碳/碳复合材料表面掺镁羟基磷灰石生物涂层的体外性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.34.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (34): 5443-5448.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.34.006

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碳/碳复合材料表面掺镁羟基磷灰石生物涂层的体外性能

倪昕晔¹，熊信柏²，尤瑞金³，吴兴盛⁴，李万帅⁵

¹南京医科大学附属常州第二人民医院，江苏省常州市 213003；²深圳大学材料学院，广东省深圳市 518060；³解放军第180医院，福建省泉州市 362000；⁴台湾新光吴火狮纪念医院，台北 11101；⁵常州杰傲医学检验所有限公司，江苏省常州市 213000

收稿日期:2017-08-23 出版日期:2017-12-08 发布日期:2018-01-04
通讯作者: 倪昕晔，南京医科大学附属常州第二人民医院，江苏省常州市 213003
作者简介:倪昕晔，男，1975年生，江苏省启东市人，汉族，2012年南京航空航天大学毕业，博士，副研究员，主要从事生物材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助(51672178)；常州市社会发展项目(CJ20160029)；江苏省自然科学基金(BK20151181)；常州市卫生高层次人才资助项目(2016CZLJ004)

In vitro properties of magnesium doped hydroxyapatite coating on the surface of carbon/carbon composites

Ni Xin-ye¹, Xiong Xin-bo² , You Rui-jin³, Wu Xing-sheng⁴, Li Wan-shuai⁵

¹Second People’s Hospital of Changzhou, Nanjing Medical University, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China; ²College of Materials Science and Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, China; ³the 180^th Hospital of PLA, Quanzhou 362000, Fujian Province, China; ⁴Xinguang Wu Ho Su Memorial Hospital of Taiwan, Taibei 11101, China;⁵GoPath Diagnostic Laboratory Co., Ltd., Changzhou 213000, Jiangsu Province, China

Received:2017-08-23 Online:2017-12-08 Published:2018-01-04
Contact: Ni Xin-ye, Second People’s Hospital of Changzhou, Nanjing Medical University, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China
About author:Ni Xin-ye, M.D., Associate researcher, Second People’s Hospital of Changzhou, Nanjing Medical University, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51672178; the Social Development Program of Changzhou City, No. CJ20160029; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20151181; the High-Level Talent Fund of Changzhou Municipal Health Department, No. 2016CZLJ004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

碳/碳复合材料：是碳纤维及其织物增强的碳基体复合材料，具有低密度(<2.0 g/cm³)、高强度、高比模量、高导热性、低膨胀系数、摩擦性能好，以及抗热冲击性能好、尺寸稳定性高等优点，是如今在1 650 ℃以上应用的少数备选材料，最高理论温度更高达2 600 ℃，因此被认为是最有发展前途的高温材料之一。

划痕实验：是一种常用的测量涂层结合强度和失效形式的实验方法，用一个针头逐渐增加载荷时在涂层表面连续划行，当涂层出现明显剥落或者涂层被完全划穿时所加载的载荷力就是涂层的结合力。

背景：前期研究利用电磁感应沉积法在碳/碳复合材料表面成功制备了含镁的羟基磷灰石涂层，分析了不同感应沉积时间对含镁羟基磷灰石涂层形貌的影响。

目的：进一步探讨碳/碳复合材料表面掺镁羟基磷灰石涂层的体外性能。

方法：在碳/碳复合材料表面分别制备羟基磷灰石涂层(对照组)与掺镁羟基磷灰石涂层(实验组)。①体外溶解性：将含两种涂层的碳/碳复合材料分别浸泡于DMEM低糖培养基中，检测浸泡前后的涂层表面形貌、离子浓度及涂层结合力；②细胞相容性：将含两种涂层的碳/碳复合材料分别与小鼠骨髓间充质干细胞共培养6 d，扫描电镜观察细胞增殖。

结果与结论：①浸泡1 d后，两组涂层表面已有沉积物形成，实验组涂层表面沉积物多于对照组；浸泡6 d后，实验组涂层表面被沉积物完全覆盖，对照组涂层表面沉积物还有部分空隙存在。浸泡6 d后，两种涂层表面沉积物含有钙和磷元素，且实验组涂层表面新生涂层的镁离子含量明显高于对照组；②浸泡6 d后，对照组涂层表面的钙、磷、镁离子浓度逐渐降低；实验组涂层表面的钙、磷离子浓度逐渐降低，镁离子浓度逐渐升高，且实验组涂层表面镁离子浓度高于对照组(P < 0.05)；③实验组浸泡前及浸泡6 d后的涂层结合力均高于对照组(P < 0.05)；④实验组表面骨髓间充质干细胞的增殖能力强于对照组；⑤结果表明，掺镁羟基磷灰石涂层具有较好的结合力与细胞相容性。

ORCID: 0000-0002-2402-9719(倪昕晔)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 碳/碳复合材料, 羟基磷灰石, 涂层, 结合力, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In the early study, hydroxyapatite coatings containing magnesium (Mg-HA) were successfully prepared on the carbon/carbon composite surface by electromagnetic induction deposition. The effects of different induction deposition time on the morphology of Mg-HA coating were analyzed.

OBJECTIVE: To investigate the in vitro properties of Mg-HA coating on the carbon/carbon composites.

METHODS: HA (control group) and Mg-HA (experimental group) coating were prepared on the surface of carbon/carbon composites. (1) In vitro solubility: Carbon/carbon composites with different coatings were immersed in low-glucose DMEM medium, and surface morphology, ion concentration, and coating adhesion were tested before and after immersion. (2) Cytocompatibility: Carbon/carbon composites with different coatings were respectively cultured with mouse bone marrow mesenchymal stem cells for 6 days, and cell proliferation was measured by scanning electron microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) One day after soaking, sediments formed on the coating surface in both groups, but there were more sediments in the experimental group than the control group. Six days after soaking, the sediments completely covered the coating surface in the experimental group, while there were still some gaps in the control group; Ca and P were both detected on the coating surface in the two groups, and the Mg content on the coating surface was obviously higher in the experimental group than the control group. (2) Six days after soaking, the concentrations of Ca, P and Mg in the control group continued to fall; in the experimental group, the concentrations of Ca and P were also reduced gradually, but the Mg concentration arose gradually. Moreover, the Mg concentration was significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). (3) The bonding strength of the coating in the experimental group was higher than that in the control group before and after 6 days soaking. In summary, the Mg-HA coating has better bonding strength and cell compatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydroxyapatites, Magnesium, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

倪昕晔，熊信柏，尤瑞金，吴兴盛，李万帅. 碳/碳复合材料表面掺镁羟基磷灰石生物涂层的体外性能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(34): 5443-5448.

Ni Xin-ye, Xiong Xin-bo,You Rui-jin, Wu Xing-sheng, Li Wan-shuai.

In vitro properties of magnesium doped hydroxyapatite coating on the surface of carbon/carbon composites

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(34): 5443-5448.

图/表（结果） 9

2.1 涂层的形貌通过扫描电镜观察，纯羟基磷灰石涂层由十余根棒构成一束，每根棒状晶体直径约为50 nm，长约500 nm，呈稻穗状(图1A)；掺镁羟基磷灰石涂层由 5-10根棒构成一束，每根棒状晶体直径约为50 nm，长约 350 nm(图1D)。有研究认为一定数量尺寸的微孔有利于细胞的生物代谢的吸收和黏附^[16]。

图1B、C、E、F为涂层于DMEM 培养液中浸泡后的扫描电镜照片，图2为能谱分析图谱，浸泡1 d后，两涂层表面已经有沉积物形成，实验组涂层表面沉积物多于对照组；浸泡6 d后，实验组涂层表面被沉积物完全覆盖，而对照组涂层表面沉积物还有部分空隙存在。经图2的能谱分析(6 d后)得到，两种涂层表面沉积物含有Ca和P元素，表明涂层表面有类骨磷灰石形成，且实验组新生涂层的镁离子含量明显高于纯羟基磷灰石涂层。对照组和实验组涂层表面类骨磷灰石的Ca/P比分别为1.667和1.535。

2.2 涂层的X射线衍射图图3为X射线衍射检测到两组涂层浸泡前后的数据，涂层是由小尺寸晶粒和镁离子构成，涂层浸泡前后X射线衍射衍射图谱几乎出现羟基磷灰石晶面所有的特征衍射峰[(002)、(211)、(210)、(112)、(202)、(300)、(222)、(213)]。

浸泡前，实验组涂层28.032(102)和28.841(210)处的主X射线衍射峰相互靠拢，与对照组涂层相比间距缩小了0.08°；实验组涂层32.117(112)和(300) 32.814处的主X射线衍射峰逐渐靠拢，与对照组涂层相比间距缩小了0.04°，这是因为镁离子取代钙离子，镁离子半径为0.078 nm，小于钙离子半径(0.106 nm)，从而引起晶面间距变小。

浸泡后同一时间内，与对照组涂层相比，实验组涂层衍射峰(002)2θ的角度均向右偏移了0.04°，造成这一现象的原因是：镁离子掺杂入晶格内部，导致衍射峰发生偏移。

2.3 涂层浸泡后DMEM培养基的离子浓度涂层浸泡前后DMEM培养基中的离子浓度见表1所示。浸泡1 d后，对照组培养基中钙离子、磷离子质量浓度下降，镁离子质量浓度稍有下降；实验组培养基中钙离子、磷离子质量浓度下降，镁离子质量浓度上升。浸泡3 d后，对照组培养基中钙离子、磷离子质量浓度继续下降，镁离子质量浓度继续轻微下降；实验组培养基中钙离子、磷离子质量浓度继续下降，镁离子质量浓度继续上升。浸泡6 d后，对照组培养基中钙离子、磷离子质量浓度继续下降，镁离子质量浓度继续轻微下降；实验组培养基中钙离子、磷离子质量浓度继续下降，镁离子质量浓度继续上升。对照组浸泡1，3，6 d后培养基中的镁离子质量浓度与DMEM培养基比较差异无显著性意义(P=0.938，0.872，0.761)，实验组浸泡3，6 d后培养基中的镁离子质量浓度高于DMEM培养基(P=0.02，0.01)。

两种涂层浸泡后培养基中的钙离子、磷离子质量浓度下降，与涂层表面类骨磷灰石形成从而消耗了培养基钙离子、磷离子有关；实验组培养基中镁离子质量浓度升高与掺镁羟基磷灰石涂层缓慢释放镁离子有关，因为镁离子替代钙离子可能会导致晶格缺陷或不稳定，所以修饰过的涂层更容易溶解^[17]，形成了含高浓度钙离子、磷离子、镁离子的培养基，最终使得在这种培养基中沉积的类骨磷灰石中也含有更多的镁离子。

2.4 划痕实验测量涂层结合力通过划痕测试得到碳/碳复合材料表面涂层的黏合强度，划痕法是一种常用的测量涂层结合强度和失效形式的实验方法，用一个针头逐渐增加载荷时在涂层表面连续划行，当涂层出现明显剥落或者涂层被完全划穿时所加载的载荷力就是涂层的结合力。图4为浸泡前两组涂层的临界载荷曲线，对照组和实验组涂层的临界载荷分别为95，100 N，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，以往研究中在羟基磷灰石涂层中掺杂其他元素有可能会提高涂层结合力^[18]。

图5为两组涂层浸泡不同时间后划痕的光学形貌图，图6是相对应的临界载荷值，对照组和实验组涂层浸泡第1天的临界载荷分别为80，93 N，第3天的临界载荷分别为97，109 N，第6天的临界载荷分别为100，115 N，实验组涂层的临界载荷始终高于对照组(P=0.004，0.011，0.007)。除了浸泡第1天结合强度降低外，另外时间点观察到的结合力是提升的，这与陈海波等^[19]观察到的涂层结合力持续降低结果有所不同，也有可能与他们采用的等离子喷涂技术有关^[20]。此次研究使用的是电磁感应沉积法，在制备过程中没有高温产生，不会在涂层中产生内应力，使得涂层在培养基中更稳定，不易溶解。浸泡第1天后涂层结合力下降，因为在模拟体液环境中，羟基磷灰石涂层会发生一定程度的溶解^[21]；浸泡3，6 d后涂层结合力的提高，与在原始涂层上产生新的类骨磷灰石涂层有关，而掺镁羟基磷灰石涂层结合力提升的更快原因有可能与其表面类骨磷灰石涂层形成更快有关，因为其表面已被类骨磷灰石涂层完全覆盖，这些类骨磷灰石涂层与原始涂层一起构成了新的涂层。

2.5 骨髓间充质干细胞的增殖结果实验观察了掺镁羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞增殖的影响，在实验组涂层上的细胞增殖速度显著快于对照组(图7)，含镁涂层能够显著加快骨髓间充质干细胞的生长，可能与掺镁涂层和真实骨都含有一定量的镁离子有关^[6]。研究发现与纯羟基磷灰石表面相比，掺镁羟基磷灰石涂层表面更能促进前成骨细胞的体外成骨分化，在骨愈合早期能提高种植体骨结合力^[22]。将纯镁棒和不锈钢棒分别植入大鼠股骨骨髓腔，2周后纯镁棒可诱导更多的新骨形成且总骨体积更多^[23]。Nakano等^[24-26]认为TRPM7 通道(瞬时受体电位M型7)可调节成骨细胞内镁的平衡，促进镁离子内流，增加成骨细胞增殖和迁移。骨髓间充质干细胞增殖分化的相关机制也成为国内外研究的热点^[27-28]。

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年1月至2017年1月在南京医科大学附属常州第二人民医院放疗物理实验室完成。

1.3 材料碳/碳复合材料为江苏天鸟高新科技有限公司(China)生产的2.5维PAN基碳/碳复合材料，将其制成直径1.2 cm、高度0.4 cm的圆柱体。

主要试剂及仪器：DMEM低糖培养基(GIBCO公司)；SUPRA55 型扫描电镜(德国蔡司公司)；D8 型X射线衍射仪(德国布鲁克)；原代小鼠骨髓间充质干细胞(美国ScienCell公司)；CSM Revetest型划痕仪(瑞士CSM公司)。

1.4 实验方法

羟基磷灰石涂层的制备：取碳/碳复合材料，进行电磁感应沉积，感应加热沉积装置为武进振奥高频机械厂生产的ZAG-15 KW高频机，工作频率为15 kHz，实验组将Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、NH₄H₂PO₄混合在蒸馏水中，使得Ca、Mg、P离子的浓度分别为0.08，0.06，0.048 mol/L^[4]，利用电磁感应沉积2 h后获得掺镁羟基磷灰石涂层。为了便于比较，将不含有镁离子的羟基磷灰石涂层作为对照组，沉积时间也为2 h。

体外溶解性：将实验组与对照组碳/碳复合材料试样经丙酮超声清洗、去离子水淋洗，干燥后高温消毒，把试样放入到50 mL培养基中，置于37 ℃恒温箱内，1，3，6 d后分别把试样从培养基中取出，每个时间点有3个样本。采用Vista-AX型等离子体发射光谱仪测定培养液中Ca、P、Mg离子浓度；采用SUPRA55型扫描电镜测试涂层的微观样貌及主要元素；采用D8型X射线衍射仪检测涂层的结构；采用CSM Revetest型划痕仪检测涂层的结合力，划痕形貌图中首次露出基体的位置为涂层的失效位置，即涂层的临界载荷位置^[15]。

细胞培养和增殖实验：取原代小鼠骨髓间充质干细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO₂和饱和湿度的条件下进行培养。把两组涂层样品放入24孔板中，每孔加入含有5×10⁶ L^-1的骨髓间充质干细胞悬液1 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中，让细胞自然沉落在涂层表面；5 h后吸去培养基，将PBS加入每孔中，并清洗样品涂层表面，再把表面黏附有细胞的碳/碳复合材料移到新的24孔细胞培养板中，加培养基继续培养。继续培养6 d后，用PBS清洗材料表面，用2.5%戊二醛固定2 h，再依次用体积分数30%、50%、70%、90%、95%的乙醇脱水20 min，再用醋酸异戊酯兑换乙醇^[6]，用扫描电镜观察骨髓间充质干细胞的黏附特性。

1.5 主要观察指标羟基磷灰石涂层与掺镁羟基磷灰石涂层的体外溶解性及细胞相容性。

1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件包进行数据分析，对于两组之间的比较，使用t-test；对于3组及以上之间的比较，使用单因素方差分析结合Turkey比较每组之间的差异。P < 0.05被认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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