葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植治疗糖尿病早期视网膜病变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
葛根芩连汤：为表里双解剂，具有解表清里之功效，主治协热下利，身热下利，胸脘烦热，口干作渴，喘而汗出，舌红苔黄，脉数或促。临床常用于治疗急性肠炎、细菌性痢疾、肠伤寒、胃肠型感冒等属表证未解、里热甚者。
糖尿病视网膜病变：糖尿病患者主要是胰岛素激素及细胞代谢异常，引起眼组织、神经及血管微循环改变，造成眼的营养和视功能的损坏。微血管是指介于微小动脉和微小静脉之间，管腔小于100-150 µm的微小血管及毛细血管网，是组织和血液进行物质交换的场所。由于糖尿病患者血液成分的改变，而引起血管内皮细胞功能异常，使血-视网膜屏障受损。视网膜毛细血管内皮细胞色素上皮细胞间的联合被破坏，造成小血管的渗漏。

摘要
背景：研究发现人羊膜间充质干细胞可以向胰岛素分泌细胞分化，还具有免疫调节作用。临床证实葛根芩连汤有明确降低血糖的作用。
目的：探讨葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植对糖尿病大鼠早期视网膜病变形态学、相关血清学指标及血管内皮生长因子基因表达的影响。
方法：以腹腔注射链脲佐菌素方式制作糖尿病模型，将造模成功的42只Wistar大鼠随机分为模型组、人羊膜间充质干细胞移植组和联合组(人羊膜间充质干细胞移植+葛根芩连汤)，移植后4周测定糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素水平；移植后4周苏木精-伊红染色镜下观察糖尿病大鼠视网膜的病理形态；免疫组织化学方法检测视网膜组织CD45的表达水平；RT-PCR法检测视网膜血管内皮生长因子mRNA的表达。
结果与结论：①与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和联合组大鼠血糖降低，血清胰岛素浓度增加，联合组改善更为明显，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；②模型组大鼠有明显视网膜水肿、层次紊乱，细胞排列不规则；与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组大鼠视网膜病变相对轻微，联合组视网膜病变明显好转；③模型组视网膜CD45的表达明显增加，人羊膜间充质干细胞移植组CD45的表达量明显小于模型组(P < 0.05)，但大于联合组(P < 0.05)；④联合组和人羊膜间充质干细胞移植组血管内皮生长因子mRNA表达低于模型组，联合组降低幅度更大，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植可能通过抑制CD45和血管内皮生长因子在视网膜组织表达，从而改善糖尿病视网膜病损严重程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-4955-3506(刘亮)

关键词: 干细胞, 移植, 葛根芩连汤, 人羊膜间充质干细胞, 糖尿病, 视网膜病变, 血管内皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic mesenchymal stem cells have the potential to differentiate into insulin-secreting cells and have immunomodulatory effects. Additionally, it has been clinically proved that Gegen Qin Lian Tang can lower blood sugar.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Gegen Qin Lian Tang combined with human amniotic mesenchymal stem cell transplantation on rat early diabetic retinopathy, by detecting pathological changes, levels of blood indicators and expressions of vascular endothelial growth factor in retinal tissues.
METHODS: By intraperitoneal injection of streptozotocin, 42 Wistar rat models with diabetes mellitus were prepared and then randomly divided into model group, human amniotic mesenchymal stem cell transplantation group (cell transplantation group) and combination of human amniotic mesenchymal stem cells and Gegen Qin Lian Tang group (combination group). At 4 weeks after transplantation, levels of blood sugar and serum insulin in diabetic rats were detected; pathological changes of the retina in diabetic rats were observed by hematoxylin-eosin staining. Besides, expressions of CD45 and vascular endothelial growth factor mRNA were detected using immunohistochemistry staining and RT-PCR technology, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the levels of blood glucose and serum insulin in both cell transplantation and combination groups were significantly decreased and increased, respectively, and these changes were even more significant in the combination group (P < 0.05). In the model group, the retinal edema could be found, accompanied by structural disorder and irregular cell arrangement, while these retinal lesions were relatively milder in the cell transplantation group and significantly improved in the combination group. In addition, the CD45 expression and in the retina was highest in the model group subsequently followed by the cell transplantation group (P < 0.05) and lowest in the combination group (P < 0.05). Furthermore, compared with the model group, the expression of vascular endothelial growth factor mRNA was also significantly lower in the other two groups, especially in the combination group (P < 0.05). These data show that Gegen Qin Lian Tang combined with human amniotic mesenchymal stem cell transplantation improves the severity of diabetic retinopathy by inhibiting expressions of CD45 and vascular endothelial growth factor in the retinal tissues.

Key words: Pueraria, Amnion, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Diabetic Retinopathy, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘亮，王金梁. 葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植治疗糖尿病早期视网膜病变[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2824-2830.

Liu Liang, Wang Jin-liang. Gegen Qin Lian Tang combined with human amniotic mesenchymal stem cell transplantation for early diabetic retinopathy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(19): 2824-2830.

图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态 原代培养24 h后出现贴壁生长，形态多样，无明显扩增。两三天后贴壁细胞开始增多，细胞开始转变为梭形、多边形等(图1A)。7 d后细胞增殖加快，细胞呈漩涡状密布生长，胞体变得细长，成纤维样细胞进一步增多。细胞传代后生长速度增快，多呈单层放射状或漩涡状生长，3-7 d即可长满瓶底。传第3代时细胞生长融合度可达90%，呈漩涡状紧密排列，细胞形态无明显变化(图1B)。

2.2 各组糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素的变化 移植后各组糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰岛素检测结果显示，与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和联合组大鼠空腹血糖明显降低，而联合组血糖降低较人羊膜间充质干细胞移植组更为明显；与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和联合组大鼠血清胰岛素含量增加，联合组血清胰岛素含量增加大于人羊膜间充质干细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，2。
2.3 糖尿病大鼠视网膜形态学变化 正常大鼠视网膜各层结构清晰，细胞排列紧密整齐，层次分明，神经节细胞单层排列；内核层较薄、外核层较厚，视网膜的内界膜完整，未见毛细血管内皮细胞突破内界膜。苏木精-伊红染色后光镜下观察到各组大鼠视网膜形态学变化：模型组大鼠视网膜水肿、结构紊乱、部分细胞突出于内界膜，细胞排列不规则；与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组大鼠视网膜病变相对轻微，联合组可见视网膜病变明显好转，见图2。

2.4 免疫组织化学检测视网膜CD45的表达 CD45在糖尿病大鼠视网膜中呈高强度表达，表现为黄色或棕黄色。与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组CD45在视网膜中的表达明显减弱，与人羊膜间充质干细胞移植组比较，联合组进一步减弱，见图3。

2.5 RT-PCR法检测视网膜血管内皮生长因子mRNA的表达 与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和联合组血管内皮生长因子mRNA明显降低，联合组降低范围明显大于人羊膜间充质干细胞移植组，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年2月至2015年5月在辽宁中医药大学完成。

1.3 材料 健康纯系Wistar大鼠69只，七八周龄，体质量190-245 g，购自辽宁中医药大学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(沈)2014-0007。饲养温度为(23±3) ℃，相对湿度55%-60%，通风换气8-12次/h，正常饮食，实验过程依据动物伦理学标准对动物进行处置。足月剖宫产胎盘人羊膜来源于辽宁省人民医院。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞的制备 按文献[11]方法采用胶原酶消化法分离培养人羊膜间充质干细胞，接种在含体积分数为9%胎牛血清、1% β-巯基乙醇、1% GlutaMAX以及10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的LG-DMEM培养基中传代培养。经差速贴壁纯化后，取培养至第3、4代人羊膜间充质干细胞，用荧光标记的鼠抗人单克隆抗体 CD34-PE、CD44-FITC、CD73-PE、CD90-FITC、CD45-FITC、CD105-PE、CD19-PE、CD14-FITC、CD86-PE、CD80-FITC和HLA-DR- PerCP常规标记人羊膜间充质干细胞，流式细胞仪进行表型鉴定，每管细胞数不低于20 000个，Cell Quest软件分析。

1.4.2 葛根芩连汤的制备 参考《伤寒论》取葛根 250 g，黄连150 g，黄芩150 g，甘草100 g，用10倍质量的水将葛根与其余中药分开浸泡20 min，先煮葛根20 min，然后加入其余已浸泡的药汤继续煮40 min，滤出汤剂，第二煎加入8倍质量的水，煎煮30 min，将滤出的汤剂与首次滤出的汤剂混合，浓缩水煎液至全方生药量2 g/mL。

1.4.3 糖尿病模型制备 按文献[12-13]所述，以 0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释链脲佐菌素制成2%链脲佐菌素注射液，经腹腔注射20 mg/(kg • d)，连续5 d，常规饲养六七天后，测定大鼠尾端空腹血糖，2次空腹血糖检测值均大于6.7 mmol/L时，可认定为糖尿病造模成功，最终成模动物数为42只。

1.4.4 动物分组及药物处理 糖尿病模型形成后，随机分为模型组14只和实验组28只。实验组再随机分为2组：人羊膜间充质干细胞移植组、联合组(人羊膜间充质干细胞移植+葛根芩连汤)，每组14只。

取第3代人羊膜间充质干细胞加入LG-DMEM制成细胞悬液，造模后24 h人羊膜间充质干细胞移植组经舌下静脉注射300 μL人羊膜间充质干细胞悬液(含5×10⁶个细胞)，给予生理盐水灌胃，2次/d，共灌胃3 d。联合组以上述相同方式注射人羊膜间充质干细胞悬液的同时，给予葛根芩连汤水煎液生药量10 g/kg灌胃，2次/d，共灌胃3 d。模型组则以生理盐水给予同样方式灌胃，持续6周正常饲养。

1.4.5 大鼠空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数的测量 在移植后24 h以及移植后3，10，20，30 d，检测各组大鼠的空腹血糖值，严格按照试剂盒步骤说明应用放免法测定各组大鼠血清胰岛素水平，空腹血糖×空腹胰岛素水平/22.5=胰岛素抵抗指数。

1.4.6 取材与切片的制备 移植后4周取材，取材前所有大鼠禁食12 h，检测血糖并称体质量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后开胸，将灌注针头插入左心室导入主动脉，剪开右心耳，用100 mL PBS(pH 7.4)灌洗3 min，摘取眼球，取出视网膜放入体积分数为10%中性甲醛内浸泡固定，经梯度乙醇脱水后，剪开眼球前段去掉晶状体，二甲苯透明处理，石蜡定向包埋，行视网膜冠状面连续5 μm切片，常规苏木精-伊红染色，光镜观察。

1.4.7 免疫组化检测CD45的表达 石蜡切片脱蜡后以乙醇脱水，PBS冲洗，置于过氧化酶阻断剂内浸泡，再次用PBS冲洗，加入山羊血清封闭，加入CD45单克隆抗体(1︰500)置于4 ℃冰箱内静置10 h，经PBS冲洗后加入生物素标记的第二抗体孵育20 min，PBS冲洗3次，每次5 min，加入辣根酶标记链酶卵白素孵育20 min，PBS冲洗，重复上述步骤加入辣根酶标记链酶卵白素孵育20 min，PBS冲洗，DAB染色，苏木精复染、二甲苯透明后进行封固。

1.4.8 RT-PCR检测各组视网膜组织血管内皮生长因子表达 取各组视网膜组织，PBS洗涤2次，加入1 mL Trizol充分溶解，导入到标记好的EP管中。应用PrimeScript^TMRT试剂盒将RNA反转录为cDNA；再以SYBR Premix ExTaq^TM试剂盒将反转录的cDNA进行目的基因的扩增；基因序列如下：血管内皮生长因子上游引物：5’-CCA TGA ACT TTC TGC TCT TC-3’，下游引物：5’-GGT GAG AGG TCT AGT TCC CGA-3’，扩增片段165 bp。内参GAPDH上游引物：5’-AGT ATG ACT CCA CTC ACG GCA A-3’，下游引物：5’-TCT CGC TCC TGG AAG ATG GT-3’，扩增片段100 bp。反应条件如下：95 ℃预变性5 min，进入循环：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，累计42个循环。Image-Pro Plus 7.0软件分析所得图像进行条带灰度值分析。

血管内皮生长因子相对表达量=血管内皮生长因子条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。

1.5 主要观察指标 ①人羊膜间充质干细胞的形态。②大鼠空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数。③视网膜组织CD45的表达。④视网膜组织血管内皮生长因子表达。

1.6 统计学分析 由第二作者将数据应用SPSS 18.0进行统计学分析，所得数据以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验(Student's t test)，多组间用方差分析作q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病视网膜病变的发病机制非常复杂，高血糖所致的血管障碍是其基本的病理过程，血管内皮细胞功能异常，血浆纤溶系统功能减弱而凝固系统活跃，使视网膜毛细血管闭塞，血-视网膜屏障受损，进而造成视网膜的缺血、缺氧，最终导致玻璃体大量出血出现不可逆性失明。糖尿病视网膜病变主要以药物治疗、激光手术治疗和玻璃体切割术治疗为主。经过难度较大且高风险的手术，在一定程度上挽救部分视网膜功能，但视力并不能得到有效恢复，故而血糖的严格控制才是其防治的主要手段^[14-17]。

干细胞具有超强的自我更新能力，近来已逐渐成为医学生物学上最具吸引力的领域之一。多项研究结果显示，同种异基因骨髓间充质干细胞移植能使1型糖尿病小鼠的高血糖状态得以逆转，并抑制T淋巴细胞的增殖，调节性T细胞水平升高，恢复Th1和Th2两者的免疫应答平衡，使胰岛的炎性反应减弱^[18-22]。羊膜具有上皮形成的特性^[23]，角膜上皮创伤愈合模型实验表明，羊膜混悬液在角膜上皮重建过程中发挥重要作用^[24]。羊膜间充质干细胞移植以非手术治疗方式使干细胞迁移至视网膜，修复损伤的视网膜细胞^[25]。实验结果显示，人羊膜间充质干细胞移植组虽未达到理想的血糖水平，但有较明显改善，血浆胰岛素浓度亦有所提高，减轻了高血糖所致的病理损害，说明单纯移植便可对糖尿病大鼠发挥一定程度的治疗作用。为能够进一步加强降糖效果及减弱病理损害，实验将葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植进行治疗。

近年来，葛根素广泛应用于眼科临床，葛根芩连汤有明确降低血糖的作用，其机制可能是各味药协同提高机体的抗氧化能力，通过改善胰岛素抵抗及提高组织对胰岛素敏感性从而调节糖代谢^[26]。Xiong等^[27]研究发现，葛根素能够抑制胰岛细胞中自由基的产生，增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性?潘竞锵等^[28]报道葛根芩连汤对多种糖尿病模型均有不同程度的降血糖效果。岳丽菁等^[29]研究发现葛根素抑制糖尿病大鼠视网膜组织蛋白激酶C的激活从而降低血管内皮生长因子的表达，进而对糖尿病视网膜组织起到保护作用?实验结果提示：葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植较单纯人羊膜间充质干细胞移植，其降糖及增加血清胰岛素效果更有明确疗效，可见葛根素能协同促进糖尿病视网膜病变相关症状的改善^[30]?

CD45为白细胞标记物，广泛存在于除成熟红细胞和血小板外所有造血细胞上，因它不存在于非造血组织中，所以选择CD45作为研究指标，观察其在糖尿病大鼠视网膜的黏附情况。

在糖尿病视网膜病变中，高血糖症可引起氧化作用受损、微血栓形成、细胞黏附分子活化、白细胞停滞以及细胞因子的活化，特别是血管内皮生长因子的高表达。血管内皮生长因子能特异结合血管内皮细胞，促进新生血管的形成，因此推测血管内皮生长因子可能在糖尿病视网膜病变中发挥着重要作用。

实验用人羊膜间充质干细胞移植联合葛根芩连汤治疗糖尿病模型大鼠，发现两者对糖尿病视网膜病变的疗效有叠加协同作用，与模型组比较，联合组和人羊膜间充质干细胞移植组大鼠血糖回降明显，血胰岛素含量升高，而联合组较人羊膜间充质干细胞移植组上述效果更为显著。光镜观察人羊膜间充质干细胞移植组大鼠视网膜病变有轻微好转，联合组可见视网膜病变明显好转。免疫组织化学显示，人羊膜间充质干细胞移植组CD45在视网膜中的表达明显减弱，与人羊膜间充质干细胞移植组比较，联合组进一步减弱。RT-PCR检测结果可见，人羊膜间充质干细胞移植组和联合组血管内皮生长因子 mRNA表达明显降低，联合组降低幅度明显大于人羊膜间充质干细胞移植组，充分证明了糖尿病视网膜病变治疗中二者的联合效应。

综上所述，葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植可能协同抑制CD45的表达，改善视网膜微循环，并通过降低血管内皮生长因子mRNA在视网膜组织表达，从而抑制糖尿病性视网膜病变的炎症反应，改善糖尿病视网膜病损严重程度。该研究表明葛根芩连汤联合人羊膜间充质干细胞移植在糖尿病视网膜病变领域中值得推广，其作用机制还需进一步了解探讨。