血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架与多种细胞构建组织工程膀胱

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.007

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细菌纤维素：是指在不同条件下，由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素统称，为一种天然β-葡萄糖聚合物，其独特的超细纤维网络结构、卓越的机械性能、低免疫原性、良好的生物相容性使之在生物医学领域引起人们的广泛关注，并已被证明可应用在人工骨、皮肤、人工血管。
纳米微球：是一种粒径在5 nm到1 000 µm的小颗粒，每个颗粒上还有些更细小的孔径，可以作为药物载体、酶载体、导电球、磁珠等广泛应用在生物制药、食品安全检测和医疗诊断等行业。

背景：传统膀胱修补的方法存在损伤正常器官功能、术后并发症多等问题，组织工程为膀胱修复提供了新的途径。
目的：探讨血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架复合兔舌黏膜上皮细胞及舌骨骼肌细胞构建组织工程膀胱的可行性。
方法：分别制备细菌纤维素支架与血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架，将兔舌骨骼肌细胞、舌黏膜上皮细胞依次接种至两种支架上。取6只兔，制备膀胱缺损模型，随机分两组，实验组于缺损处植入复合自体舌骨骼肌细胞、舌黏膜上皮细胞的血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架，对照组于缺损处植入复合自体舌骨骼肌细胞、舌黏膜上皮细胞的细菌纤维素支架。植入后3个月进行膀胱造影、尿动力学及组织学检测。
结果与结论：①造影结果：实验组可见相对完整的膀胱，对照组部分膀胱可见小面积充盈缺损。②尿动力学检测结果：两组的最大膀胱容量和膀胱顺应性均较植入前降低，对照组上述尿动力学参数下降幅度显著高于实验组(P < 0.05)。③组织学检测结果：对照组修复处膀胱组织未能构建出完整的上皮细胞层，其下方仅有少量肌层形成，黏膜下方有少量微血管形成；实验组修复处膀胱组织有完整上皮细胞层形成，可见到黏膜下方有较多肌层形成，黏膜下方有较多量毛细血管形成。④结果表明，将血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架与舌骨骼肌细胞、舌黏膜上皮细胞复合可构建组织工程膀胱。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-3998-3676(张心如)

关键词: 生物材料, 纳米材料, 细菌纤维素, 膀胱, 血管内皮生长因子, 舌上皮细胞, 舌肌细胞

Abstract:

BACKGROUND: Traditional bladder repair methods have many problems such as damage to normal organ function and many postoperative complications. Tissue engineering technology provides a new way for bladder repair.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of constructing tissue-engineered bladder with vascular endothelial growth factor (VEGF) nanoparticle-bacterial cellulose (BC) composite scaffold with rabbit lingual epithelial cells and tongue muscle cells.

METHODS: Rabbit lingual epithelial cells and muscle cells were successively implanted onto the BC scaffold (control group) and VEGF-BC scaffold (experimental group). Six rabbits were taken to make bladder defect models and randomized into two groups: experimental group implanted with VEGF-BC scaffold carrying autologous lingual epithelial cells and tongue muscle cells, and control group implanted with BC scaffold carrying autologous lingual epithelial cells and tongue muscle cells. Specimens were taken from the two groups for urographic evaluation and histological examination at 3 months after implantation. Meanwhile, the urodynamic tests were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: The experimental group showed the relatively complete bladder, and the control group showed a small-area filling defect of the bladder. The maximum bladder capacity and bladder compliance in both two groups were decreased after implantation, especially significantly in the control group (P < 0.05). In the control group, it failed to build a complete epithelial cell layer, and the muscle layer and microvessels were formed a little. In the experimental group, the complete epithelial cell layer was formed, and a larger amount of muscle layers and capillaries appeared. These findings indicate that the VEGF-BC scaffold carrying lingual epithelial cells and tongue muscle cells can be used to construct the tissue-engineered bladder.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Cellulose, Urinary Bladder, Epithelial Cells, Muscle Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张心如，鲁文龙，冯超，吕向国，朱卫东. 血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架与多种细胞构建组织工程膀胱[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(21): 3088-3096.

Zhang Xin-ru, Lu Wen-long, Feng Chao, Lv Xiang-guo, Zhu Wei-dong . Constructing tissue-engineered bladder by vascular endothelial growth factor nanoparticle-bacterial cellulose composite scaffold with various kinds of cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(21): 3088-3096.

图/表（结果） 8

2.1 细胞培养及鉴定结果体外培养的舌黏膜上皮细胞呈铺路石样外观表现，培养3代内上皮细胞生长状态良好，形态均一；第3代的舌黏膜上皮细胞经AE1/AE3免疫荧光鉴定大部分细胞呈现阳性反应，后续进一步的流式细胞学检测提示同代上皮细胞纯度为88%。经酶消化法获取的舌肌细胞呈典型的梭形细胞样外观，7-10 d后达到90%-95%融合并表现为典型的“峰-谷”状或“漩涡”状生长；培养至第3代的舌肌细胞经α-SCA免疫荧光鉴定，92%的细胞呈现阳性反应，见图1。

2.2 血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架相关特性评估扫描电镜显示，血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架呈现多孔样网状编织状结构，整体材料厚度为(1.3±1.0) mm，支架纤维直径为(57.4±12.9) μm；在支架内部可见有散在分布的微球样颗粒，进一步在放大倍率下，可见颗粒样物基本呈现球形样规则外观，其直径为(235.5±79.6) nm，见图2。

复合材料的拉伸试验检测中，血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架与单纯细菌纤维素支架无论在弹力模量、断裂强度及断裂伸长率均未见明显统计学差异(P > 0.05)，见表1。

进一步的细胞毒性检测中，血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架组、细菌纤维素组、阴性对照组的A值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

后续ELISA检测中，相比单纯细菌纤维素支架，血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架可在体外持续释放血管内皮生长因子达3周，约在4周时达到释

放量的饱和状态，同时在释放的第7天开始可有明显释放量的增长，见图4。

2.3 细胞-支架材料的立体复合评估当上皮细胞和肌细胞与血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架在体外采用层叠法培养7 d后，苏木精-伊红染色切片中虽然无法显示细菌纤维素支架材料的清晰结构，但可见有明显两层细胞层的形成，其表层为连续排列上皮样细胞层，其下方细胞分布略微松散并有继续向下长入趋势，见图5。

2.4 膀胱缺损修复动物实验效果评估所有实验兔均存活至研究终点，在此期间未发生有明显的尿瘘或者尿外渗表现。

膀胱造影：植入3个月，实验组可见到相对完整的膀胱，对照组部分膀胱可见小面积充盈缺损。处死动物后的大体观察中，对照组可见修补处可有明显的瘢痕组织形成，同时可见有较多结石附着于修复处膀胱黏膜上；实验组修复处的膀胱黏膜略隆起，未见有明显瘢痕组织形成，亦未见有结石的堆积，见图6。

尿动力学检查：在模型制备前，实验组和对照组的膀胱最大容积分别为(69.55±8.68) mL和(66.31± 6.32) mL，植入后3个月，两组的膀胱最大容积均有下降，分别为(58.75±3.14)，(50.13±2.42) mL，对照组下降幅度高于实验组(P < 0.05)。在模型制备前，实验组和对照组的漏尿点压力分别为(3.45±0.78)，(3.64± 0.52) kPa，植入后3个月的漏尿点压力分别为(3.15± 0.51)，(2.67±0.60) kPa，对照组下降幅度高于实验组 (P < 0.05)。

在模型制备前，实验组和对照组的漏尿点压力分别为(3.45±0.78)，(3.64±0.52)kPa，植入后3个月的漏尿点压力分别为(3.15±0.51)，(2.67±0.60) kPa，对照组下降幅度高于实验组(P < 0.05)。

组织学检查：对照组膀胱替代组织表面未能构建出完整的上皮细层，其下方亦未能够证实有充分肌细胞的形成，同时采用CD31抗体的免疫组织化学染色中，仅见黏膜下方有少量微血管形成。实验组修复处膀胱组织的苏木精-伊红及免疫组织化学切片中可见到有完整上皮细胞层的形成，同时在使用α-SCA抗体的免疫组织化学切片中，可以见到黏膜下方有较多肌层形成，CD31检查可发现有较多量毛细血管形成，见图7。

参考文献

[1] Oberpenning F,Meng J,Yoo JJ,et al. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue enginnering. Nature Biotechnol. 1999;17:149-155.

[2] Atala A,Bauer SB,Soker S,et al.Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet.2006;367:1241-1246.

[3] Byung SK,Anthony A,James JY,et al. A collagen matrix derived from bladder can be used to engineer smooth muscle tissue.World J Urol. 2008;26:307-314.

[4] Yoo JJ,Meng J,Oberpenning F,et al.Bladder augmentation using allogenic bladder submucosa seeded with cells.Urology. 1998; 51(2):221-225.

[5] Zhu WD,Xu YM,Feng C,et al.Different bladder defects reconstructed with bladder acellular matrix grafts in a rabbit model.Urologe. 2011;50:1420-1425.

[6] Cheng EY,Kropp BP.Urologic tissue engineering with small—intestinal submucosa：potential clinical applications.World J Urol.2000;18:26-30．

[7] Sievert KD,Tanagho EA.Organ specific acellular matrix for reconstruction of the urinary tract.World J Urol.2000;18:19-25．

[8] Kropp BP,Sawyer BD,Shannon H E,et al. Characterization of small intestinal submucosa regenerated canine detrusor: assessment of reinnervation, in vitro compliance and contractiIity.J Uro1.1996;156:599-607．

[9] Anilkumar TV,Vineetha VP,Revi D,et al. Biomaterial properties of cholecyst-derived scaffold recovered by a non-detergent/enzymatic method.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2014; 102:1506-1516.

[10] Atala A.Tissue engineering of human bladder.Br Med Bull.2011;97:81-104.

[11] Record RD,Hillegonds D,Simmons C,et al.In vivo degradation of 14C-labeled small intestinal submucosa (SIS) when used for urinary bladder repair.Biomaterials.2001; 22:2653-2659.

[12] Bolland F,Korossis S,Wilshaw SP,et al. Development and characterisation of a full-thickness acellular porcine bladder matrix for tissue engineering. Biomaterials. 2007;28:1061-1070.

[13] Zhang Y,Frimberger D,Cheng EY,et al.Challenges in a larger bladder replacement with cell-seeded and unseeded small intestinal submucosa grafts in a subtotal cystectomy model.BJU Int. 2006;98:1100-1105.

[14] Pokrywczynska M,Jundzill A,Bodnar M,et al.Do mesenchymal stem cells modulate the milieu of reconstructed bladder wall? Arch Immunol Ther Exp (Warsz).2013;61:483-493.

[15] Pokrywczynska M,Adamowicz J,Sharma AK,et al.Human urinary bladder regeneration through tissue engineering -an analysis of 131 clinical cases. Exp Biol Med Maywood NJ.2013;239:264-271.

[16] Schaefer M,Kaiser A,Stehr M,et al.Bladder augmentation with small intestinal submucosa leads to unsatisfactory long-term results. J Pediatr Urol. 2013;9:878-883.

[17] Atala A,Bauer SB,Soker S,et al.Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet.2006;15:1241-1246.

[18] Petrovic V,Stankovic J,Stefanovic V.Tissue engineering of the urinary bladder: current concepts and future perspectives.Scientific World J. 2011;11: 1479-1488.

[19] Lam Van Ba O, Aharony S, Loutochin O, et al. Bladder tissue engineering: A literature review.Adv Drug Deliv Rev. 2015; 82-83:31-37.

[20] Petersen N,Gatenholm P.Bacterial cellulose-based materials and medical devices: current state and perspectives.Appl Microbiol Biotechnol. 2011; 91(5):1277-1286.

[21] Moreira S,Silva NB,Almeida-Lima J,et al.BC nanofibres: in vitro study of genotoxicity and cell proliferation.Toxicol Lett.2009;189(3):235-241.

[22] Dugan JM,Gough JE,Eichhorn SJ,et al.Bacterial cellulose scaffolds and cellulose nanowhiskers for tissue engineering.Nanomedicine(Lond). 2013;8(2): 287-298.

[23] Esguerra M,Fink H,Laschke MW,et al.Intravital fluorescent microscopic evaluation of bacterial cellulose as scaffold for vascular grafts.J Biomed Mater Res A. 2010;93(1):140-149.

[24] Helenius G,Backdahl H,Bodin A,et al.In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. J Biomed Mater Res A.2006;76(2):431-438.

[25] Brackmann C,Zaborowska M,Sundberg J,et al.In situ Imaging of Collagen Synthesis by Osteoprogenitor Cells in Microporous Bacterial Cellulose Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2012;18(3): 227-234.

[26] Andersson J,Stenhamre H,Bäckdahl H,et al.Behavior of human chondrocytes in engineered porous bacterial bcellulose scaffolds.J Biomed Mater Res A.2010;94(4): 1124-1132.

[27] Sanchavanakit N,Sangrungraungroj W, Kaomongkolgit R, et al.Growth of Human Keratinocytes and Fibroblasts on Bacterial Cellulose Film. Biotechnol Prog.2006;22(4): 1194-1199.

[28] Wippermann J,Schumann D,Klemm D,et al. Preliminary Results of Small Arterial Substitute Performed with a New Cylindrical Biomaterial Composed of Bacterial Cellulose. Eur J Vasc Endovasc Surg.2009;37(5):592-596.

[29] Zhou L,Yang B,Sun C,et al.Coadministration of plateletderived growth factor-BB and vascular endothelial growth factor with bladder acellular matrix enhances smooth muscle regeneration and vascularization for bladder augmentation in a rabbit model.Tissue Eng A.2013;19:264-276.

[30] Youssif M,Shiina H,Urakami S,et al.Effect of vascular endothelial growth factor on regeneration of bladder acellular matrix graft: histologic and functional evaluation. Urology.2005;66:201-207.

[31] Chen BS,Xie H,Zhang SL,et al.Tissue engineering of bladder using vascular endothelial growth factor gene-modified endothelial progenitor cells.Int J Artif Organs.2011; 34:1137-1146.

[32] Loai Y,Yeger H,Coz C,et al.Bladder tissue engineering: tissue regeneration and neovascularization of HA-VEGF-incorporated bladder acellular constructs in mouse and porcine animal models.J Biomed Mater Res A.2010;15: 1205-1215.

[33] Kikuno N,Kawamoto K,Hirata H,et al.Nerve growth factor combined with vascular endothelial growth factor enhances regeneration of bladder acellular matrix graft in spinal cord injury-induced neurogenic rat bladder.BJU Int. 2009;103:1424-1428.

[34] Cartwright L,Farhat WA,Sherman C,et al.Dynamic contrast-enhanced MRI to quantify VEGF- enhanced tissue-engineered bladder graft neovascularization: pilot study. Biomed Mater Res A.2006;77:390-395.

[35] Xiong Q,Lin H,Hua X,et al.A nanomedicine approach to effectively inhibit contracture during bladder acellular matrix allograft-induced bladder regeneration by sustained delivery of vascular endothelial growth factor.Tissue Eng Part A. 2015; 21(1-2):45-52.

[36] Jayo MJ,Jain D,Wagner BJ,et al.Early cellular and stromal responses in regeneration versus repair of a mammalian bladder using autologous cell and biodegradable scaffold technologies.J Urol.2008;180: 392-397.

[37] 朱卫东,徐月敏,冯超,等.脂肪干细胞复合膀胱脱细胞基质促进膀胱再生的实验研究[J].中华泌尿外科杂志, 2012,33(2):111-116.

[38] Sievert KD,Feil G,Renninger M,et al.Tissue engineering and stem cell research in urology for a reconstructive or regenerative treatment approach.Urologe A. 2007;46(9):1224-1230.

[39] Becker C,Jakse G.Stem cells for regeneration of urological structures.Eur Urol. 2007;51(5): 1217-1228.

[40] Polykandriotis E,Arkudas A,Horch RE,et al. Autonomously vascularized cellular constructs in tissue engineering: opening a new perspective for biomedical science. J Cell Mol Med.2007;11(1):6-20.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年9月至2015年3月在上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科实验室及动物中心完成。

1.3 材料成年清洁级雄性新西兰大白兔6只，体质量2.5-2.8 kg，由上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心提供，实验动物机构许可证号：SYKK(沪)2012- 0025。以上动物体格均健康且以正常饲料喂养。

1.4 实验方法

1.4.1 上皮及肌细胞的获取、培养及鉴定全麻无菌条件下切取6只兔舌黏膜组织(0.5 cm×0.5 cm)及兔舌骨骼肌(0.5 cm×0.5 cm)。将舌黏膜组织漂洗后，置入4 ℃的DispaseⅡ工作液中消化过夜，以分离上皮细胞层，于0.5%胰酶中消化15 min，终止消化后，1 500 r/min离心5 min并以KFSM培养基重悬，至80%-90%细胞融合时传代。将舌骨骼肌剪成1 mm³大小的组织块，置入0.2% Ⅱ型胶原酶中适时消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清后以含体积分数10%胎牛血清(美国 Gibco公司)的DMEM培养基(美国 Gibco公司)重悬，至80%-90%细胞融合时传代并采用差速贴壁法进行细胞纯化。当上述种子细胞培养扩增至第3代时，采用AE1/AE3抗体经免疫荧光法鉴定上皮细胞，同时α-SCA鉴定肌细胞。同时，上述抗体经流式细胞技术测定细胞纯度。

1.4.2 血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架的制备及相关特性测定

血管内皮生长因子微球的制备：将80 μL重组血管内皮生长因子165溶液(北京中科物源)(10 g/L)与800 μL葡聚糖水溶液(1%)混合，700 r/min搅拌30 min。将 1.6 mL壳聚糖(上海昊化)溶液(0.1%)逐步滴加于上述溶液中，搅拌5 min，最后加入80 μL硫酸锌，搅拌30 min；采用5%甘露醇孵育30 min，离心并重悬，将最终混悬液进行酸碱度调节及冻干处理。

多孔细菌纤维素支架的制备：将明胶海绵(南京金陵药业)支架置入含有木醋杆菌1.1.812(东华大学王华平教授课题组馈赠)的HS培养基(上海生工)中，于30 ℃恒温静置培养2周，经明胶溶解处理获得细菌纤维素多孔支架。进一步将细菌纤维素多孔支架用超纯水清洗，然后在3%NaOH溶液中100 ℃煮沸2 h，稀醋酸中和，超纯水清洗至中性，高压灭菌，低温4 ℃保存备用

血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素复合支架的制备：将制备的血管内皮生长因子微球重悬至25%的浓度，将细菌纤维素支架置入微球溶液中，每次在10 ℃环境下静置12 h，反复3次后，50 ℃干燥处理并予以⁶⁰Co照射消毒，待测。

复合材料的性能测定：①采用扫描电镜观察复合材料的空间结构及其内部纳米微球结构。②力学拉伸法测定材料的生物力学特性：将上述制备的复合支架材料裁减成2.5 cm×1.0 cm大小的试件，以单纯细菌纤维素支架为对照组。在1011 INSTRO单向拉伸实验机上进行，以10 mm/min的速度对试样施加拉应力，试样破坏后，记录各组标本的抗拉强度、断裂伸长率、弹性模量。③ELISA法检测复合材料体外释放血管内皮生长因子的时效及能力：将5 cm×5 cm的复合支架材料置入50 mL PBS 中，每2 d从中提取2 mL PBS，采用ELISA试剂盒测定血管内皮生长因子释放量，并计算累计释放率。④MTT法评估材料的生物毒性：将复合支架材料和单纯细菌纤维素材料剪裁成小块状，浸泡于DMEM完全培养基中，浸提比例为5 cm²/mL，静置于37 ℃、体积分数5%CO₂、体积分数95%空气的细胞培养箱中5 d，后收集其浸提液备用。将舌肌细胞按1×10⁵的密度接种于96孔板中，同时每孔中加入180 µL材料浸提液，每种支架材料以4孔为一组，以加入新鲜培养液的为阴性对照组，培养1，3，5，7 d时，在每孔中加入20 µL MTT(5 g/L)，37 ℃培养箱中继续培养4 h后移去溶液，每孔加入200 µL DMSO，避光振荡10 min。用酶标仪在490 nm波长测定吸光度值。

1.4.3 细胞-支架材料的立体复合及评估细胞-支架复合前，首先将消毒后的复合支架材料与单纯细菌纤维素材料预先浸泡于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中6 h。收集培养扩增至第3代的舌肌细胞，按1×10⁸ L^-1的细胞浓度分别接种于已吸干水分的复合材料支架与单纯细菌纤维素材料上，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养3 d后，进一步收集培养扩增至第3代的舌上皮细胞，按1×10⁸ L^-1的细胞浓度分别接种复合材料与单纯细菌纤维素材料肌层的上方，在DMEM(含体积分数10%胎牛血清)和DKSFM等体积混合的培养液中继续培养3 d，进行后续动物模型实验。同时部分支架材料取出固定后行传统苏木精-伊红染色，以评估复合效果。

1.4.4 细胞-支架复合材料在兔复合模型中的修复重建及相关效果评估

细胞-支架复合材料修复膀胱缺损：将6只新西兰大白兔随机分为实验组与对照组，每组3只。采用苯巴比妥钠麻醉实验兔后置入F8导尿管，常规消毒铺巾后，于腹部中线处切开皮肤及皮下各层组织，仔细游离膀胱组织，完成游离后在膀胱顶前壁制造3 cm×3 cm大小缺损，0号丝线将修复材料四角与膀胱缺损边缘四角作为标记之后，实验组将同等大小的复合自体上皮及肌细胞的血管内皮生长因子纳米微球-细菌纤维素支架侧缘与剩余膀胱缺损组织边缘以3-0可吸收缝线进行连续缝合，对照组将同等大小的复合自体上皮及肌细胞的细菌纤维素支架侧缘与剩余膀胱缺损组织边缘以3-0可吸收缝线进行连续缝合，缝合过程中复合体细胞面始终保持朝向膀胱腔。依次关闭各层组织后，保留上述导尿管直至其自行脱落。

细胞-支架复合材料修复膀胱缺损的效果评估：植入后3个月时进行相关评估检验。处死前于麻醉状态下行膀胱造影，以评估其影像学表现，同时采用尿动力学方法测定兔最大膀胱容量及膀胱漏尿点压力。完成上述检查后处死实验兔，进行膀胱修补处大体观察，并依据标记线位置裁减膀胱组织，进行石蜡包埋及苏木精-伊红组织学检测。另外通过AE1/AE3、α-SMA、CD31抗体进免疫组化行进一步的回植效果评估。

1.5 主要观察指标细胞-支架复合效果及细胞-支架复合材料修复膀胱缺损的效果

1.6 统计学分析采用SPSS 15.0统计学软件行t 检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

利用组织工程技术进行膀胱修复重建的可行性已毋庸置疑，由于膀胱自身结构与功能方面的特点，在利用该技术重建较大范围的膀胱壁缺损时，需要充分考虑到重建后膀胱的延展性及收缩能力。因而在构建组织工程膀胱中，不但需要采用多种种子细胞进行复合，以尽可能地模拟正常生理状态下的膀胱组织结构，而且还需要一种大面积符合组织工程要求的支架材料，以充分保证细胞的黏附和增殖，另一方面，还要做到支架材料降解后种子细胞自身存活能力的完整。

以往进行的一些应用组织工程技术构建膀胱的研究中，应用了多种支架材料，取得了一定的成功^[2-5]。作为细胞外基质的代表，小肠黏膜下组织是早期泌尿系重建中一种常用的细胞支架材料^[6-9]，尽管其具有较好的降解性、组织兼容性，在无细胞化状态下仍可有生长因子渗入^[10-12]，但其较为致密、组织强度不理想的特点最终导致瘢痕的过度增生及替代部位的挛缩，并非理想用于大面积修复膀胱缺损的组织工程支架材料，即使是在添加一定生长因子的条件下，仍然不能获得满意的组织间整合效果^[13-17]。另一类广泛应用的组织工程膀胱重建支架是合成材料，其包括聚乙烯醇海绵、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚已内酯等^[18]。由于人工合成材料本身的物理特性，降解过程中其代谢产物可明显改变替代组织周围的微环境，且这种影响和刺激往往是持续性存在的，因而最终可对修复处的膀胱组织带来明显影响^[19]。基于上述材料的优缺点，在本实验中采用了细菌纤维素作为构建支架的主要组成部分，其产自于木醋杆菌等菌株，是一种天然β-葡萄糖聚合物，其独特的超细纤维网络结构、卓越的机械性能、低免疫原性、良好的生物相容性使之在生物医学领域引起人们的广泛关注，并已被证明可应用在人工骨^[20-26]、皮肤^[27]、人工血管^[28]。利用木醋杆菌菌系于培养液液面形成三维的细菌纤维素支架材料，其微纤维直径为3.0-4.0 nm，而由微纤维束形成的纤维丝带宽度为70-80 nm，是目前已知的最细纳米级天然纤维，因而可有效模仿细胞外基质。在本研究中，通过生物力学的检测还证实了该类材料有着较为理想的力学强度，与以往小肠黏膜下组织材料的部分报道相仿。由于膀胱在充盈状态下其组织需要承担较大的力学牵拉，而研究的结果也进一步在理论上支持选用该类材料进行膀胱的修复重建。值得一提的是，鉴于细菌纤维素的自身特性，其在自组装过程中会自然形成网状交织样结构。在研究中发现，虽然该类多孔样结构的孔径尚未能达到促进细胞的充分渗透，但足以使得各类纳米直径的微球在其中有效分布，这从间接角度也证明了生长因子和氧气可在该材料内部充分渗透，以保证表面各类种子细胞的存活。

研究中所制备材料的厚度为(1.3±1.0) mm，而这一厚度按照现有理论来看，无法使得毛细血管网得以充分渗透，因而不能够充分保障支架物上细胞的供氧和营养补给。同时对于修复大面积膀胱缺损，如无法尽快建立移植物的血供，以促成细胞生长的微环境，移植物必将因缺氧及必需的营养而坏死。与细胞外基质材料特性有所不同，细菌纤维素本身并没有相关生长因子，所以如要保证其上的种子细胞乃至整体复合材料的存活，就必须引入外源性血供或者生长因子。但目前在体外中建立完整的移植物血供依然相当困难^[29-32]，相对而言，在支架材料中引入一些促血管化的生物活性因子如血管内皮生长因子，则成为了解决移植物血供的方向。但血管内皮生长因子的颗粒较小且半衰期较短，难以达到在移植部位持续释放，因此许多研究在提高血管内皮生长因子效能方面做了很多改进^[30^，^33-35]。研究中还是采用了聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹血管内皮生长因子形成相关纳米微球。在此次研究中制备的纳米微球大致直径在(232.5±79.6) nm，由于原有细菌纤维素已形成多孔网状结构，因而能够使得纳米微球充分分布其间发挥作用。

在ELISA实验中，本材料对于体外血管内皮生长因子的释放能力已能够达到3周之久，就这一点来说已能够达到预期缓释释放的目标，而3周的时间正好与组织修复替代的生理进程相契合。更值得一提的是，研究中制备材料的血管内皮生长因子释放并非是线性的，而是在第7天开始有一显著的上升。这种时间上的变化正好避开了种子细胞和支架在体外复合的时间段，使得复合后的支架材料在植入膀胱后能够充分发挥其促血管化作用，而这种促血管化作用，在动物实验植入后3个月的组织切片免疫组织化学检测中得到了充分体现。

由于研究中所涉及的纳米微球包被材料是聚乳酸-羟基乙酸共聚物，虽然该类材料在膀胱组织工程修复重建中的可行性已在以往的基础研究中得到了证实^[36]，但在研究之初，作者仍然担心聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球在降解过程中可能对材料周围微环境乃至细胞产生不良影响。在上述的ELISA实验中，由于血管内皮生长因子的释放在第7天开始有一显著的上升，故可认为在7-10 d时间内是聚乳酸-羟基乙酸共聚物逐步降解的高峰时段。因而在进行MTT测定评估中，还是选择 7 d进行分析。而实验结果也证明嵌入聚乳酸-羟基乙酸共聚物包被血管内皮生长因子微球的细菌纤维素材料，对周围组织和细胞无明显的细胞毒性，并不会对组织工程膀胱复合物产生不利影响，因此是一种提高组织工程膀胱重建效率的理想材料。

在选择膀胱缺损修补面积时，参考朱卫东等^[37]在以往膀胱修复重建中的研究成果，选择约30%面积的膀胱缺损进行修复，按照其理论在该范围的膀胱缺损，最能够体现利用复合细胞的材料在修复膀胱中的实际作用。因而在整体实验设计中均加入了相关的种子细胞。有别于以往文献中利用相关间充质干细胞进行膀胱修复的方案^[37-40]，在此次研究中采用了自体上皮细胞及肌细胞作为复合支架的种子细胞，这样的选择方案，不仅避免了间充质干细胞在回植体内后生长方向的难以掌控，同时该种立体层叠的复合模式可接近正常膀胱壁的结构，另外复合上皮细胞所形成的细胞屏障可以最大限度地将尿液与材料之间进行分隔，从而保证支架内血管内皮生长因子微球的正常生物活性，加速组织修复。当然，由于本研究是系列研究中的第一阶段，因而种子细胞在体内的示踪研究将在后续的研究中进行深入的探讨。

在研究中也发现，虽然多层组织修复重建的可信性已得到证实，但从术后3个月动物模型的实际组织学表现上来看，还尚未能达到完全与正常组织拟合的表现。作者认为主要问题还是在于实验设计时间点尚短，组织的完全修复在3个月左右的时间内并不一定充足，在后续研究中更长时间的观察将被考虑在实验设计中，以进一步证明材料在膀胱修复重建中的长期疗效，同时在后期研究中还会进一步探索利用该材料进行更大面积的膀胱修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程