2.1  脱细胞效果观察  正常猪膀胱的组织结构主要分为移行上皮层和基层(图2A)。胰酶脱细胞液能有效去除移行上皮细胞，0.75%、1%胰酶处理后的膀胱组织中未见明显的移行上皮细胞残留；但是其对平滑肌细胞的去除效果较差，0.75%、1%胰酶处理后的膀胱组织中仍有大量平滑肌细胞核残留(图2B，C)。与此相反，SDS对平滑肌细胞的去除效果较好，5%、10%SDS处理后的膀胱组织中未见明显的平滑肌细胞残留；但是其对移行上皮细胞的去除效果较差，5%、10%SDS处理后的膀胱组织移行上皮层可见大量DNA样组织残留(图2E，F)。与以上对照组相比，采用两段式胰酶+SDS脱细胞方法可有效去除移行上皮和平滑肌细胞，取得较好结果(图2D)。



2.2  细胞外基质检测  VG染色表明猪膀胱的细胞外基质由红色胶原纤维、蓝色弹力纤维和黄色平滑肌组成。与正常对照组相比，1%胰酶、0.75%胰酶、0.6%胰酶+5%SDS、5%SDS脱细胞处理膀胱组织疏松，但胶原纤维、弹力纤维、肌组织结构完整，未见明显断裂；10%SDS脱细胞处理膀胱组织疏松，部分区域胶原纤维断裂。见图3。



2.3  DNA残留检测  脱细胞处理后，正常对照、1%胰酶、0.75%胰酶、0.6%胰酶+5%SDS、5%SDS、10%SDS组的DNA含量分别为(4 252.0±297.4)，(1 377.0±234.3)，   (1 771.0±205.2)，(49.8±30.1)，(3 521.0±929.0)，(2 913.0± 732.2) μg/g干重组织，见图4。与正常对照组相比，胰酶处理组能显著降低膀胱组织DNA含量(P < 0.05)，其中0.6%胰酶+5%SDS组的DNA含量最低，而SDS处理组去除组织DNA的效果与正常组织无明显差异(P > 0.05)。



2.4  α-Gal残留检测  采用Western blot检测组织中残留的α-Gal抗原，并用β-actin作为对照。如图5所示，1%胰酶、0.75%胰酶、0.6%胰酶+5%SDS、5%SDS、10%SDS均能有效去除α-Gal抗原，但是SDS组还有少量α-Gal抗原残留。与正常组织相比，胰酶处理组显著破坏β-actin，而0.6%胰酶+5%SDS、5%SDS、10%SDS处理方式对β-actin无明显破坏。

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近年来，随着组织工程的发展，动物支架成为研究的核心内容之一，理想的生物材料支架需具备生物相融性、抗钙化、细胞亲和性等优点。脱细胞方法去除组织中的细胞成分，能够得到具有无免疫原性、结构完整等优点的生物支架^[1-2]，为尿路修补寻找合适的替代材料提供了新思路^[3]。膀胱缺损是临床上常见的外科疾病之一，目前临床上主要的治疗方法是膀胱修补术，组织工程膀胱脱细胞基质受到人们越来越多的关注^[4-5]。猪膀胱脱细胞基质来源广泛，具备天然的细胞外支架结构，成为组织工程膀胱替代材料研究的热点^[6-8]。此次实验中采用物理和化学方法结合对猪膀胱进行脱细胞处理，通过脱细胞效果、细胞外基质完整性保留、细胞外基质DNA残留检测和α-Gal抗原检测，研究猪膀胱作为组织工程生物材料的可行性，为其临床应用提供一定的参考价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  随机对照，材料制备实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年3月在海军军医大学附属长海医院心胸外科实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  试剂及设备  十二烷基硫酸钠(dodecyl sodium sulfate，SDS)为上海国药集团化学试剂有限公司产品，胰蛋白酶(life science)、乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic，EDTA)为中国医药上海化学试剂站产品，三(羟甲基)氨基甲烷(trismethyl aminomethane, Tris)购自上海国药集团化学试剂有限公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS) 为迈欣试剂产品，DNA定量试剂盒(康宁生命科学有限公司)，α-Gal抗体(GenTex公司，美国)，Western blot(上海雅酶生物科技有限公司)，Epoch型酶标仪(BioTek公司)。

  工作液配制：10 mmol/L Tris缓冲液配制成5%SDS(pH 7.6)、10%SDS(PH 7.6)；10 mmol/L Tris缓冲液配制成 0.53 mmol/L的EDTA溶液，0.6%胰蛋白酶+5%SDS的EDTA溶液(pH 8.0)，0.75%胰蛋白酶的EDTA溶液(pH 8.0)，1%胰蛋白酶的EDTA溶液(pH 8.0)。

1.3.2  膀胱材料  新鲜的猪膀胱取自上海松林肉食品有限公司，5月龄左右家猪，雌雄不限，体质量约120 kg，动物许可证号为SYXK(沪)2017-0004。标本在冷藏提条件下运输回实验室，用无菌的PBS清洗干净猪膀胱，去除膀胱表面的杂质和血管。

1.4  方法

1.4.1  脱细胞处理方法  将猪膀胱剪成约1 cm×1 cm，随机分到实验组和正常对照组，平均每组设置6个重复标本：①正常对照组：不做任何处理；②实验组：0.6%胰蛋白   酶+5%SDS溶液(pH 8.0)；③脱细胞对照组：0.75%胰蛋白酶(pH 8.0)；1%胰蛋白酶(pH 8.0)；5%SDS(pH 7.6)；10%SDS(pH 7.6)。

实验组和脱细胞对照组标本浸入无菌PBS中，液氮冻融5次，每次3 min；将标本再次用无菌PBS清洗2遍；实验组浸入0.6%胰蛋白酶的胰酶溶液，37 ℃摇床，浸泡3 d，将标本再次用无菌PBS清洗2遍，随后浸入5%SDS溶液中，40 ℃，浸泡3 d。其余脱细胞对照组标本则浸入各自脱细胞工作液处理6 d。脱细胞处理后，去离子水处理12 h，无菌PBS清洗4 d以去除胰酶或去污剂。见图1。

1.4.2  猪脱细胞膀胱支架的苏木精-伊红染色  将各组猪脱细胞膀胱支架植入体积分数4%中性甲醛溶液中固定12 h，石蜡包埋组织切片，常规脱蜡，苏木素染色5 min，自来水冲洗干净；盐酸乙醇分化2 s；自来水冲洗；盐酸乙醇返蓝30 s；自来水冲洗，体积分数95%乙醇1 s；伊红染液1 min；吹干，中性树胶封固。

1.4.3  猪脱细胞膀胱支架的VG染色  石蜡包埋组织切片，常规脱蜡，VB染液染色40 min，VG染液染色5 min，吹干，中性树胶封固。

1.4.4  猪脱细胞膀胱支架的DNA定量检测  标本处理：组织抽干，液氮研磨成粉末状，称质量，固定每个标本的质量约为20 mg；加入350 µL Buffer PBS和4.5 µL RNase A酶充分混匀30 s；加入150 µL Buffer C-L和20 µL蛋白酶K，漩涡混匀1 min；短暂离心后置于56 ℃水浴锅中至组织完全消化；加入350 µL P-D，混匀30 s，12 000×g离心10 min；将DNA制备管于2 mL离心管中，上述混合液移至制备管中，12 000×g离心1 min；弃滤液，加500 µL Buffer W1，12 000×g离心1 min；弃滤液，加700 µL Buffer W2，12 000×g离心1 min，重复1次；弃滤液，12 000×g离心    1 min；更换DNA制备管，加100 µL Eluent水(最好先在56 ℃预热)，静置1 min，12 000×g离心1 min洗脱DNA；上机测定。

1.4.5  猪脱细胞膀胱支架的Western blot检测α-Gal抗原  液氮将组织研磨成粉末状，称质量后，每100 mg组织加入  20 µL SDS裂解细胞，测定BCA蛋白浓度。配置分离胶和浓缩胶；上样量20 µL，电泳60 V，30 min；110 V，90 min；转膜270 mA 90 min；封闭1 h；一抗α-Gal(1∶1 000稀释)4 ℃孵育12 h；二抗室温孵育1 h；显影液A∶B=    1∶1稀释，显影。

1.5  主要观察指标  苏木精-伊红染色观察猪脱细胞膀胱支架的脱细胞效果；VG染色检测猪脱细胞膀胱支架的细胞外基质：DNA定量检测支架的DNA残留；Western blot检测组织中残留的α-Gal抗原。

1.6  统计学分析  采用Prism软件进行统计分析。所有连续变量以x(_)±s表示，两组组间比较采用t 或Mann Whitney test检验。P < 0.05认为差异有显著性意义。

脱细胞组织工程技术使用物理、化学、酶促等方法，通过去除天然组织材料的细胞成分，减少甚至去除其免疫原性，保留组织的细胞外框架结构，从而获得为人们组织、器官等移植的生物替代材料^[9-10]。由于细胞成分是引起移植排斥反应的主要原因，因此组织工程猪膀胱的制备首先要去除其抗原性，即对猪膀胱进行脱细胞处理。该实验采用的脱细胞方法是液氮冻融、胰蛋白酶消化和化学试剂SDS联合脱细胞，在去除膀胱抗原性的同时，能够完整地保留其天然的细胞外基质结构^[11-13]。

膀胱壁较厚，从内向外可分为移行上皮层、肌层和被膜层^[14]。膀胱壁的细胞数量多，黏膜层为大量的移行上皮细胞，肌层有丰富的平滑肌细胞^[15]。因此，实验在对猪膀胱脱细胞方法选择时，使用了具有较强脱细胞效果的胰蛋白酶和SDS。胰蛋白酶可溶解膀胱壁的基质成分，并且可以破坏细胞的完整性^[16]。在此次研究中发现使用胰蛋白酶消化细胞时，发现膀胱壁的移行上皮层的脱细胞效果较好，而对肌层的脱细胞效果较差，并且大量消化细胞基质。SDS有较强的脱细胞效果，可以使蛋白质发生溶解、变性^[17]，实验中使用SDS脱细胞时，对肌层的去细胞效果较好，但是对移行上皮层的去细胞效果较差，不如胰蛋白酶。由于胰蛋白酶本质上是蛋白质，因此SDS也能破坏胰蛋白酶的结构，从而影响胰蛋白酶的脱细胞效果，因此此次实验选择了先用胰蛋白酶消化膀胱壁的移行上皮层细胞，再使用SDS去除膀胱壁的肌层细胞成分。一方面，避免了高浓度胰蛋白酶对膀胱基质的破坏，维持膀胱组织结构的稳定性，另一方面降低高浓度SDS对膀胱组织的毒性作用^[18]。而液氮冻融法通过反复的冷冻和融化，使膀胱组织内的细胞形成冰晶，使细胞发生肿胀破碎^[19-20]，增强胰蛋白酶和SDS的脱细胞效果^[19，21-22]，从而彻底去除膀胱的细胞成分。

细胞中DNA和α-Gal是引起移植排斥反应的两种主要抗原^[10，23]。α-Gal为α-半乳糖基转移酶，其本质是一组糖蛋白或糖脂，广泛分布于除灵长类的大多数哺乳动物体内，在猪的所有组织中均有分布^[24]。由于人体预存有天然的抗α-Gal抗体^[25]，因此作为替代材料的猪膀胱移植入人体后会引起超急性排斥反应，导致移植失败。因此，首先要去除猪膀胱组织内的α-Gal抗原和细胞核内的DNA成分。此次研究中蛋白免疫印迹结果显示在0.6%胰蛋白酶+5%SDS组脱细胞处理后，猪膀胱组织内已经无α-Gal抗原表达，表明0.6%胰蛋白酶+5%SDS组可显著降低猪膀胱组织内的α-Gal抗原成分。DNA残留检测是观察猪膀胱脱细胞效果的一项指标，此次实验DNA残留检测结果显示胰蛋白酶可明显去除细胞核内的DNA成分，其中实验组0.6%胰蛋白酶+ 5%SDS的DNA残留量最低，去除DNA效果高于单纯高浓度胰蛋白酶组和单纯高浓度SDS组。

细胞外基质的完整保留是组织工程脱细胞效果的一个检测指标^[26]，β-actin为β-肌动蛋白，是构成细胞骨架的主要成分，能够较高且稳定表达于几乎所有的真核生物细胞内，经常用作内标基因^[27]。由于胰蛋白酶浓度增加或消化组织时间延长，均会严重溶解猪膀胱细胞外基质，使蛋白质裂解为氨基酸^[28]，因此0.75%胰蛋白酶和1%胰蛋白酶组无β-肌动蛋白和α-Gal抗原的表达。而0.6%胰蛋白酶+5%SDS组由于胰蛋白酶的浓度相对较低，且胰蛋白酶消化猪膀胱的时间减半，因此对细胞外基质蛋白溶解程度较低，在脱细胞处理后能够较完整的保留膀胱的细胞外基质成分^[29-31]。

此次研究中脱细胞处理后的组织工程膀胱的优点有：①完全去除猪膀胱组织内的细胞成分，不易引起移植排斥反应；②完整保留膀胱组织的细胞外基质成分，移植后能够维持膀胱天然的组织结构和生理功能。但是，对猪膀胱脱细胞后机械性能的检测、生物相容性等方面还需进一步研究^[32]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：
脱细胞：生物移植或修补材料制备过程中常用到脱细胞方法，脱细胞能很好的保留组织的成分，降低移植或修补后的免疫原性，同时保持良好的机械性能，在临床上得到较为广泛的应用。
猪膀胱支架：利用不同的脱细胞方法去除猪膀胱组织中的细胞后制备为猪膀胱支架，既保留了细胞外基质的完整性，又可以降低移植后排斥反应，为进一步的对组织工程支架材料的研究奠定了可行的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

细胞中DNA和α-Gal是引起移植排斥反应的两种主要抗原。α-Gal为α-半乳糖基转移酶，其本质是一组糖蛋白或糖脂，广泛分布于除灵长类的大多数哺乳动物体内，在猪的所有组织中均有分布。由于人体预存有天然的抗α-Gal抗体，因此作为替代材料的猪膀胱移植入人体后会引起超急性排斥反应，导致移植失败。因此，首先要去除猪膀胱组织内的α-Gal抗原和细胞核内的DNA成分。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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