脱细胞异种生物外科补片的免疫原性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2343

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (34): 5564-5569.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2343

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脱细胞异种生物外科补片的免疫原性

程祥¹，郭欢¹，刘燕萍¹，韦晓慧²，雷丹²，巫涛¹，黄婷¹，黄明¹，荣祖元¹，凌友²

¹四川省食品药品检验检测院，四川省成都市 611731；²冠昊生物科技股份有限公司，再生型医用植入器械国家工程实验室，广东省广州市 510530

收稿日期:2019-12-23 修回日期:2019-12-27 接受日期:2020-02-26 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-11
通讯作者: 荣祖元，研究员，四川省食品药品检验检测院安全评价中心，四川省成都市 611731 凌友，博士，冠昊生物科技股份有限公司，再生型医用植入器械国家工程实验室，广东省广州市 510530
作者简介:程祥，男，1990年生，江苏省泰州市人，汉族，2015年西南交通大学毕业，硕士，主要从事医疗器械生物学评价工作。
基金资助:
四川省食品药品检验检测院院立科研项目(2018-KYYL-008)；国家重点研发计划课题(2018YFC1105902)

Immunogenicity of heterogeneous acellular biosurgical patch

Cheng Xiang¹, Guo Huan¹, Liu Yanping¹, Wei Xiaohui², Lei Dan², Wu Tao¹, Huang Ting¹, Huang Ming¹, Rong Zuyuan¹, Ling You²

¹Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 611731, Sichuan Province, China; ²Guanhao Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative Implantable Medical Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China

Received:2019-12-23 Revised:2019-12-27 Accepted:2020-02-26 Online:2020-11-08 Published:2020-09-11
Contact: Rong Zuyuan, Researcher, Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 611731, Sichuan Province, China Ling You, PhD, Guanhao Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative Implantable Medical Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China
About author:Cheng Xiang, Master, Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 611731, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Sichuan Institute for Food and Drug Control, No. 2018-KYYL-008; the National Key Research &Development Program of China, No. 2018YFC1105902

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

免疫原性：指能够刺激免疫系统的细胞引起某种抗原特异性免疫应答。当动物源性材料植入人体后，其细胞表面的α-Gal抗原与人体内存在的天然抗α-Gal抗体结合，会激活补体系统引起严重的超急性排斥反应；还可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用，引起异种移植排斥反应。对于异种材料植入人体所产生的潜在风险，有必要对其进行免疫原性风险评估。

脱细胞技术：指通过物理、化学、生物学等一系列的方法处理同种异体的组织、器官，使其细胞内基质除去完全而保留相应的细胞外基质的方法。脱细胞技术可降低甚至除去异体组织、器官的免疫源性(如α-Gal抗原)等，降低异体生物材料移植引起的排斥反应，为异体生物材料的临床运用提供基础。

背景：脱细胞异种生物外科补片的免疫原性直接关系到其植入人体后的成功与否，因而评价材料的免疫原性至关重要。

目的：评价脱细胞异种生物外科补片的免疫原性。

方法：将20只Balb/c小鼠随机分4组，每组5只：实验组与对照组背部皮下分别植入脱细胞异种生物外科补片与心包膜原材料；阴性对照组行假手术操作；阳性对照组背部皮下注射弗氏佐剂和牛血清白蛋白等体积混合液。植入4周后，记录小鼠体质量，计算各组脾脏和胸腺的脏脑系数，检测血清总IgG和IgM水平、体外淋巴细胞增殖活性及脾脏淋巴细胞亚型分布，并进行植入部位皮肤组织及脾脏、胸腺组织病理学观察。实验方案经四川省食品药品检验检测院安全评价中心实验动物管理和使用委员会批准(IACUC-2018-KYYL-008)。

结果与结论：①实验组与阴性对照组体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，对照组大于阴性对照组(P < 0.05)；②实验组与阴性对照组脾脏脏脑系数、胸腺脏脑系数比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，对照组脾脏脏脑系数大于阴性对照组(P < 0.05)；③实验组与阴性对照组淋巴细胞增殖活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)，对照组高于阴性对照组(P < 0.05)；④与阴性对照组相比，实验组CD3⁺CD8⁺细胞百分比降低(P < 0.05)；与阴性对照组相比，对照组CD3⁺细胞、CD3⁺CD4⁺细胞、CD3⁺CD8⁺细胞、CD45⁺SSClow细胞百分比下降(P < 0.05)，CD3^-CD19⁺细胞百分比升高(P < 0.05)；⑤实验组、对照组血清IgM和IgG抗体水平与阴性对照组相比差异均无显著性意义(P < 0.05)；⑥组织学显示，实验组与对照组脾脏和胸腺无明显病理改变，实验组植入部位无明显炎性反应，对照组植入部位出现严重肉芽肿性炎及纤维组织增生包裹、植入物坏死崩解等；⑦结果表明与原材料相比，经脱细胞处理的异种生物外科补片可有效降低免疫原性反应。

ORCID: 0000-0003-3480-6101(程祥)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 脱细胞">, , 补片">, , 免疫原性">, , 心包膜">, , 脾脏">, , 胸腺">, , 淋巴细胞">, , 抗体

Abstract:

BACKGROUND: Since the removal of immunogenicity of heterogeneous acellular patch is directly related to the success of the implantation into human body, it is vital to evaluate the immunogenicity of the material.

OBJECTIVE: To evaluate the immunogenicity of heterogeneous acellular surgical path.

METHODS: Twenty Balb/c mice were randomly divided into four groups (n=5 per group). Mice in the experimental group and control group were subcutaneously implanted with heterogeneous acellular biosurgical patch and pericardium on the back. Negative controls received sham operation. Mice in the positive control group received subcutaneous injection of the mixture of Freund’s adjuvant and bovine serum albumin in equal volumes. At 4 weeks after implantation, the body weight of mice was recorded; the coefficients of spleen and thymus were calculated; the level of total serum IgG and IgM, the proliferation activity of lymphocytes in vitro and the distribution of lymphocyte subtypes in the spleen were measured; and the histopathology of the skin, spleen and thymus was observed. The experiment was approved by the Laboratory Animal Management and Use Committee of Safety Evaluation Center, Sichuan Institute for Food and Drug Control (approval No. IACUC-2018-KYYL-008).

RESULTS and CONCLUSION: (1) There were no significant changes in the mouse body weight between the experimental group and negative control group (P > 0.05). Body weight was higher in the control group than in the negative control group (P < 0.05). (2) There was no significant difference in the brain ratios of spleen and thymus between the experimental group and the negative control group (P > 0.05). The brain ratio of spleen was higher in the control group than in the negative control group (P < 0.05). (3) There was no significant difference in lymphocyte proliferation between the experimental group and the negative control group (P > 0.05). Lymphocyte proliferation was higher in the control group than in the negative control group (P < 0.05). (4) Compared with the negative control group, the percentage of CD3⁺CD8⁺ cells was significantly decreased in the experimental group (P < 0.05). Compared with the negative control group, the percentages of CD3⁺ cells, CD3⁺CD4⁺ cells, CD3⁺CD8⁺ cells, and CD45⁺SSClow cells were decreased (P < 0.05) and the percentage of CD3^-CD19⁺ cells was increased (P < 0.05) in the control group. (5) There was no significant difference in serum IgM and IgG antibody levels between the experimental and control groups and the negative control group (P < 0.05). (6) The histological examination results showed that there were no obvious pathological changes in the spleen and thymus in the experimental group and the control group, and no obvious inflammatory reaction in the experimental group. In the control group, there were severe granulomatous inflammation, fibrous tissue hyperplasia, wrapping, necrosis and disintegration of implants. (7) The results demonstrated that compared with the raw material, the immunogenicity of acellular treated biosurgical patch could be reduced effectively.

Key words: materials">, , acellular, patch">, , immunogenicity">, , pericardium">, , spleen">, , thymus">, , lymphocyte">, , antibody

中图分类号:

程祥, 郭欢, 刘燕萍, 韦晓慧, 雷丹, 巫涛, 黄婷, 黄明, 荣祖元, 凌友. 脱细胞异种生物外科补片的免疫原性 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5564-5569.

Cheng Xiang, Guo Huan, Liu Yanping, Wei Xiaohui, Lei Dan, Wu Tao, Huang Ting, Huang Ming, Rong Zuyuan, Ling You. Immunogenicity of heterogeneous acellular biosurgical patch[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(34): 5564-5569.

图/表（结果） 5

2.1 各组小鼠体质量变化分别在植入材料前和取材前称Balb/c小鼠体质量。植入材料前，4组小鼠体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；取材前，对照组体质量大于阴性对照组(P < 0.05)，阳性对照组、实验组体质量与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.2 各组脏脑系数的比较实验选取Balb/c小鼠的胸腺、脾脏质量及其脏脑系数考察材料植入后对动物免疫器官的影响。结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组、对照组脾脏质量和脾脏/脑系数均增加(P < 0.05)；实验组胸腺、脾脏质量和脏脑系数与阴性对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.3 各组体外淋巴细胞增殖实验结果体外培养72 h后，与阴性对照组相比，实验组450 nm处的吸光度值无显著变化，阳性对照组和对照组450 nm处的吸光度值增高(P < 0.05)，其中对照组吸光度值为阴性对照组的2.1倍，见图1。

2.4 各组小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析结果与阴性对照组相比，阳性对照组的CD3⁺CD4⁺细胞、CD3⁺CD8⁺细胞、CD45⁺SSClow细胞、CD3^-CD49b⁺细胞百分比均下降(P < 0.05)，CD3^-CD19⁺细胞百分比升高(P < 0.05)；与阴性对照组相比，实验组CD3⁺CD8⁺细胞百分比降低(P < 0.05)；与阴性对照组相比，对照组CD3⁺细胞、CD3⁺CD4⁺细胞、CD3⁺CD8⁺细胞、CD45⁺SSClow细胞百分比下降(P < 0.05)，CD3^-CD19⁺细胞百分比升高(P < 0.05)，见图2。

2.5 各组血清总抗体检测结果与阴性对照组相比，阳性对照组中IgG和IgM水平均增高，其中IgM水平比较差异有显著性意义(P < 0.05)；实验组、对照组IgM和IgG抗体水平与阴性对照组相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.6 各组组织病理学观察结果各组小鼠脾脏和胸腺部位均未见明显组织病变。植入部位组织病理观察如图4所示，阳性对照组中局部可见少量炎细胞浸润；实验组未见明显炎性反应，且植入物形态良好；对照组植入部位出现严重肉芽肿性炎及纤维组织增生包裹、植入物坏死崩解等。

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引言

机体的组织修复一直是外科整形重建中的重要课题之一，伴随医学及多种生物技术的不断提高，生物材料被研发并逐渐运用于临床，并取得了显著效果^[1]。近年来采用脱细胞技术制备的细胞外基质生物支架成为外科整形重建中研究和运用的关注热点^[2-4]。脱细胞技术是通过物理、化学、生物学等一系列方法处理同种异体组织器官，使其内细胞去除完全而保留相应细胞外基质的一种方法^[5-7]。经过脱细胞技术获得的细胞外基质生物材料，除去了原材料中的细胞、α-Gal抗原表位、DNA等免疫原性的基质残留，以降低人体不良免疫反应和免疫排斥的风险，因此临床上被广泛应用于外科支架或促进软组织修复的材料^[8-9]。

因心包膜具有生物相容性好、材质柔韧性强、便于外科手术操作缝合、缝合处出血与渗血量少、术后观察便利等优点，现已被广泛改良运用于血管外科、胸外科、脑外科、牙科和骨科等多种人体组织器官的外科临床^[9-13]。但心包膜材料的免疫排斥性、单薄易降解、力学强度不足及抗酶解能力弱等特性也同样制约着其开发与运用^[14-16]。

免疫原性是困扰临床上异体医用材料使用的难点，也是评价外科手术预后的重要参考依据^[17-18]。免疫原性的评价范围较广泛，通常包括免疫器官变化、免疫细胞增殖分化、免疫因子变化等^[19-20]，然而对脱细胞异种生物材料的临床前免疫原性评价尚无统一的评价体系。实验通过在Balb/c小鼠背部分别植入脱细胞异种生物外科补片及心包膜原材料，结合体液免疫和细胞免疫考察脱细胞异种生物外科补片的免疫原性，为脱细胞处理异体材料的风险评价提供科学依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本研究。

1.2 时间及地点实验于2019年5至10月在四川省食品药品检验检测院完成。

1.3 材料生物外科补片(表1)和心包膜(原材料)由冠昊生物科技股份有限公司提供。

1.3.1 实验动物 SPF级雌性Balb/c小鼠20只，体质量21-23 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物质量合格证：51203500010616。实验方案经四川省食品药品检验检测院安全评价中心实验动物管理和使用委员会批准(IACUC-2018-KYYL-008)。

1.3.2 实验用主要试剂小鼠IgG ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，货号EMC116)；小鼠IgM ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，货号EMC129)；牛血清白蛋白(BioFroxx，货号4240GR025)；红细胞裂解液(Solarbio，货号R1010)；1640培养液(江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGM31800-500)；胎牛血清(Stemimmune LLC，货号SCM-BS1-0500)；PBS(江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGB5001)；Cell Counting Kit-8(Solarbio，货号：313B013)；细胞表面抗体测试试剂盒(Biolegend，货号：100422，108922，400922，115554，400558，104507，100708，100306，103130)。

1.3.3 实验用主要仪器和耗材全波长酶标仪(Thermo，Multiskan Go 1510)；离心机(Thermo，ST16R)；生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司，BSC-1500IIA2-X)；二氧化碳培养箱(Panasonic，MCO-18AC)；自动细胞计数器(上海睿钰生物科技有限公司，IC 1000)；流式细胞仪(Beckman Coulter，Cytomics FC 500)；全自动真空组织脱水机(LEICA，ASP300S)；包埋机(LEICA，EG1160)；组织切片机(LEICA，RM2245)；70 μm细胞筛网(Corning，352350)；96孔酶标板(Costar，3599)；流式管(SPL，货号：SPL-40205)。

1.4 实验方法动物适应期结束后，将小鼠称体质量后随机分为阴性对照组、阳性对照组、实验组与对照组，每组5只。0.4%戊巴比妥钠麻醉后备皮，背部约1 cm切口，在实验组与对照组小鼠背部皮下分别植入生物外科补片(1 cm× 2 cm)和心包膜(1 cm×2 cm)；阴性对照组假手术处理；缝合，消毒。阳性对照组背部皮下注射弗氏佐剂和牛血清白蛋白 (4 g/L)等体积混合液0.1 mL，于实验的第1，8，15，22天注射。

1.4.1 取材样品植入4周后记录小鼠体质量。随后麻醉，用弯头镊子摘小鼠眼球，将眼底血滴入无菌EP管中，静置4 h后3 000 r/min离心10 min，得到血清，-80 ℃冻存用于抗体检测。将小鼠脱颈处死，在体积分数75%乙醇中浸泡数秒，用无菌纱布擦拭腹部后剪开腹部，无菌条件摘取脾脏后称质量。将脾脏放入盛有1 640培养液的平皿中进行脾脏淋巴细胞分离；取胸腺和脑组织称质量，通过胸腺或脾脏与脑组织质量比计算脏脑系数，并将部分脾脏、胸腺及植入部位放入盛有10%NBF的管中固定。

1.4.2 脾脏淋巴细胞分离将脾脏组织剪碎后放在70 μm细胞筛网上，在盛有1640培养液的培养皿中用注射器内塞小心研磨，用1640培养液冲洗筛网，收集脾细胞。将细胞悬液置入15 mL离心管中，300×g离心5 min，去除细胞上清液，加入红细胞裂解液2 mL，裂解红细胞5 min，300×g离心5 min，弃上清液。加入PBS 4 mL重悬细胞，300×g离心5 min，弃上清液。加入3 mL 1640培养液重悬细胞，取0.5 mL细胞悬液加入1.5 mL EP管中，进行淋巴细胞亚型检测。

1.4.3 淋巴细胞亚型检测向各流式管中加入相应标记抗体，配制5.6 μL和7.5 μL抗体混合体系，分别加入相应的流式管中，同时设置同型对照管。每支流式管中加入100 μL脾细胞悬液，避光涡旋混匀两三秒后室温避光反应20 min。每管加入含体积分数1%血清的PBS 1 mL，避光摇匀后，400×g离心5 min，弃细胞上清液。每管中加入含体积分数1%血清的PBS 500 μL，避光涡旋两三秒后避光放置，待上机检测。

1.4.4 体外淋巴细胞增殖实验将分离获得的小鼠脾脏淋巴细胞悬液调整浓度为6×10⁹ L^-1的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100 μL，每只动物设6个平行孔。接种完成后将培养板放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱培养72 h。培养结束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，在全波长酶标仪检测450 nm波长吸光度值。

1.4.5 血清总抗体检测小鼠血清总IgG和IgM抗体均根据相应的小鼠抗体检测试剂盒操作。

1.4.6 组织病理学评价对小鼠脾脏、胸腺和植入部位周围组织进行脱水、透明、浸蜡操作，再将处理后的组织制成蜡块并制成厚度约为0.5 μm的石蜡切片，经苏木精-伊红染色后在生物显微镜下观察植入部位炎症反应类型、程度及胸腺和脾脏组织病理学改变。

1.5 主要观察指标各组脏脑系数、血清总IgG和IgM水平、体外淋巴细胞增殖活性及脾脏淋巴细胞亚型分布、组织病理学观察。

1.6 统计学分析所得计量数据以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计处理，进行多组间单因素方差分析，以 P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

免疫原性评价是动物源性生物材料生物学风险评价必不可少的环节，其评价方法一般分为体外实验、半体内实验和动物实验3种，其中啮齿类动物体内实验的探究被认为是评价材料免疫学效应最主要的方法^[21-22]。实验选取的脱细胞异种生物外科补片，是以新鲜猪心包膜为原材料经过特殊脱细胞技术处理后的产品，通过实验室确立的生物材料免疫原性评价体系来考察脱细胞异种生物外科补片的免疫原性风险。

胸腺与脾脏是机体2种重要的免疫器官，其脏器质量、脏脑系数及组织病理学观察均属于机体非特异性的参考指标，可综合反映异物、有毒物体对机体和靶器官的毒效应^[23-26]。实验结果显示，与阴性对照组相比，心包膜原材料组实验小鼠体质量与脾脏脏脑系数均显著性增加，且植入部位观察到严重的炎症反应；而生物外科补片产品组的相应指标与阴性对照组相比均无明显变化，表明原材料经脱细胞处理后能有效降低小鼠机体内的免疫毒性反应。

淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的细胞群，根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可以分成3大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞(NK细胞)，是机体免疫应答功能的重要组成部分，当它们各亚群的数量和功能发生异常时就可导致机体免疫紊乱^[27-30]。其中，淋巴细胞的增殖能力和细胞活性是评价机体免疫能力的重要参考指标。T淋巴细胞亚群执行细胞免疫来调节免疫系统功能，主要取决于T淋巴细胞总值(CD3⁺细胞)及其亚群细胞(CD4⁺、CD8⁺等)的相对组成。实验脾脏淋巴细胞亚型分析结果表明，心包膜原材料能引起小鼠机体免疫功能紊乱，结合体外淋巴细胞增殖实验结果提示，脱细胞处理的生物外科补片可能并未引起小鼠机体的细胞免疫反应。

免疫球蛋白含量变化也是评价机体免疫原性的重要指标，其含量在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱^[31-33]。实验血清抗体检测结果表明，心包膜(原材料)可能未对小鼠引起较强的体液免疫反应，也可能由于动物数量较少，未体现出统计学差异。此种情况可增加每组动物数量并有待于进一步验证和分析。

有研究采用基于GGTA1基因敲除Gal抗原缺失模式小鼠来评价动物源性生物材料免疫原性^[34-38]，在不同程度的免疫原性生物材料中，采用Gal抗原缺失小鼠模型能在一定程度上反映原材料与免疫原去除产品的差异，提示可以应用于动物源性材料免疫毒理学评价，但Gal抗原缺失小鼠模型来源有限。而采用体外实验评价免疫原性，无法模拟机体整个免疫系统的复杂情况，具有一定的局限性^[39]。实验选择植入后4周取材，通过确立的生物材料免疫原性评价体系来评价脱细胞异种生物外科补片的免疫原性反应。若进一步考察材料降解后免疫反应风险，需根据材料预期临床使用设计不同的免疫原性考察点，才能全面地评价材料免疫原性风险。

综上所述，实验结果表明较原材料相比，脱细胞处理的异种生物外科补片能有效降低其不良免疫反应和免疫排斥的风险，为脱细胞处理的异体材料在临床上的运用提供科学依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脱细胞异种生物外科补片的免疫原性

Immunogenicity of heterogeneous acellular biosurgical patch

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