负载抗结核药物与骨形态发生蛋白2缓释微球的3D打印人工骨能促进骨髓间充质干细胞成骨

doi:10.12307/2021.056

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (28): 4447-4453.doi: 10.12307/2021.056

• 组织工程骨材料Tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

负载抗结核药物与骨形态发生蛋白2缓释微球的3D打印人工骨能促进骨髓间充质干细胞成骨

刘昌昊1，郑建平2，施建党3，朱禧3，周占文1，张旭1

1宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750000；宁夏医科大学总医院，2创伤骨科，3脊柱骨科，宁夏回族自治区银川市 750000

收稿日期:2020-09-08 修回日期:2020-09-09 接受日期:2020-10-09 出版日期:2021-10-08 发布日期:2021-05-15
通讯作者: 施建党，博士生导师，主任医师，宁夏医科大学总医院脊柱骨科，宁夏回族自治区银川市 750000
作者简介:刘昌昊，男，1993年生，甘肃省张掖市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事脊柱感染及骨肿瘤的研究。郑建平，男，1984年生，内蒙古自治区乌兰察布市人，汉族，宁夏医科大学在读博士，主治医师，主要从事骨创伤、骨肿瘤、骨感染及运动医学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(8176090169)，项目负责人：施建党

Three-dimensional printed artificial bone loaded with anti-tuberculosis drugs and bone morphogenetic protein 2 sustained-release microspheres can promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Changhao1, Zheng Jianping2, Shi Jiandang3, Zhu Xi3, Zhou Zhanwen1, Zhang Xu1

1School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedic Trauma, 3Department of Spinal Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2020-09-08 Revised:2020-09-09 Accepted:2020-10-09 Online:2021-10-08 Published:2021-05-15
Contact: Shi Jiandang, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Spinal Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Liu Changhao, Master candidate, School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China Zheng Jianping, Doctoral candidate, Attending physician, Department of Orthopedic Trauma, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 8176090169 (to SJD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
新合成的抗结核人工骨：即3D打印的PA-824、莫西沙星和吡嗪酰胺/骨形态发生蛋白2/纳米羟基磷灰石抗结核人工骨，该人工骨在脊柱结核治疗过程中有望实现局部高效抗结核和重建病灶骨缺损双重效果，为拓展脊柱结核的外科治疗提供数据。
成骨分化：将未分化的间充质干细胞最终诱导分化为骨细胞的过程。载有骨形态发生蛋白2的抗结核人工骨与骨髓间充质干细胞共培养后，碱性磷酸酶活性增强和钙结节数量增多，成骨相关因子表达水平升高，可见细胞在人工骨的诱导下完成了成骨分化。

背景：脊柱结核病灶清除术后局部有效药物浓度不足及残留骨缺损的修复是目前脊柱结核治疗的难题，新型抗结核药物联合骨形态发生蛋白2成为解决该问题的新思路，可有效促进骨缺损修复。
目的：观察PA-824、莫西沙星和吡嗪酰胺/骨形态发生蛋白2/纳米羟基磷灰石抗结核人工骨对兔骨髓间充质干细胞成骨分化和黏附能力的影响。
方法：提取并纯化兔骨髓间充质干细胞；以纳米羟基磷灰石为材料，制备含抗结核药物PA-824、莫西沙星和吡嗪酰胺与骨形态发生蛋白缓释微球的3D打印人工骨，并与第3代骨髓间充质干细胞共培养，作为实验组；将骨形态发生蛋白2与骨髓间充质干细胞共培养，作为阳性对照组；将骨髓间充质干细胞单独培养，作为空白对照组。培养第1，3，7，14，21天检测兔骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化及细胞黏附效果，以评估该人工骨对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，以CCK-8法检测细胞增殖和细胞毒性，以钙结节沉积程度及碱性磷酸酶表达活性评价成骨分化效果，荧光定量PCR 和Western blot 法检测成骨相关基因和蛋白表达水平，扫描电镜观察细胞黏附特性。
结果与结论：①新合成的抗结核人工骨微观结构呈现良好的空间性，利于细胞附着；②CCK-8法检测结果表明各组细胞均增殖良好，其中实验组、阳性对照组持续14 d呈现增殖状态，空白对照组7 d后趋于平稳状态，说明此人工骨具有良好的生物相容性；③碱性磷酸酶活性呈先上升后降低的变化趋势，至14 d达到高峰，在第7，14天时阳性对照组碱性磷酸酶活性高于实验组(P < 0.05)，但第21天时实验组高于阳性对照组，而空白对照组在各时间点变化不大；④茜素红染色实验显示实验组、阳性对照组均有钙结节形成，两组钙结节数量和大小差别不明显；两组成骨相关基因和蛋白(Runx2和Ⅰ型胶原蛋白)表达均高于空白对照组(P < 0.05)；⑤扫描电镜下观察到细胞在支架上紧密黏附，且呈“八爪”状或长梭形生长；⑥结果表明，新合成的抗结核人工骨具有独特的空间结构和良好的生物相容性，能促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化，是一种理想的骨组织工程材料。
https://orcid.org/0000-0001-7796-8798 (施建党) ；https://orcid.org/0000-0002-3050-4803 (刘昌昊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: PA-824, 莫西沙星, 吡嗪酰胺, 骨形态发生蛋白2, 纳米羟基磷灰石, 抗结核人工骨, 间充质干细胞, 成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Insufficient local effective drug concentration after debridement of spinal tuberculosis lesions and repair of residual bone defects are the current problems in the treatment of spinal tuberculosis. New anti-tuberculosis drugs combined with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) have become a new idea to solve this problem, which can effectively promote bone defect repair.

OBJECTIVE: To observe the effect of PA-824, moxifloxacin and pyrazinamide (PaMZ)/BMP-2/nano-hydroxyapatite (nHA) anti-tuberculosis artificial bone on osteogenic differentiation and adhesion of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and purified. The nHA was used to fabricate the three-dimensional printed artificial bone containing anti-tuberculosis drugs PA-824, moxifloxacin, pyrazinamide and BMP sustained-release microspheres (PaMZ/BMP-2/nHA), and co-cultured with the third generation of bone marrow mesenchymal stem cells as the experimental group. BMP-2 was co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells as a positive control group. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured separately as blank control group. The proliferation, osteogenesis and cell adhesion effects of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were respectively tested at 1, 3, 7, 14, and 21 days of culture to evaluate the influence of the artificial bone on the osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. The cell proliferation and cytotoxicity were detected by CCK-8 assay. The degree of calcium nodule deposition and alkaline phosphatase expression activity were measured to evaluate the influence of osteogenic differentiation. Fluorescence quantitative PCR and western blot assay were used to detect the expression levels of osteogenicgenes and proteins, respectively. The adhesion characteristics of cells were observed by scanning electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The newly synthesized anti-tuberculosis artificial bone showed good spatial microstructure, which was conducive to cell attachment. (2) CCK-8 assay showed that the cells in each group proliferated well. Among them, the experimental group and the positive control group showed a proliferation state for 14 days, and the blank control group became stable after 7 days, indicating that the artificial bone had good biocompatibility. (3) The alkaline phosphatase activity appeared a trend of increasing first and then decreasing, reaching a peak at 14 days. At 7 and 14 days, the alkaline phosphatase activity of the positive control group was higher than that of the experimental group (P < 0.05), but the activity of the experimental group was higher than that in the positive control group at 21 days. The change was not obvious in the blank control group at each time point. (4) Alizarin red staining experiments revealed that calcium nodules were formed in the experimental group and the positive control group, and the differences in the number and size of calcium nodules between the experimental group and the positive control group were not obvious. The expression levels of bone-related genes and proteins (Runx2 and collagen I) were higher in the two groups than those in the blank control group (P < 0.05). (5) Under the scanning electron microscope, it was observed that the cells adhered tightly to the scaffold and showed “Eight Claws” or long fusiform growth. (6) It is concluded that the newly synthesized anti-tuberculosis artificial bone has a unique spatial structure and good biocompatibility, which can promote the proliferation and osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells, and is an ideal bone tissue engineering material.

Key words: PA-824, moxifloxacin, pyrazinamide, bone morphogenetic protein 2, nano-hydroxyapatite, anti-tuberculosis artificial bone, mesenchymal stem cells, osteogenic differentiation

中图分类号:

刘昌昊, 郑建平, 施建党, 朱禧, 周占文, 张旭. 负载抗结核药物与骨形态发生蛋白2缓释微球的3D打印人工骨能促进骨髓间充质干细胞成骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4447-4453.

Liu Changhao, Zheng Jianping, Shi Jiandang, Zhu Xi, Zhou Zhanwen, Zhang Xu. Three-dimensional printed artificial bone loaded with anti-tuberculosis drugs and bone morphogenetic protein 2 sustained-release microspheres can promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(28): 4447-4453.

图/表（结果） 12

2.1 PaMZ/BMP-2/nHA人工骨的大体观察和表面形态支架大体呈长方形，长、宽各约8 mm，高10 mm，乳白色，质硬而表面粗糙，大体观察可见部分孔隙，电镜观察到PaMZ/BMP-2/nHA人工骨呈微米级疏松多孔结构，BMP-2缓释涂层效果满意，见图1。

2.2 兔骨髓间充质干细胞的生长情况及形态特征原代培养 3 d后换液，弃去未贴壁细胞，可见呈分散团状纺锤形贴壁细胞；培养7 d后细胞铺满培养瓶底部，细胞形态为短梭形纤维样紧密排列，呈旋涡状生长，融合率达90%以上，记为原代。传至第3代细胞形态均匀一致，呈长梭形，生长状态良好，见图2。经成骨及成脂培养基诱导培养21 d后，茜素红染色见大量红染矿物结节，油红O染色见大量脂肪空泡，说明此细胞为骨髓间充质干细胞，见图3。

2.3 PaMZ/BMP-2/nHA人工骨生物相容性
2.3.1 人工骨对骨髓间充质干细胞增殖的影响根据PaMZ/BMP-2/nHA人工骨的释药特性和力学强度，取药物配比为Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140复合人工骨与第3代骨髓间充质干细胞共培养。培养1，3，7，14，21 d后，检测各时间点骨髓间充质干细胞的增殖情况，见图4和表2。CCK-8法检测结果显示实验组及阳性对照组细胞增殖良好，在培养第3天后迅速增殖，阳性对照组至14 d后生长达到平台期，且阳性对照组细胞增殖活性比实验组更明显，但实验组持续增殖达到21 d，与阳性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；空白对照组至第7天即达到增殖平台期，几乎无增殖，与实验组及阳性对照组比较各时间点差异有显著性意义(P < 0.05)，说明PaMZ/BMP-2/nHA人工骨无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。

2.3.2 扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在PaMZ/BMP-2/nHA人工骨上的黏附情况骨髓间充质干细胞与PaMZ/BMP-2/nHA人工骨共培养14 d后，扫描电镜可见细胞呈长梭形，形态饱满，均匀分布，21 d后细胞紧密黏附在支架表面，细胞呈“八爪状”分布，细胞表面分泌大量囊泡，见图5。说明PaMZ/BMP-2/nHA人工骨适宜骨髓间充质干细胞的生长和贴壁，进一步说明该人工骨具有良好的生物相容性。

2.4 单纯负载PaMZ支架浸提液对细胞增殖活性的影响单纯负载PaMZ的支架浸提液与细胞共培养24，48，72 h后检测细胞增殖活性。CCK-8法检测结果显示，空白对照组细胞增殖活性最好，与3个负载PaMZ支架组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但3个负载PaMZ支架相比差异不明显，说明药物对细胞增殖有影响，见图6。

2.5 PaMZ/BMP-2/nHA人工骨对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响
2.5.1 碱性磷酸酶活性和茜素红染色随着时间推移，实验组及阳性对照组碱性磷酸酶活性呈先上升后下降的变化趋势，见表3和图7。碱性磷酸酶活性在第14天达到峰值，随后下降，阳性对照组和实验组在各检测时间点的碱性磷酸酶活性差异不明显(P > 0.05)，却均显著高于空白对照组(P < 0.01)。为更进一步确定该支架的成骨分化能力，在第1，3，7，14，21天分别对3组骨髓间充质干细胞进行茜素红染色，结果显示，第21天时实验组及阳性对照组骨髓间充质干细胞大体观察到红染区域，镜下观察可见红染钙结节点，阳性对照组的钙结节大小及数量高于实验组，但两组均明显优于空白对照组。由于培养至第3天时，空白对照组其中2孔由成骨诱导培养基诱导成骨分化，该组染色则明显优于其他组，见图8。

2.5.2 成骨相关因子Runx2和Ⅰ型胶原表达与空白对照组相比，实验组骨髓间充质干细胞Runx2和Ⅰ型胶原在mRNA和蛋白水平上均表达更高(P < 0.05)，且随时间的延长表达量升高，见图9，10。

参考文献

[1] WANG B, GAO W, HAO D. Current Study of the Detection and Treatment Targets of Spinal Tuberculosis.Curr Drug Targets. 2020;21(4):320-327.
[2] 中华医学会结核病学分会.中国耐多药和利福平耐药结核病治疗专家共识(2019年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2019,42(10):733-749.
[3] YADAV G, KANDWAL P, ARORA SS. Short-term outcome of lamina-sparing decompression in thoracolumbar spinal tuberculosis. J Neurosurg Spine. 2020:1-8.
[4] DUNN RN, BEN HUSIEN M. Spinal tuberculosis: review of current management. Bone Joint J. 2018;100-B(4):425-431.
[5] 巩栋,马永海,杨新乐,等.3D打印β-磷酸三钙负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物缓释微球细胞毒性及对BMSCs成骨分化影响的研究[J].中国修复重建外科杂志,2018,32(9):1131-1136.
[6] 孙伟,薛骋,唐先业,等.不同方法构建抗结核β-磷酸三钙药物缓释系统的载药和缓释性能[J].中国组织工程研究,2018,22(30): 4824-4828.
[7] KHANNA K, SABHARWAL S. Spinal tuberculosis: a comprehensive review for the modern spine surgeon. Spine J. 2019;19(11):1858-1870.
[8] DING P, LI X, JIA Z, et al. Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) disease burden in China: a systematic review and spatio-temporal analysis. BMC Infect Dis. 2017;17(1):57.
[9] YANG S, YU Y, JI Y, et al. Multi-drug resistant spinal tuberculosis-epidemiological characteristics of in-patients: a multicentre retrospective study. Epidemiol Infect. 2020;148:e11.
[10] 韦媛媛,杨帆,汤杰,等.抗结核药物的研究进展[J].中国药科大学学报,2020,51(2): 231-239.
[11] 陈浩,武楠楠,胡文辉,等.抗结核药物作用新靶点及其研究进展[J].中国防痨杂志,2020,42(3):286-292.
[12] AHMAD N, AHUJA SD, AKKERMAN OW, et al. Treatment correlates of successful outcomes in pulmonary multidrug-resistant tuberculosis: an individual patient data meta-analysis. Lancet. 2018;392(10150):821-834.
[13] KIM TW, AHN WB, KIM JM, et al. Combined Delivery of Two Different Bioactive Factors Incorporated in Hydroxyapatite Microcarrier for Bone Regeneration. Tissue EngRegen Med. 2020;17(5):607-624.
[14] KOVERMANN NJ, BASOLI V, DELLA BELLA E, et al. BMP2 and TGF-β Cooperate Differently during Synovial-Derived Stem-Cell Chondrogenesis in a Dexamethasone-Dependent Manner. Cells. 2019;8(6):636.
[15] 唐学峰,刘昌昊,于树印,等.载PaMZ/nHA抗结核人工骨的最优配方筛选[J].宁夏医科大学学报,2020,42(6):565-572.
[16] BASYUNI S, FERRO A, SANTHANAM V, et al. Systematic scoping review of mandibular bone tissue engineering. Br J Oral Maxillofac Surg. 2020; 58(6):632-642.
[17] MAJI K, DASGUPTA S, BHASKAR R, et al. Photo-crosslinked alginate nano-hydroxyapatite paste for bone tissue engineering. Biomed Mater. 2020;15(5):055019.
[18] 张贺龙,王慧燕,李卓,等.壳聚糖-明胶/聚乳酸-羟基乙酸联合载药水凝胶的体外抗结核作用[J].中国组织工程研究,2020,24(22): 3480-3485.
[19] 孟磊,甄平,梁晓燕,等.3D打印多孔β-磷酸三钙负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物缓释微球复合材料:构建及细胞毒性评价[J].中国组织工程研究,2016,20(25):3750-3756.
[20] 李广杰,陈永刚,张学良,等.硫酸钙/纳米羟基磷灰石免疫人工骨对兔结核性骨缺损治疗的研究[J].南京医科大学学报(自然科学版),2020,40(8):1130-1134.
[21] 岳学锋,唐学峰,施建党,等.抗结核药缓释涂层在兔脊柱结核模型体内的抗结核性能及组织相容性观察[J].中国脊柱脊髓杂志, 2020,30(6):558-565.
[22] HE J, HAN X, WANG S, et al. Cell sheets of co-cultured BMP-2-modified bone marrow stromal cells and endothelial progenitor cells accelerate bone regeneration in vitro. ExpTher Med. 2019;18(5):3333-3340.
[23] LIU H, JIAO Y, ZHOU W, et al. Endothelial progenitor cells improve the therapeutic effect of mesenchymal stem cell sheets on irradiated bone defect repair in a rat model. J Transl Med. 2018;16(1):137.
[24] CARREIRA AC, ZAMBUZZI WF, ROSSI MC, et al. Bone Morphogenetic Proteins: Promising Molecules for Bone Healing, Bioengineering, and Regenerative Medicine. VitamHorm. 2015;99:293-322.
[25] LUU HH, SONG WX, LUO X, et al. Distinct roles of bone morphogenetic proteins in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2007;25(5):665-677.
[26] The Role of Tantalum Nanoparticles in Bone Regeneration Involves the BMP2/Smad4/Runx2 Signaling Pathway [Retraction]. Int J Nanomedicine. 2020;15:3391.
[27] KÄMMERER PW, PABST AM, DAU M, et al. Immobilization of BMP-2, BMP-7 and alendronic acid on titanium surfaces: Adhesion, proliferation and differentiation of bone marrow-derived stem cells. J Biomed Mater Res A. 2020;108(2):212-220.
[28] 洪亮,焦根龙.骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶基因表达含量的变化[J].中国医学物理学杂志,2017,34(8):825-828.
[29] 白燕,王士斌,陈爱政,等.BMP-2及FGF-2对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].重庆医科大学学报,2017,42(12):1575-1581.
[30] WANG J, WANG M, CHEN F, et al. Nano-Hydroxyapatite Coating Promotes Porous Calcium Phosphate Ceramic-Induced Osteogenesis Via BMP/Smad Signaling Pathway. Int J Nanomedicine. 2019;14:7987-8000.
[31] TANG Z, WANG Z, QING F, et al. Bone morphogenetic protein Smads signaling in mesenchymal stem cells affected by osteoinductive calcium phosphate ceramics. J Biomed Mater Res A. 2015;103(3):1001-1010.
[32] HUMBERT P, BRENNAN MÁ, DAVISON N, et al. Immune Modulation by Transplanted Calcium Phosphate Biomaterials and Human Mesenchymal Stromal Cells in Bone Regeneration. Front Immunol. 2019;10:663.
[33] ZHAO C, WANG X, GAO L, et al. The role of the micro-pattern and nano-topography of hydroxyapatite bioceramics on stimulating osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.ActaBiomater. 2018;73:509-521.
[34] HARDY E, FERNANDEZ-PATRON C. Destroy to Rebuild: The Connection Between Bone Tissue Remodeling and Matrix Metalloproteinases. Front Physiol. 2020;11:47.
[35] YAMAGUCHI A, KOMORI T, SUDA T. Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfa1. Endocr Rev. 2000;21(4):393-411.
[36] ZHU B, LIU W, LIU Y, et al. Jawbone microenvironment promotes periodontium regeneration by regulating the function of periodontal ligament stem cells. Sci Rep. 2017;7:40088.
[37] WANG YQ, WANG NX, LUO Y, et al. Ganoderal A effectively induces osteogenic differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells via cross-talk between Wnt/β-catenin and BMP/SMAD signaling pathways. Biomed Pharmacother. 2020;123:109807.
[38] RAPHAEL-MIZRAHI B, GABET Y. The Cannabinoids Effect on Bone Formation and Bone Healing.CurrOsteoporos Rep. 2020;18(5):433-438.
[39] COLUZZI F, SCERPA MS, CENTANNI M. The Effect of Opiates on Bone Formation and Bone Healing.CurrOsteoporos Rep. 2020;18(3):325-335.

引言

脊柱结核是最常见的肺外结核，占骨结核的50%-60%[1]。目前治疗上仍以抗结核药物化疗为主[2]，对于存在严重后凸畸形、神经功能缺陷和腰椎不稳的患者则需要手术干预[3]，但病灶清除术后局部有效药物浓度不足及残留骨缺损的修复仍是目前脊柱结核治疗的难题[4]。近年来抗结核药物缓释系统引起学者的广泛关注，孙伟等[5-6]学者采用不同方法构建抗结核药物缓释系统，且取得丰硕成果，但是所负载均是传统抗结核药物，而耐药结核杆菌的出现使得传统抗痨药难以应对如今日趋复杂的脊柱结核治疗需要[7-9]，因此亟需疗效确切、治疗周期短的新型抗结核药及性能优越的植骨支撑材料缓解临床压力[10-12]。PA-824(Pretomanid，Pa)、莫西沙星(Moxifloxacin，M)和吡嗪酰胺(Pyrazinamide，Z)(简称PaMZ)三联化疗是目前结核病药物治疗的最新方案，其高效快速的杀菌能力为脊柱结核的治疗带来了新的希望。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)是诱导间充质干细胞成骨分化的最有效生长因子之一，其在体外能诱导成骨细胞分化，在体内可提高成骨诱导活性[13-14]。基于此，课题组前期采用3D打印技术制备了载PaMZ/BMP-2/纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nHA)抗结核人工骨，对其理化性质及释药进行了表征及优选，理论上此载药人工骨既能局部高效抗结核又能重建病灶骨缺损，而此人工骨在体外的生物相容性和对干细胞的成骨分化能力尚不明了。该研究通过观察PaMZ/BMP-2/nHA抗结核人工骨对兔骨髓间充质干细胞成骨分化和黏附能力的影响，用以判断PaMZ/BMP-2/nHA抗结核人工骨的生物相容性及体外成骨活性，为体内成骨奠定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年8月在宁夏医科大学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级新西兰大白兔2只，体质量300-350 g，2周龄，购自宁夏医科大学实验动物中心。
1.3.2 实验试剂和仪器纳米羟基磷灰石粉末、纳米羟基磷灰石晶须粉体(西安点云公司)；聚乳酸-羟基乙酸(75/25)(poly lacticco glycolic acid，PLGA)(济南岱罡生物工程有限公司)；BMP-2(深圳欣博盛生物科技有限公司)；Pa-824(美国MedChemExpress公司)；莫西沙星、吡嗪酰胺(大连美仑生物技术有限公司)；胎牛血清(美国Gibcom公司)；DMEM/F12、PBS(美国Biogogical Industries公司)；胰酶、青链霉素混合液(上海索莱宝生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒、碱性磷酸酶试剂盒、全蛋白提取试剂盒、ECL检测试剂盒(凯基生物公司)；RNA提取试剂盒(赛默飞生物公司)；所有抗体(北京博奥森技术有限公司)；3D打印机(西安点云公司)；倒置显微镜(CKX41，日本Olympus Life Science公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；酶标仪(Infinite M200 Pro，瑞士Tecan公司)；扫描电镜(S-3400N，天美科学仪器有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 载PaMZ/BMP-2/nHA人工骨的制备课题组前期已成功制备3D打印载抗痨药复合支架，当药物配比在Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140，支架孔径为200 μm时，其抗压强度可达(8.57±1.69) MPa，在人体椎体抗压强度2-12 MPa之间，符合天然松质骨要求[15]。采用W1/O/W2复乳法制备微球，以BMP-2(1.67 μg)+胎牛血清(50 mg)+去离子水(1 mL)形成水相；PLGA(200 mg)溶于2 mL二氯甲烷中形成油相，二者充分混合后注入含0.8 g氯化钙的1%聚乙烯醇40 mL，搅拌均匀后固化4 h，离心、洗涤、冷冻干燥后收集BMP-2缓释微球，4 ℃密封保存。利用刮浆法将BMP-2缓释微球附着在支架上，冷冻干燥24 h后4 ℃密封保存。
1.4.2 兔骨髓间充质干细胞的培养及传代取健康2周龄新西兰大白兔，耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠麻醉致死，体积分数为75%乙醇浸泡15 min，超净台中分离股骨及胫骨并冲出骨髓，充分混匀后1 500 r/min离心10 min，重悬后接种于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中贴壁培养，记为原代，72 h后全量换液，当细胞融合至90%后消化传代，取第3代细胞进行后续实验。

1.4.3 培养前人工骨处理将载PaMZ/BMP-2/nHA人工骨浸泡在体积分数为75%乙醇中10 min，取出用PBS冲洗3遍，待自然干燥后放入超净台中紫外照射12 h，然后置于6 cm培养皿中，加入适量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液，恒温箱孵育24 h，待用。
1.4.4 实验分组实验分3组：①实验组：骨髓间充质干细胞+PaMZ/BMP-2/nHA人工骨；②阳性对照组：骨髓间充质干细胞+0.2 mg/L BMP-2；③空白对照组：单纯骨髓间充质干细胞。取实验组适当大小的人工骨材料放于12孔板中，将1.5 mL含有1×105个第3代骨髓间充质干细胞的细胞悬液逐滴滴在人工骨上，使其完全浸没复合材料，置于孵育箱复合培养，2 d换液1次。阳性对照组换液时重新添加BMP-2，使质量浓度达0.2 mg/L。
1.5 主要观察指标
1.5.1 支架对细胞增殖活性的影响当3组细胞培养第1，3，7，14，21天后，取出支架，用PBS冲洗后移入新的12孔板中，采用CCK-8法检测支架对细胞活性的影响，每组设立6个复孔，培养至检测时间点时按培养基∶CCK-8溶液比=10∶1加入CCK-8工作液，恒温箱孵育2 h，每孔吸取100 µL工作液转移至96孔板中，酶标仪检测450 nm波长的吸光度值。
1.5.2 药物浸提液对细胞增殖活性的影响将3个单纯负载PaMZ的支架分别置于不同透析袋中，加入5 mL PBS完全浸没支架，封口后放在盛有10 mL PBS的锥形瓶中，48 h后从锥形瓶中取出5 mL液体，加入种植细胞的96孔板中，分别于24，48，72 h采用CCK-8法检测细胞活性，步骤同上。
1.5.3 支架诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化能力单纯骨髓间充质干细胞组取其中2孔，待细胞融合70%后加入成骨诱导分化培养基，培养至第1，3，7，14，21天时，将支架取出，用PBS冲洗各孔细胞3遍，甲醛固定后冲洗，每孔加入1 mL茜素红染液，3-5 min后洗去染液并在镜下观察，记录钙结节颜色、大小和数量。
1.5.4 碱性磷酸酶活性采用碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。复合培养7，14，21 d，PBS冲洗细胞2次，裂解细胞后测定碱性磷酸酶活性，37 ℃避光孵育30 min，使用酶标仪在波长562 nm处测量吸光度值。
1.5.5 扫描电镜观察细胞黏附情况复合培养7，14，21 d，按时间点取出实验组支架，PBS轻柔冲洗2遍，戊二醛、二甲砷酸缓冲，梯度乙醇脱水后冷冻真空干燥，固定后喷金，扫描电镜观察。
1.5.6 荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2和Ⅰ型胶原表达水平待无菌支架与细胞共培养7，14，21 d后收集细胞，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR检测Runx2和Ⅰ型胶原表达水平。选用GAPDH为内参，引物由上海生工公司设计，见表1。

1.5.7 Western blot检测Runx2和Ⅰ型胶原蛋白表达水平待支架与细胞共培养7，14，21 d后收集细胞，提取总蛋白并定量、电泳分离样品、PVDF转膜、脱脂奶粉封闭，以Runx2、Ⅰ型胶原和β-Actin一抗4 ℃孵育过夜，用PBST洗涤，每次5 min，洗涤3次；IgG二抗孵育2 h，洗涤；显影、曝光，记录并分析结果。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，数值均以 x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

理想的组织工程骨材料应使植骨材料、种子细胞、生长因子三者完美结合，作为新的细胞基质植于骨缺损处实现原位成骨[16-17]。诸多学者研究了负载传统抗结核药物的人工合成骨[18-21]，虽取得了较好的结果，但仍存在细菌耐药、疗效不佳等问题。载有新型抗痨药PaMZ及加入BMP-2的3D打印nHA抗结核人工骨在脊柱结核的治疗上有望打破目前治疗上的困局。前期实验制备的3D打印载PaMZ/BMP-2/nHA的抗结核人工骨，是兼具局部抗结核作用及骨缺损修复的药物缓释系统，此载药人工骨体外释药超过6周且平均药物浓度均高于10倍最低抑菌浓度[15]，但其体外生物相容性及成骨能力仍需进一步明确。
此次研究表明，载药人工骨在体外具有良好的成骨活性和生物相容性。CCK-8法评估了PaMZ/BMP-2/nHA抗结核人工骨的细胞毒性，结果发现共培养的骨髓间充质干细胞活力较好，但14 d前实验组细胞增殖活性低于阳性对照组，既往已有的定论是BMP-2能明显促进骨髓间充质干细胞增殖分化[22-23]，因此该研究结果提示PaMZ对细胞活力有一定影响。为了解PLGA释放的PaMZ对干细胞增殖分化的影响，将其高浓度浸提液与骨髓间充质干细胞共培养，细胞毒性检测比较发现，PaMZ对细胞增殖有一定的抑制作用，但与BMP-2联合培养后细胞增殖呈促进作用，证明PaMZ/BMP-2/nHA人工骨的综合效果是促进骨髓间充质干细胞增殖，有良好的生物相容性，可被进一步用于体内实验研究。该研究发现，21 d时CCK-8结果显示实验组细胞活力高于阳性对照组，且较14 d时有更好的细胞活性，但两者差异不显著，此结果同KIM等[13]学者研究相一致，他们认为这种变化的原因可能是BMP-2促间充质干细胞增殖具有浓度依赖性和时间依赖性[24-25]。研究还发现PaMZ/BMP-2/nHA人工骨与细胞共培养21 d后，扫描电镜下观察到细胞在支架上紧密贴壁生长，并有大量囊性胞体形成促进细胞增殖分化，这也说明PaMZ/BMP-2/nHA人工骨表现出良好的生物相容性和骨传导性。
实验进一步评估了成骨基因和蛋白的表达，来检测该人工骨的成骨分化效果。与空白对照相比，实验组和阳性对照组Runx2和Ⅰ型胶原mRNA表达趋于上调，蛋白表达结果与mRNA变化趋势一致。骨髓间充质干细胞诱导成骨后，成骨细胞在成熟过程中主要经历细胞增殖、细胞外基质成熟和矿化形成3个阶段。碱性磷酸酶是骨髓间充质干细胞早期分化成骨的重要标志[26-27]，是细胞增殖期主要表达产物，在成骨分化第7天碱性磷酸酶mRNA开始进入高峰期，第14天达到巅峰，维持1周后迅速下降，其活力在一定程度上反映成骨细胞的分化程度和功能状态[28]。该研究结果显示人工骨和BMP-2均具有良好的促成骨分化能力，但前期阳性对照组对骨髓间充质干细胞的成骨分化能力高于实验组。既往研究表明：BMP-2显著促进骨髓间充质干细胞增殖分化的最佳质量浓度为0.2 mg/L[29]，所以推测在前14 d阳性对照组中BMP-2浓度为碱性磷酸酶表达的最佳浓度，能迅速促进碱性磷酸酶蛋白合成，而实验组中由于存在PLGA缓释系统，使BMP-2均匀缓慢释放，有效浓度达不到碱性磷酸酶表达最佳水平。此外，纳米羟基磷灰石涂层支架可通过BMP/Smad信号通路实现细胞在支架上黏附并促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，其表现为成骨基因表达上调、碱性磷酸酶活性增强和骨钙素生成增加[30-33]，因此纳米羟基磷灰石支架的降解也可能参与细胞成骨分化进程；21 d时，骨髓间充质干细胞分化达到矿化形成期，细胞内碱性磷酸酶活性下降，而细胞外基质与钙沉积相关基因(如骨桥蛋白、骨钙蛋白)表达达到高峰，因此表现为21 d碱性磷酸酶活力低于14 d。在细胞增殖期，Ⅰ型胶原也开始合成并分泌，在细胞外基质成熟期Ⅰ型胶原表达为成骨特异性蛋白，最终矿化形成骨结节，该研究的mRNA和蛋白表达的结果与其变化基本一致。Runx2参与成骨分化的启动，在成骨细胞成熟的整个过程中维持较高水平[34-35]。支架材料不仅上调了碱性磷酸酶的表达，活化的碱性磷酸酶激活Wnt信号通路促进骨髓间充质干细胞形成钙沉积[36-37]。钙结节是骨髓间充质干细胞成骨分化逐渐成熟的标志，通过钙结节数量可以分析骨髓间充质干细胞成骨分化的程度[38-39]。茜素红染色结果发现实验组和阳性对照组钙结节数量和大小差别甚微，进一步说明人工骨最终成骨能力可达到理想效果。
综上所述，新研制的载PaMZ/BMP-2的nHA抗结核人工骨不仅具备良好的生物相容性，同时还能通过促进骨髓间充质干细胞增殖及分化而实现良好的成骨，是一种理想的骨组织工程材料。虽然其在体外有满意的生物相容性，但在体内毒性作用研究更加重要，尤其处于结核病灶中的效果，今后将进一步开展动物体内毒副作用和成骨分化能力研究，为组织工程骨治疗结核性骨缺损奠定一定的基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

负载抗结核药物与骨形态发生蛋白2缓释微球的3D打印人工骨能促进骨髓间充质干细胞成骨

Three-dimensional printed artificial bone loaded with anti-tuberculosis drugs and bone morphogenetic protein 2 sustained-release microspheres can promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 12

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[4]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[5]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[6]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[7]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[8]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[9]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[10]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[11]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[12]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[13]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[14]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[15]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.