、黄连素与壳聚糖/黄连素干凝胶的红外光谱(图1)， 1 500 cm^-1处是芳香环的骨架振动吸收峰^[9]，显示壳聚糖/黄连素干凝胶中存在芳香环结构。

干凝胶的数码照片(图2)显示随着黄连素含量的增加，壳聚糖/黄连素干凝胶的颜色逐渐由浅黄色加深至亮黄色，表明黄连素均匀的分散在壳聚糖中。

图3为壳聚糖及壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶的扫描电镜图片，可知壳聚糖及壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶呈现出多孔洞网络状的物理形貌，孔径为200-300 μm，这种多孔结构是冷冻干燥过程中绝大部分的水分子逸出而引起的体积收缩，其有利于血液的渗透扩散和吸附，为干凝胶快速止血应用提供了基础^[5]。

2.2 干凝胶的孔率及吸水性壳聚糖及壳聚糖/黄连素干凝胶作为抗菌止血材料，其孔率及吸水率反映了其对血液的吸附效果。

由图4可知干凝胶样品孔率处于83.1%- 90.5%之间；对比研究发现，随着黄连素含量的增加，干凝胶孔率之间差异无显著性意义(P > 0.05)。由图5可知，黄连素含量对干凝胶的吸水率有明显影响，当黄连素含量增加到10%时，吸水率由2 400%逐渐增加到2 800%，表明制备的干凝胶具有良好的亲水性，同时也表明黄连素混入壳聚糖多孔结构中，影响了壳聚糖的空间结构，改善了壳聚糖干凝胶的亲水性。

2.3 干凝胶的降解率和生物相容性图6显示在37 ℃，壳聚糖、壳聚糖/黄连素(质量百分比为1%)、壳聚糖/黄连素(质量百分比为5%)及壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)凝胶浸入PBS(pH=7.4)溶液中48 h，其降解率分别为90.1%，89.8%，84%和85.5%；至72 h时，所有样品降解率基本为100%，这表明干凝胶在体外的降解速率非常快。Freier等^[10]报道，壳聚糖主要由溶菌酶降解，而生物体内同时存在多种酶，因此干凝胶在生物体内将会降解的更迅速更完全^[11]。

细胞毒性是检测材料生物相容性的重要指标之一。MTT比色法具有灵敏度高、重复性好、操作简便和数据客观等优点，是一种检测细胞存活和生长的方法，常用来测定材料细胞毒性，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，来间接反映活细胞的数量。图7是Hela细胞分别与壳聚糖及壳聚糖/黄连素干凝胶试样共培养24，48，72 h后的MTT结果。对比研究3个时间点的 Hela细胞活性，结果显示，随着时间的增加，与同一试样共培养的Hela细胞活性显著增加，其差异有显著性意义(P < 0.05)；在同一时间点，不同试样壳聚糖/黄连素与试样壳聚糖相比较，Hela细胞活性差异有显著性意义(P < 0.05)，这表明壳聚糖及壳聚糖/黄连素干凝胶均具有良好的生物相容性。

2.4 壳聚糖/黄连素干凝胶中黄连素累计释放率图8A，B分别为3种壳聚糖/黄连素干凝胶在3 d内的黄连素累积释放量和黄连素累计释放率曲线。t为24 h时，黄连素累积释放量(mg/g)分别为3.292，10.905，16.020；至72 h时，累计释放量(mg/g)分别为6.75，19.1，26.5。随后，各样品的黄连素释放率明显减慢。而由图6可知，样品在72 h已基本降解完全，因此，所制备样品装载黄连素在72 h内全部释放，同时可知其真实质量分数分别为0.675%，1.91%，2.65%。结合制备方法，可知制备中黄连素损失率分别为32.5%，63.8%，73.5%。

2.5 壳聚糖及壳聚糖/黄连素的抗菌活性由图9可知，壳聚糖/黄连素干凝胶对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(St.aureus)的抑菌活性均强于壳聚糖；随着黄连素含量的增加，培养基表面试样周围抑菌圈直径呈增大趋势，表明壳聚糖/黄连素干凝胶具有明显抑菌效果，且壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶对E.coli和St.aureus的抑菌性能最强；此外，对比E.coli和St.aureus抑菌圈发现，壳聚糖/黄连素对E.coli的抑菌效果强于St.aureus。以上结果证实制备的样品具有良好的抑菌性能，且黄连素的存在使供试样品抑菌性能显著提升。

2.6 凝血测试结果以体外凝血指数为考察指标，评估壳聚糖及壳聚糖/黄连素的体外凝血效果。如图10所示，相对于对照组，壳聚糖/黄连素干凝胶的体外凝血指数最高；随着黄连素含量的增加，壳聚糖/黄连素凝胶的体外凝血指数值逐渐减小，表明黄连素与壳聚糖结合后，干凝胶的凝血效果显著增强(P < 0.05)。由图10中内嵌照片可以看出，壳聚糖凝胶对血液的凝集最少，壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶上凝血最多，同时体外凝血指数最低，这表明血液在壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)上更容易形成血栓，凝血效果最好。

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引言

材料方法

1.1 设计体外材料形貌观察与生物安全性评价实验。

1.2 时间及地点于2015年6月至2016年3月在三峡大学化生学院实验室完成。

1.3 材料壳聚糖(M_n=56.3×10⁵，脱乙酰度91%)由青岛海汇生物工程有限公司提供；盐酸黄连素(成都贝斯特试剂有限公司)；大肠杆菌(E. coli，ATCC 35218)；金黄色葡萄球菌(St. aureus，ATCC 26113)；DMEM培养基(美国GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；冷冻干燥机(LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司)；扫描电镜(5600LV，日本电子株式会社)；反射傅里叶变换红外光谱仪(IFS 66V/S，Bruker)；紫外分光光度计(德国耶拿分析仪器股份公司)；NU-4750E型二氧化碳培养箱(Nu Aire公司)；CT15RT高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；Thermo全波长酶标仪(芬兰，Tecan Inpinifetm 200)；Hela细胞(上海中科院细胞库)。

1.4 实验方法

1.4.1 干凝胶的制备将壳聚糖粉末溶于2%(体积比)的醋酸溶液制得质量百分比为2%的壳聚糖醋酸溶液，将一定量的黄连素粉末(质量百分比为1%，5%，10%，相对于壳聚糖)溶解在10 mL水中，超声分散10 min后，逐滴滴加到壳聚糖醋酸溶液中，恒温搅拌24 h。然后将20 mL溶液注入直径为10 cm的玻璃培养皿使其分布均匀后在-70 ℃下冷冻2 h，接着转入冷冻干燥机中真空条件下(低于20 Pa)冷冻干燥 48 h得到多孔的壳聚糖/黄连素干凝胶。纯壳聚糖干凝胶制备方法同上。将多孔的壳聚糖和壳聚糖/黄连素干凝胶浸泡于含少量NaOH的无水乙醇中，轻微振荡后取出用无水乙醇反复漂洗直到pH达到中性，然后真空干燥 4 h，待表征。

1.4.2 扫描电镜观察对冷冻干燥法制得的壳聚糖及壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶表面喷金后，利用扫描电镜进行形貌观察。

1.4.3 傅里叶变换红外光谱(FTIR) 黄连素及冷冻干燥得到的壳聚糖、壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶用KBr压片后经傅里叶变换红外光谱仪检测得到红外特征光谱图。

1.4.4 孔率检测取干凝胶样品，称质量m₀；取比重瓶，加满无水乙醇，称质量m₁；加入样品，去除多余的乙醇，称质量m₂；移除样品，称质量m₃；按以下公式计算孔隙率率：孔率(%)=[(m₂-m₃-m₀)/ρ_e]/[(m₁-m₃)/ρ_e]；式中，ρ_e为无水乙醇的密度；(m₂-m₃-m₀)/ρ_e为凝胶样品孔的总体积；(m₁-m₃) /ρ_e为凝胶样品(包括孔)的总体积。

1.4.5 吸水率检测取干凝胶样品，称干质量m₀；然后浸入PBS中0.5 h，取出样品，用滤纸去除样品表面溶液，称质量m₁；按以下公式计算吸水率：吸水率(%)=[(m₁-m₀)/ m₀]×100%。

1.4.6 降解率检测称取20 mg左右壳聚糖、壳聚糖/黄连素干凝胶样品各9个(m₀)，浸入50 mL PBS中，置入恒温振荡箱中，在37 ℃条件下，30 r/min持续温和振荡；每天随机取3个样品蒸馏水漂洗后冻干，称质量(m_t)，共持续3 d。按以下公式计算样品降解率：降解率(%)=[(m₀-m_t)/ m₀]×100%。

1.4.7 标准曲线的绘制在实验条件下黄连素的最大吸收峰位于350 nm处，此处壳聚糖的吸收值远远小于药物吸收值，故实验采用350 nm为测量波长。在测量波长λ＝ 350 nm条件下，进行不同浓度(x)黄连素溶液吸光度(y)的测定，绘制出标准曲线，得到黄连素的标准曲线方程为y=17.727x(R=0.999 9)。

1.4.8 体外药物释放测试称取干燥试样M₀(约10 mg)，分别置入盛有25 mL PBS(pH=7.4)的烧杯中，封紧烧杯，于37 ℃恒温振荡箱中30 r/min持续温和振荡，每隔一定时间取5 mL释放液，在350 nm波长处测其吸光度，并补充相同体积相同温度的PBS。根据药物浓度-吸光度标准曲线读出某时刻t 取出的缓冲溶液中药物的浓度，并按以下公式计算该时刻的累积释放量：累计释放量(mg/g)=M_t/M₀；式中，M_t为t时刻黄连素释放量；M₀为最初样品的质量。

1.4.9 抗菌实验将受试菌种(E.coli、St.aureus)接种于固体培养基中，37 ℃下活化24 h。用接种环挑取活化后的菌苔置于生理盐水中，制成A_610nm为0.485、0.415的菌悬液备用。将若干制备好的直径为10 mm的圆形干凝胶样品(壳聚糖、壳聚糖/黄连素)分别浸入0.1 mol/L PBS中，随后于紫外线消毒灯下照射30 min。取菌悬液1 mL 均匀涂抹在培养基平皿表面，用无菌镊子将各样品贴在含菌平皿上，每皿贴1个。37 ℃条件下培养(E.coli、St.aureus)24 h，测定抑菌圈直径。

1.4.10 体外凝血指数测试根据Shih M.F.的研究结果，采用体外凝血指数考察干凝胶样品的体外凝血效果。参照文献[8]的方法：采集家兔心脏血液，加入抗凝血剂柠檬酸钠(血液与抗凝血剂的体积比为 9︰1)待用。将干凝胶样品制成约1 cm²正方形块，平置在100 mL烧杯中央，放入水浴锅中37 ℃下恒温5 min，取0.1 mL制备的家兔新鲜血液(1 mL血液中加入0.08 mL 0.2 mol/L CaCl₂溶液)逐滴滴加并覆盖样品表面，恒温振荡10 min后缓慢滴加50 mL去离子水，37 ℃恒温下100 r/min持续振荡5 min，随后取出溶液用紫外分光光度计在415 nm波长下测其吸光度值(A)。将0.1 mL血液用去离子水稀释为50 mL后的吸光度值(A)假定为100做参考值，则凝血指数=100×A_样品/A_参考，凝血指数越低，凝血效果越好。

1.4.11 Hela细胞培养用含有体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基培养Hela细胞，置于体积分数为5% CO₂，37 ℃培养箱中孵育，待细胞生长至80%-90%时用0.25%胰酶消化传代，选择对数生长期细胞进行实验。

1.4.12 MTT检测细胞活力分别将纯壳聚糖和壳聚糖/黄连素样品置于24孔板内，各孔加入1 mL细胞悬液(1×10⁷个)于样品表面。细胞贴壁后，每孔加入100 µL 5 g/L MTT，37 ℃下孵育4 h，吸弃上清液，加入750 µL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，吸取200 µL移入96孔板中，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值(A值)。然后以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制柱状图。

1.5 主要观察指标壳聚糖及壳聚糖/黄连素干凝胶的形态结构表征及体外抗菌性、凝血效果、细胞毒性等。

1.6 统计学分析所有数据结果采用SPSS13.0统计分析软件进行两样本均数t 检验分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在临床外科手术后，特别是口腔门诊小手术后，常需要快速、有效控制出血，防止细菌感染。常规止血方法有人工挤压，烧灼术和伤口缝合，但这些方法有时候并不能有效快速止血，导致伤口感染。术后止血材料多为天然可降解材料，如明胶海绵、纤维蛋白胶原、胶原海绵等，但其止血能力依赖于足量的血小板和抗凝血因子，且不能防止细菌感染，其应用受到一定的限制^[12]，因此具有抗菌活性的止血材料显得非常重要。

壳聚糖是一种碱性带正电荷多糖，其线性结构上含有活跃的羟基和氨基基团，具有极佳的吸附作用；同时，其源自生物体内，具有无毒性、良好生物相容性、抗菌消炎、止血、减少创面渗出和促进创伤组织再生、修复、愈合的作用，易于形成凝胶以及可自然降解，可作为良好的止血抗菌材料。自Malette等^[13]报道了壳聚糖止血功能以来，学者们开始研究壳聚糖止血机制，并尝试研制壳聚糖止血敷料。研究表明壳聚糖主要通过与红细胞表面交联，使红细胞黏附，引起红细胞聚集，从而止血。首先，壳聚糖能通过本身阳离子特性，吸引具有阴离子特性的红细胞发生粘连聚集反应，从而快速形成血凝块止血；其次，壳聚糖作为大分子物质，在血液中发生聚合反应，形成空间网状结构，可捕获红细胞。另外，壳聚糖止血不依赖于凝血因子和血小板，但其能刺激血小板活化，促进血凝^[14]。壳聚糖作为一种天然抗菌剂，抗菌谱广，能有效抑制细菌和真菌的增殖，具有抗菌活性高，对哺乳动物毒性低的优势。壳聚糖的抗菌作用主要有以下2种机制：一种是壳聚糖通过吸附在细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，从而起到抑菌杀菌作用；另外一种机制是壳聚糖通过渗透进入细胞体内，吸附细胞体内带有阴离子的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌^[15]。

黄连素作为传统中药，是一种具有很强抑菌能力的天然抗菌素^[6]，其抗菌谱广，其中对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有较强的抑菌作用，低浓度时抑菌，高浓度时杀菌^[16]。实验结合壳聚糖与黄连素的优势，通过冷冻干燥法制备壳聚糖/黄连素止血抗菌干凝胶，孔洞大小一致，且分布均匀，其孔率为83.1%-90.5%；多孔材料具有较高的表面积和相互连通的孔洞，因而具有很强的吸附性能^[5]，故制备的壳聚糖/黄连素干凝胶可大量吸附血液，形成血凝块；壳聚糖/黄连素干凝胶吸水性能强，随着黄连素含量的增加，吸水率由2 400%增加到2 800%，表明应用干凝胶可吸收大量水，使得伤口保持良好的湿润状态，易与伤口接触，更好的发挥止血作用，加速伤口封闭和愈合^[5,15]。体外凝血实验显示随着黄连素含量的增加，壳聚糖/黄连素干凝胶的体外凝血指数值逐渐减小，表明黄连素与壳聚糖结合后，干凝胶的凝血效果显著增强(P < 0.05)。由壳聚糖凝血机制可知^[14]，壳聚糖/黄连素干凝胶止血时，多孔海绵结构使它能够吸收超过自重多倍的血液，巨大的表面积可以促进血小板的聚集；黄连素离解带正电荷，与壳聚糖协同增强了干凝胶对具有阴离子特性的红细胞的吸附；同时，部分黄连素与壳聚糖复合反应，影响了壳聚糖分子链的空间结构，从而诱导更多的红细胞黏附，加快了止血。而由图10中内嵌照片可以看出，壳聚糖凝胶对血液的凝集最少，壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶上凝血最多，体外凝血指数最低，显示血液在壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)更容易形成血栓，凝血效果最好，表明制备的壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶具有强止血性能。

壳聚糖/黄连素干凝胶还具有极佳的生物降解性能，72 h基本完全降解；有研究显示壳聚糖在生物体内通过溶菌酶作用，将大分子壳聚糖水解成低分子壳聚糖和葡萄糖胺，可被吸收或者代谢出体外^[17-18]，这表明壳聚糖具有极佳的生物相容性。MTT实验结果证明壳聚糖/黄连素干凝胶试样与Hela细胞共培养24，48，72 h后，Hela细胞活性显著增加，其活性差异有显著性意义(P < 0.05)，表明壳聚糖/黄连素干凝胶降解产物无刺激性，具有良好的生物相容性^[17-18]。

随着干凝胶的降解，黄连素逐渐释放，至72 h干凝胶降解完全，黄连素也完全释放。此外，壳聚糖/黄连素干凝胶填塞伤口，形成一个固定血凝块的牢靠栓塞，借此防止可能出现的由于血凝块收缩引起的继发性裂隙，或者因污染造成的细菌感染。这表明壳聚糖/黄连素干凝胶在创口局部环境内可快速降解，黄连素快速稳定释放，使得黄连素能短期持续维持在一个较高浓度。壳聚糖降解产物吸附在细菌表面形成高分子膜，阻止细菌对营养物质的摄取，而降解的小分子壳聚糖通过渗透进入细菌内，导致菌体内胞质絮凝，干扰细菌正常的生理活动^[19]。同时，局部高浓度黄连素也具有强抗菌作用，因而二者协同，可以起到更强的抗菌效果。研究体外抗菌实验结果也证实壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)对E.coli和St.aureus的抑菌性能最强，并在止血过程中起到抗菌作用，可以防止创口化脓，促进创口的快速愈合。此外，干凝胶彻底降解产物小分子壳聚糖可被人体吸收，因而无需再次打开创口取出，这对于医患双方来说，都是安全、高效和无痛苦的^[20]。

综上，制备的壳聚糖/黄连素具有极佳的生物相容性，生物降解性能，并具有强止血抗菌效果，且壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)止血抗菌效果最佳，这表明壳聚糖/黄连素(质量百分比为10%)干凝胶是一种安全有效可快速降解的生物止血材料，但其进一步应用及其止血抗菌机制，则需要进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

抗菌止血壳聚糖/黄连素多孔干凝胶的制备及其表征

Preparation of porous biodegradable chitosan/berberine hydrochloride composite xerogel and its antibacterial and hemostatic properties

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