关节腔内骨髓间充质干细胞与同种异体骨的共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.003

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
局部微环境：在将构建的组织工程软骨植入局部进行修复治疗的过程中，会受到局部微环境的较大影响。局部的实际理化环境与各种生长因子，以及力学刺激等均会对组织工程软骨产生极大的影响，并直接影响到软骨修复效果。为此，在进行组织工程软骨构建的时候，可以尝试通过一定的方式，利用各种理化因子和局部血运等因素以更快的速度获得质量更好的组织工程软骨。
同种异体骨：经去抗原免疫、深低温冷冻等处理，抗原性极低，且具有良好的孔隙结构和生物相容性，可以为种子细胞的生长提供所需的空间，是一种十分理想的支架材料。

摘要
背景：构建组织工程软骨的时候，同种异体骨与骨髓间充质干细胞是常用的支架材料和种子细胞，以往大多采用体外培养的方式。膝关节内游离体可以长期存在于关节腔中，并维持一定的软骨组织学特性。因此，关节腔可能为软骨细胞的生长和发育提供良好的环境条件。
目的：探讨在关节腔内骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合培养的效果。
方法：纳入5只新西兰新生白兔进行骨髓间充质干细胞分离与培养，利用1只成年新西兰白兔制备同种异体骨，进行骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合。实验分组：腔内培养组将骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合物培养于动物关节腔内，正常对照组设为同腔内正常软骨，体外培养组实施常规体外培养。培养4，8，12周进行组织学苏木精-伊红染色观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。
结果与结论：①培养12周进行苏木精-伊红染色和观察，正常对照组细胞质和软骨基质出现红染，细胞核出现蓝染，软骨细胞按照一定的方向呈紧密状有序排列。腔内培养组细胞质和软骨基质出现红染，细胞核出现蓝染，支架材料基本吸收。软骨细胞长入支架之中，细胞按照一定应力方向排列，且形态变小。体外培养组软骨细胞出现大量增殖，但呈无序状排列；②经免疫组织化学染色和观察，计数可得，随着培养时间的推移，腔内培养组的A值呈现出不断上升的情况，体外培养组和正常对照组均未出现明显的改变。且培养4，8，12周，正常对照组和腔内培养组的A值均显著高于体外培养组(P < 0.05)。培养4，8周，腔内培养组的A值均显著低于正常对照组(P < 0.05)。但培养12周，腔内培养组与正常对照组A值差异无显著性意义(P > 0.05)；③实验结果表明，在体外和关节腔内环境下，均可以利用同种异体骨与骨髓间充质干细胞复合培养获得组织工程软骨，且关节腔内培养可以获得更好的培养效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6799-7931(高峰光)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 关节腔, 软骨, 软骨生物材料, 骨髓间充质干细胞, 同种异体骨, 组织工程软骨, 共培养

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells and allogenic bones are commonly used as seed cells and scaffolds, respectively, for constructing tissue-engineered cartilage through in vitro co-culture. The loose body of the knee joint can survive in the articular cavity for a long time, and maintain certain characteristics of cartilage tissues. Therefore, the articular cavity can provide a good environment for the growth and development of chondrocytes.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with allogenic bone in the articular cavity.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from five newborn New Zealand white rabbits. One adult New Zealand rabbit was enrolled to prepare allogenic bone for co-culture with bone marrow mesenchymal stem cells. Afterwards, bone marrow mesenchymal stem cells and allogenic bone composites were cultured in the articular cavity (intracavitary culture group) or in vitro as in vitro culture group, respectively; the normal cartilage tissues grew in the articular cavity as control group. Cells were observed by hematoxylin-eosin staining and type II collagen immunohistochemistry staining at 4, 8 and12 weeks of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks culture, hematoxylin-eosin staining showed: in the control group, chondrocytes arranged tightly and directionally with red stained cytoplasm and cartilage matrix as well as blue nuclei; in the intracavitary culture group, the scaffold was mostly absorbed and chondrocytes grew into the scaffold in a certain direction with smaller shape, while cytoplasm and cartilage matrix were red stained, blue nuclei appeared; in the in vitro culture group, abundant chondrocytes proliferated in a disordered arrangement. Immunohistochemistry staining showed: the absorbance (A) values in the intracavitary culture group showed a continuous increase, but no obvious change was in the other two groups. Moreover, at 4, 8 and 12 weeks of culture, A values in the control group and intracavitary culture group were significantly higher than that in the in vitro culture group (P < 0.05); at 4 and 8 weeks, A value in the intracavitary culture group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05), but at 12 weeks, there was no significant difference in A value between the two groups (P > 0.05). These results suggest that the tissue-engineered cartilage can be constructed by bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with allogenic bone under in vitro and in vivo environment, especially in the articular cavity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 关节腔内观察实验纳入15只成年新西兰白兔，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 兔骨髓间充质干细胞培养结果 对兔骨髓间充质干细胞进行原代培养，培养后1 d后，出现少量细胞贴壁生长。接种3 d，贴壁生长细胞数量增加。经传代培养，细胞呈旋涡状或螺旋状，传至第3代未出现明显的改变(见图1)。

2.3 兔骨髓间充质干细胞成骨诱导结果 对第3代骨髓间充质干细胞进行软骨定向诱导之后，连续培养2周，可观察到细胞周围出现基质分泌(见图2)。

2.4 同种异体骨形态观察 制备得到的同种异体骨支架材料触之具有一定的轻度和韧性，可剪裁为不同的大小(见图3)。经电镜扫描，材料呈疏松多孔状结构(见图4)。
2.5 术后动物情况观察 对新西兰白兔进行同种异体骨-骨髓间充质干细胞复合物膝关节腔内植入之后，未出现明显的排异反应。

术后切口干燥，未出现渗出、红肿，动物活动正常，未出现明显的关节活动受限。术后动物均正常饮食，未出现动物死亡。

2.6 苏木精-伊红染色结果 培养12周后进行苏木精-伊红染色和观察，可见：①正常对照组：细胞质和软骨基质出现红染，细胞核出现蓝染，软骨细胞按照一定的方向呈紧密状有序排列。②腔内培养组：细胞质和软骨基质出现红染，细胞核出现蓝染，支架材料基本吸收。软骨细胞长入支架之中，细胞按照一定应力方向排列，且形态变小。③体外培养组：软骨细胞出现大量增殖，但呈无序状排列。

2.7 免疫组织化学染色结果 经免疫组织化学染色和观察，正常对照软骨细胞外基质中可发现大量棕黄色颗粒，经Ⅱ型胶原染色呈现出强阳性。腔内培养组经Ⅱ型胶原染色呈现出阳性，胞浆和基质均为棕黄色，且随着时间的不断推移，棕黄色颗粒数量越来越多。4周体外培养组可观察到出现少量Ⅱ型胶原表达的情况；8周时胞周存在棕黄色颗粒；12周经免疫组织化学反应Ⅱ型胶原呈强阳性，软骨细胞胞浆及胞外基质可观察到少量的黄色颗粒。
经计数可得，随着培养时间的推移，腔内培养组的A值呈现出不断上升的情况，体外培养组和正常对照组均未出现明显的改变。且培养4，8，12周，正常对照组和腔内培养组的A值均显著高于体外培养组(P < 0.05)。培养4，8周，腔内培养组的A值均显著低于正常对照组(P < 0.05)。但培养12周，两组之间A值经比较差异无显著性意义(P > 0.05)。具体结果见表1及图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学水平，对比观察实验。

1.2 材料

实验动物：5只新生新西兰白兔，体质量0.5-1.0 kg，4-6周龄，均为雄性，用于种子细胞制备。成年新西兰白兔16只，体质量2.5-3.5 kg，均为雄性，其中1只用于支架材料制备，15只用于关节腔内实验观察。实验动物均饲养于滨州医学院烟台附属医院动物中心SPF环境，常规喂养。研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

1.3 实验方法

1.3.1 种子细胞制备 取5只新生新西兰白兔，麻醉后处死，无菌条件下获得双侧股骨、胫骨、肱骨、髂骨，剪断双侧干骺端，利用无菌的PBS对髓腔进行冲洗获得冲洗液，离心后弃上清、裂解，制备细胞悬液，并进行接种。获得P3细胞进行软骨定向诱导^[7]。诱导14 d后，胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，对细胞进行调整，调整为2×10⁹ L^-¹作为实验所需种子细胞。

1.3.2 支架材料制备 取1只成年新西兰白兔麻醉后处死，获得髂骨及椎体骨，常规清洗、脱水、脱脂等，制备为圆柱状标本(高3 mm、直径3.3 mm)，脱水、风干后利用10%PBS进行浸泡。72 h之后取出，风干后分装，环氧乙烷灭菌，妥善保存备用^[8]。

1.3.3 细胞-载体复合物的构建^[^9] 取30块支架材料，浸入16孔板中的种子细胞悬液中，待细胞悬液完全浸透骨块之后进行分组。每组15块，分别设为腔内培养组和体外培养组。

1.3.4 细胞-载体复合物体外培养 将16孔板置于二氧化碳恒温培养箱中进行培养，6 h之后完全培养基(含双抗和体积分数10%的胎牛血清)继续培养。

1.3.5 细胞-载体复合物关节腔内培养 取1只成年新西兰白兔麻醉后获得背部肌肉筋膜和腰背筋膜，修剪为膜片，大小1.0-1.5 cm。取出16孔板内的细胞-载体复合物，利用修剪的膜片进行包裹，“0”号线缝合之后，植入15只新西兰白兔右侧膝关节腔内^[10]。术后进行青霉素肌肉注射3 d以抗感染。术后常规喂养，不限制其活动。正常对照组设为同腔内正常软骨。

1.4 主要观察指标 术后第4，8，12周，分别处死5只动物，取材后与体外培养组一同进行标本检测，行苏木精-伊红染色组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。

1.5 统计学分析 对研究过程中获得的数据进行收集，使用的统计学软件为SPSS 18.0。计算P值，P < 0.05为差异有显著性意义。