复合富血小板血浆珊瑚骨修复下颌骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

富血小板血浆：为高度浓缩的血小板，其中富含多种生长因子，它可促进细胞增殖与分化。自1998年Marx等首次用富血小板血浆复合移植骨修复下颌骨缺损以来，富血小板血浆已逐渐被应用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神经外科等领域的组织修复中。

珊瑚骨：为滨珊瑚，其主要成分为碳酸钙，占99%，显微结构为多孔网状，孔径100-300 µm，孔隙率为70%-90%，从结构和成分两方面模拟了天然骨，三维框架结构实现了从纳米到微米级别的骨仿生。多孔的结构，尤其是互联的通道，利于营养的传递和细胞的迁移。

背景：富血小板血浆含有多种骨生长所需的生长因子，如血小板源性生长因子、转移性生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子和血管内皮细胞生长因子等，在骨再生的各个不同阶段直接或间接促进细胞的分化与增殖，促进新骨再生。

目的：观察复合富血小板血浆珊瑚骨修复骨缺损的效果。

方法：将24只新西兰大白兔随机分为3组，每组8只，建立单侧下颌骨缺损模型，实验组于骨缺损处植入复合自体富血小板血浆的珊瑚骨，对照组于骨缺损处植入珊瑚骨，空白对照组不植入任何材料。术后2，4，8，12周进行影像学观察和骨组织形态计量学分析。

结果与结论：①X射线检查结果：术后12周时，空白对照组缺损区整体密度增高，略低于周围骨组织；实验组、对照组缺损区密度接近宿主骨，材料与新生组织充分结合，且实验组骨密度高于对照组。②骨组织形态计量学分析结果：术后12周内，实验组新骨面积显著高于对照组、空白对照组(P < 0.05)。③结果表明，复合富血小板血浆珊瑚骨具有良好的生物相容性和骨传导性，作为框架材料可引导再生骨向缺损内生长，促进骨缺损修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID: 0000-0003-2108-4111(蒋柳宏)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 富血小板血浆, 珊瑚骨, 下颌骨缺损, 骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: Platelet rich plasma contains various growth factors, such as platelet-derived growth factor, metastatic growth factor, insulin-like growth factor, epidermal growth factor as well as vascular endothelial growth factor. Therefore, it can directly or indirectly promote cell differentiation and proliferation in different stages of bone regeneration.

OBJECTIVE: To study the effects of coral bone with platelet rich plasma in the repair of mandibular defects.

METHODS: Totally 24 New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups (n=8 per group) including test group, control group and blank control group. Coral bone with autologous platelet rich plasma, coral bone or nothing was implanted, respectively, after establishing unilateral mandibular defect models. The defects were evaluated by imaging observation and bone his-tomorphometric analysis at 2, 4, 8, 12 weeks after surgery.

RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after surgery, by imaging observation, density of the defect increased in the blank control group, which was lower than that of the normal bone; the bone density in the test group was higher than that in the control group, both of which were similar with the normal bone. Besides, the materials were closely combined with the new tissues. By bone his-tomorphometric analysis, area of the new bone in the test group was significantly larger than that in the control and blank control group (P < 0.05). In conclusion, coral bone with platelet rich plasma has good biocompatibility and bone conductivity, which can induce bone regeneration to promote defect repair.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Platelet-Rich Plasma, Mandible, Tissue Engineering

蒋柳宏，董滢，闫春歌，刘艳辉，景向东. 复合富血小板血浆珊瑚骨修复下颌骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2360-2368.

Jiang Liu-hong, Dong Ying, Yan Chun-ge, Liu Yan-hui, Jing Xiang-dong. Mandibular defects repaired by coral bone with platelet rich plasma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2360-2368.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 24只新西兰大白兔均进入结果分析。

2.2 各组大体观察结果术后2周时，各组标本骨缺损区均由纤维肉芽组织填充，质地松软。术后4周时，空白对照组标本表面形态不规则，缺损区主要为纤维组织；实验组、对照组颊、舌侧表面可见部分骨皮质形成，周围纤维组织增生明显，剖面观察缺损区中央由材料、纤维结缔组织及新生骨组织填充，未出现缺损中央空洞的情况，见图1。术后8周时，空白对照组标本骨缺损区边缘有部分骨痂形成，周围纤维组织增生明显；实验组、对照组骨缺损区内组织更加致密，探针不能探入。术后12周时，实验组、对照组刮除表面肉芽可见质地粗糙的颗粒状骨质，空白对照组缺损区边缘部分骨质生成，但中心仍可用探针探入。

2.3 各组影像学观察结果术后2周时，3组缺损区边界基本清晰可见；术后4，8，12周时，3组缺损边界逐渐模糊，缺损区中央及边缘骨密度增高，高密度影面积增大。

空白对照组术后2周时缺损区中央呈透光影，边界清晰；术后4周时，缺损区中央低密度影减小，下颌骨下缘方向边缘模糊；术后8周时，缺损区密度略增高，表现为集中在缺损边缘的骨痂影像；12周时缺损区整体密度增高，略低于周围骨组织。对照组、空白对照组术后2周时，材料区与宿主骨交界处有少量模糊云雾状致密影，隐约可见材料影像；术后4周时，材料区与宿主骨交界线较前模糊，缺损边缘絮状高密度影；术后8周时，缺损边缘及中央出现片状骨痂影像，材料与新生骨无界限；12周时缺损区密度接近宿主骨，材料与新生组织充分结合；实验组术后第2，4，12周时骨密度较对照高，密度不均，絮状阻射影更多，第8周时两组骨密度相近，见图2。

2.4 各组组织学观察结果

空白对照组：术后2周，缺损区中央约4 mm范围内为空白区，边缘主要为纤维组织，成纤维细胞丰富，未见成骨；术后4周，缺损区由大量纤维组织、成纤维细胞构成，边缘可见少量散在线状新骨，中央未见成骨；术后8周，缺损中央可见少量散在梭形新骨形成，大量的纤维组织由脂肪组织替代，边缘可见新骨向中间延伸。术后12周，缺损中央可见条索状、水滴状的新骨形成，新生骨周围新生血管形成，大量纤维组织由脂肪组织替代，边缘新骨形成并延伸至中央，见图3。

对照组：术后2周，缺损区由材料和纤维组织充填满，材料之间由纤维组织连接，小部分区域材料之间可见小梁状新骨形成，材料颗粒内部可见成骨样反应；术后4周，缺损区内由材料、纤维组织及新生骨组织构成，材料之间可见条索状新骨形成，部分连续成片，较密集。部分材料边缘也可见新生骨组织包绕材料颗粒，不连续，由边缘向中间扩展，小面积区域成片状；术后8周，缺损区内由材料、纤维组织及新生骨组织填满，材料之间为片状的新生骨组织，周围纤维组织包绕，缺损周边的骨组织伸入材料内，与材料内的骨组织连接。材料颗粒少量完全由骨组织替代，部分成骨样反应；术后12周，缺损区由材料、新生骨组织、纤维组织及少量脂肪组织充填，材料之间为片状骨组织，延伸成长条形，骨成熟度增高，中间存在裂隙，周围由纤维和脂肪组织包绕，材料周边新生骨伸入到材料内部连接成片，材料颗粒内部近1/2完全被骨组织替代并连接成片，剩余部分成骨样反应，表现为类骨质，见图4。

实验组：术后2周，缺损区已由材料和纤维组织充填满，材料之间由纤维组织和少量条索状新生骨连接，可见新骨由缺损边缘沿材料之间间隙向中央延伸生长，材料边缘也可见新生血管增多，材料颗粒内部可见成骨样反应，少量类骨质形成；术后4周，缺损区内由材料、纤维组织及新生骨组织完全充填，材料之间有新生骨小梁形成，密集，骨量明显增多，成网格状分布，一层成骨细胞规则地排列在骨小梁表面，中间纤维组织较少，部分材料边缘可见新生骨组织，条索状连续生长，材料颗粒周围可见新生骨包绕，由边缘向中间扩展，新生骨厚度较空白对照组增大；术后8周，缺损区由材料、新生骨和纤维组织填充，材料之间可见片状的新骨形成，分布较广，骨成熟度增高，中央存在裂隙，周围纤维组织包绕，材料边缘可见条索状、连续性新骨形成，并伸入到材料内，与内部新形成骨组织连接，材料颗粒部分已由骨组织完全替代并与周围新骨连接成片，骨量增多；术后12周，缺损区由材料、新生骨、纤维及少量脂肪组织填充，随着时间的推移，材料内部新生骨小梁不断增加，可见大面积片状的新生骨组织，骨组织逐渐成熟，中间可见裂隙，材料进一步降解，残留的材料被活跃生长的骨组织包围并替代，新生骨量明显增多，多数为片状分布，材料颗粒内部近2/3完全被骨组织替代并连接成片，新骨轮廓与原来材料一致，周围类骨质生成，部分表现为成骨样反应，见图5。

2.5 各组新骨面积计量结果 12周内总体新生骨面积选用LSD法做的均数多重两两比较，空白对照组<对照组<实验组(P均<0.05)，见表1，2。

参考文献

[1] Nilsson ES,Urist MR,Dawson EG,et al.Bone repair induced by bone morphogenetic protein in ulnar defects in dogs.J Bone Joint Surg. 1986;68B: 635-642.

[2] Burchardt H.Related Articles,The biology of bone graft repair.Clin Orthop. 1983;(174):28-42.

[3] Enneking WF,Eady JL,Burchardt H.Autogenous cortical bone grafts in the reconstruction of segmental skeletal defects.J Bone Joint Surg Am. 1980;62(7): 1039-1058.

[4] Pazzaglia UE.Periosteal and endosteal reaction to reaming and nailing: the possible role of revascularization on the endosteal anchorage of cementless stems. Biomaterials. 2012;17(10):1009-1014.

[5] Weng D,Hürzeler MB,Quiñones CRet al.Contribution of the periosteum to bone formation in guided bone regeneration. A study in monkeys.Clin Oral Implants Res.2014;11(6):546-554.

[6] Aitasalo K,Lehtinen R.The influence of a free periosteal transplant on bone healing in the irradiated tibia. A radiological histological and biochemical study on rabbits. Scand J Plast Reconstr Surg. 1985;19(3): 237-244.

[7] Zhang C,Hu YY,Cui FZ,et al.A study on a tissue- engineered bone using rhBMP - 2 induced periosteal cells with a porous nano -hydroxyapatite/collagen/poly (L-lactic acid) scaffold.Biomed Mater.2006;1(2):56-62.

[8] Schmidt BL,Kung L,Jones C,et al.Induced osteogenesis by periosteal distraction. J Oral Maxillofac Surg.2002;60(10):1170-1175.

[9] Sencimen M,Aydintug YS,Ortakoglu K,et al. Histomorphometrical analysis of new bone obtained by distraction osteogenesis and osteogenesis by periosteal distraction in rabbits.Int J Oral Maxillofac Surg.2007;36(3):235-242.

[10] Glowacki J,Shusterman EM,Troulis M,et al.Distraction osteogenesis of the porcine mandible: histomorphometric evaluation of bone.Plast Reconstr Surg.2004;113(2):566-573.

[11] 曾融生,任材年,于秦曦.珊瑚人工骨作为颌面骨修复材料的初步报告[J].中华口腔医学杂志, 1991,26(6):345-347.

[12] Souyris F, Pellequer C.Coral,a new biomedical material: experimental and first clinical investigation on Madreporaria.J Maxillfac Surg.1985;13:64-69.

[13] 郑有华,任材年,张志光,等.珊瑚人工骨/自体骨髓复合移植修复颌骨缺损临床应用[J].中国现代医学杂志, 2005, 15(8):1227-1230

[14] 郑有华,任材年,陈小华,复合珊瑚骨修复颌骨实验性骨缺损[J].临床口腔医学杂志,1996,12(3):143-145.

[15] Chen F,Mao T,Tao K,et al.Bone graft in the shape of human mandibular condyle reconstruction via seeding marrow-derived osteoblasts into porous coral in a nude mice model.J Oral Maxillofac Surg. 2002;60:1155-1159.

[16] Guillemin G,Patat JL.The use of coral as a bone graft substitutes.J Biomed Mater Res.1987;21:557-567.

[17] Weibrich G,Kleis WK,Hafner G.Growth factor levels in the platelet-rich plasma produced by 2 different methods:curasan-type PRP Kit versus PCCS PRP system.Int J Oral Maxillofac Implants. 2002;17(2): 184-190.

[18] Cenni E,Granchi D,Vancini M,et al.Platelet release of transforming growth factor-β and β-thromboglobulin after in vitro contract with acrylic bone cements. Biomaterials.2002;23(6):1479-1484.

[19] Casap N,Venezia NB,Wilensky A,et al.VEGF facilitates periosteal distraction- induced osteogenesis in rabbits: a micro-computerized tomography study. Tissue Eng Part A.2008;14(2):247-253.

[20] Gruber R,Mayer C,Bobacz K,et al.Effects of cartilage-derived morphogenetic proteins and osteogenic protein-1 on osteochondrogenic differentiation of periosteum-derived cells. Endocrinology. 2014;142(5):2087-2094.

[21] Nakahara H,Goldberg VM,Caplan AI. Cultured- expanded periosteal-derived cells exibit osteochondrogenic potential in porous calcium phosphate ceramics in vivo.Clin Orthop Relat Res. 2013;(276):291-298.

[22] Breitbart AS,Grande DA,Kessler R,et al.Tissue engineered bone repair of calvarial defects using cultured periosteal cells.Plast Reconstr Surgy.2014 Mar;101(3):567-74.

[23] Sakata Y,Ueno T,Kagawa T,et al.Osteogenic potential of cultured human periosteum-derived cells - a pilot study of human cell transplantation into a rat calvarial defect model.J Craniomaxillofac Surg. 2014;34(8): 461-465.

[24] Zhu SJ,Choi BH,Huh JY,et al.A Comparative qualitative histological analysis of tissue-engineered bone using bone marrow messenchmal stem cells,alveolar bone cells and periosteal cells.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2013; 101(2):164-169.

[25] Mizuno H,Hata K,Kojima K,et al.A novel approach to regenerating periodontal tissue by grafting autologous cultured periosteum.Tissue Eng. 2015;12(5):1227-1335.

[26] Schilephake H.Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction.Int J Oral Maxillofac Surg. 2002; 31(5):469-484.

[27] 陈鹏,刘冰.活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料修复颅骨极限缺损的实验研究[J].中国修复重建外科杂志, 2007,21(11):1191-1195.

[28] Karageorgiou V,Kaplan D.Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 2015;26(27): 5474-5479.

[29] Gauthier O,Bouler JM,Aguado E,et al.Macroporous biphasic calcium phosphate ceramics: influence of macropore diameter and macroporosity percentage on bone ingrowth. Biomaterials.1998;19(1-3):133-139.

[30] 马红梅,吴琳,艾红军,等. 纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸支架材料对人成骨细胞早期附着影响的实验研究[J].生物医学工程与临床,2007,11(3):161-163.

[31] Weibrich G,Hansen T,Kleis W, et al.Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration.Bone.2014;34(4):665-671.

[32] Kim SG,Chung CH,Kim YK,et al.Use of particulate dentin-plaster of Paris combination with /without platelet-rich plasma in the treatment of bone defects around implants.Int J Oral Maxillofac Implants. 2012; 17(1):86-94.

[33] Anitua E,Sanchez M,Nurden AT,et al.New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies.Trends Biotechnol.2006;24(5):227-234.

[34] Jensen TB,Rahbek O,Overgaard S,et al.Platelet-rich plasma and fresh frozen bone allograft as enhancement of implant fixation: An experimental study in dogs. J Orthop Res. 2004;22(3):653-658.

[35] Jensen TB,Rahbek O,Overgaard S,et al.Platelet-rich plasma and fresh frozen bone allograft as enhancement of implant fixation: An experimental study in dogs.J Orthop Res.2004;22(3):653-658.

[36] Kitoh H,Kitakoji T,Tsuchiya H,et al.Transplantation of marrow-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma during distraction osteogenesis--a preliminary result of three cases. Bone. 2004;35(4):892-898.

[37] Robiony M,Polini F,Costa F,et al.Osteogenesis distraction and platelet-rich plasma for bonerestoration of the severely atrophic mandible: preliminary results.J Oral Maxillofac Surg.2002;60(6):630-635.

[38] Zechner W,Tangl S,Tepper G,et al.Influence of platelet-rich plasma on osseous healing of dental implants: a histologic and hisgomorphometric study in minipigs.Int J Oral Maxillofac Implants. 2003;18(1): 15-22.

[39] Choi BH,Zhu SJ,Kim BY,et al.Effect of platelet-rich plasma (PRP) concentration on the viability and proliferation of alveolar bone cells: an in vitro study.Int J Oral Maxillofac Surg.2005;34(4):420-424.

[40] Kim SG,Chung CH,Kim YK,et al.Use of particulate dentin-plaster of Paris combination with /without platelet-rich plasma in the treatment of bone defects around implants.Int J Oral Maxillofac Implants. 2002; 17(1):86-94.

Anitua E, Sanchez M,Nurden AT,et al.New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol.2006;24(5):227-23

引言

大段骨缺损的修复一直是临床领域研究的重要课题，也是医学界面临的棘手难题之一。早在1934年，Key发现长管状骨骨干的直径决定了骨不愈合中骨缺损的范围，当长骨干骨缺损尺寸相当于其直径的1.5-2.5倍时，即难以自行愈合，造成永久性骨不连^[1]。寻找理想修复骨缺损的方法是相关学科长期致力解决的课题。Cook曾指出，骨修复材料应通过以下3种机制促进骨的愈合：骨传导作用、骨诱导作用和成骨作用。骨传导作用是指置入的材料可作为宿主骨长入的支架，允许原始成骨细胞长入并在其中分化和成熟，同时有血管单元的长入；骨诱导作用是指能刺激宿主的多功能间质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞；成骨作用是指前成骨细胞及成骨细胞分化成熟，形成成骨中心，进而形成新骨^[2-3]。一种理想的修复材料应既具有骨诱导性又具有骨传导性，能促进新骨的形成和生长，在新骨完成了结构和功能重建后，植入物可被完全爬行替代。

但目前骨缺损的修复主要采用自体骨移植和同种异体骨移植方法，两种方法各有优缺点，公认的自体骨移植疗效最佳，但骨源有限且供区有潜在的并发症，增加了患者的创伤和痛苦；同种异体骨是临床上常用的替代自体骨移植材料，但可诱发宿主产生剧烈免疫排异反应，目前临床上多采用经冷冻、冻干、脱钙或其他化学处理同种异体骨，其细胞成分多已坏死^[4-6]，因此同种异体骨移植在成骨机制、愈合过程中的表现、免疫反应等方面与自体骨移植有一定的差异。为克服自体骨移植和异体骨移植的缺点，近年来临床上开始广泛应用天然材料和人工材料(金属、陶瓷、高分子材料等)修复骨缺损，但无论哪种材料，其在生物相容性、可降解性、骨诱导性、生物活性等诸多方面都存在着各自的重大缺陷^[7-10]。

将具有骨诱导性的生物因子同支架材料复合培养，构建组织工程化人工骨成为骨缺损治疗的发展趋势。珊瑚人工骨作为一种良好的骨传导性骨代用品，已被国内外学者所证实^[11-16]。富血小板血浆含有多种高浓度骨生长所需要的生长因子，如血小板源性生长因子、转移性生长因子、转移性生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子和血管内皮细胞生长因子等^[17-18]，它们在骨再生的各个不同阶段通过直接或者间接的作用，促进细胞的分化与增殖，从而促进新骨再生。实验将富血小板血浆与具有良好生物相容性及骨引导性的珊瑚骨复合，修复兔下颌骨骨质缺损，探讨富血小板血浆对材料成骨活性和生物相容性的影响，为复合富血小板血浆珊瑚骨临床应用于口腔颌面部骨缺损修复提供更多资料。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年10月在广州中医药大学动物实验中心完成。

1.3 材料

珊瑚人工骨：选用海南省浅海滩产石头状滨珊瑚为原料，将其制成8 mm×8 mm×2 mm的小块，放入5%次氯酸钠溶液浸泡24 h，流水冲洗24 h，超纯水冲洗3次，5 min/次，置于66 ℃干燥箱干燥5 h，高压消毒备用。

实验动物：6月龄健康雌性新西兰大白兔24只，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：2014-0092，体质量2.5-3.0 kg。24只新西兰大白兔随机分为对照组、实验组及空白对照组，每组8只。经饲养1周观察健康状况良好，实验期间选用标准混合饲料喂养，编号分笼饲养。

仪器和工具：电子天平，AnKe离心机，10 mL离心管，吸管，移液管，吸量管，计数板，口腔用数码X射线片机(villa，意大利)，切片机，染色工具，显微镜(德国Leica MPS32)，DIA-2000病理图像分析系统(武汉大学)等。

1.4 实验方法

配置ACD-A抗凝剂及血小板稀释液：①ACD-A抗凝剂：用电子天平分别称取枸橼酸0.08 g、枸橼酸钠0.22 g、葡萄糖 0.245 g，溶于10 mL超纯水中，充分搅拌溶解，经中性滤纸过滤两次，高压灭菌，备用。②血小板稀释液：用电子天平分别称取尿素1 g、枸橼酸钠0.05 g，溶于10 mL三蒸水中，充分搅拌溶解，滴加体积分数40%甲醛0.01 mL，经中性滤纸过滤2次，备用。

富血小板血浆提取^[19-22]：术前1 d，将实验组新西兰大白兔固定后，以预先装有1 mL复方枸橼酸钠抗凝剂的10 mL注射器从心脏抽取6 mL血液，摇匀，置入10 mL离心管中。按Petrungaro 法分两次离心，第1次离心半径13.5 cm，3 650 r/min离心6 min；吸管吸取全部上清液至交界面下3 mm，移至离心管，平衡后再次离心，离心半径13.5 cm，3 000 r/min 离心6 min。吸取约3/4上清液弃掉，剩余约 0.8 mL摇匀，即为富血小板血浆，置于0 ℃冰箱内低温冰冻保存。

制备富血小板血浆复合材料^[19-22]：将珊瑚人工骨和富血小板血浆置入高温消毒小玻璃瓶或离心管中，密封，一次性注射器抽取瓶内空气，形成负压，至孔隙内无气泡冒出，使富血小板血浆充分吸附至珊瑚人工骨微小孔隙内，制备成复合富血小板血浆珊瑚骨活性材料，静置，备用。为保证每组材料的量一致，根据缺损区大小，每个样本均选取2 mm×2 mm×2 mm立方体材料7块。

制备兔下颌骨缺损模型与分组干预：所有动物均选右侧为实验侧，左侧不做处理。将新西兰大白兔以氯胺酮0.2 mL/kg耳后肌肉注射全麻成功后，右侧颌下区脱毛备皮，左侧卧位，常规消毒，铺巾，沿下颌骨下缘走行做一2.0 cm切口，依次切开皮肤、皮下组织、肌层直达骨膜，将骨膜从下颌骨下缘处切开，小心剥离下颌角区附着肌肉，游离颊舌侧骨膜，分别向两侧锐性剥离骨膜瓣直达牙槽嵴顶，在此将骨膜完整与下颌骨剥离，剥离时小心谨慎，避免穿破骨膜造成骨膜的连续性缺失。暴露下颌骨体部中段，用电机磨出10 mm×8 mm全层矩形骨缺损，对照组填入珊瑚骨，实验组填入复合富血小板血浆珊瑚骨，空白对照组未填塞任何材料，止血，分层严密缝合骨膜、肌肉、皮下组织及皮肤。

1.5 主要观察指标

大体观察：严密观察兔术后的一般情况。术后2，4，8，12周时处死动物，每组每个时间段2只，完整取下下颌骨标本，去除软组织，行大体观察，观察骨缺损区表面变化、骨缺损修复情况及周围组织反应。

放射学检查：取离体的右侧下颌骨行颊舌向正位X射线片，投照距离20 cm，投照条件70 kV，60 mA，曝光时间0.112 s，观察骨缺损愈合情况。

组织学观察：取术后2，4，8，12周各组骨缺损区，体积分数10%甲醛固定72 h，EXAKT300PC硬组织切片机将骨块沿颊舌向分切成2 mm厚的骨片，再固定24 h，流水冲洗24 h，行梯度乙醇脱水，氯仿透明，树脂浸透，42 ℃烤箱内聚合3-5 d，取出后修整组织块并以Leica SM2500E型切片机切片，厚约5 μm，苏木精-伊红染色。对所有苏木精-伊红染色结果切片进行新骨量的计算，具体步骤如下：采用DIA-2000病理图像分析系统，4倍显微镜下在缺损区选择4个角、4条边中点及缺损中央共9个视野，进行数码图像采集并计算新骨面积，9个视野区计量总和，每个标本平均为3张切片，各组各个时间段为2个标本，累计后取平均值，所有数据以均数和标准差表示^[23-25]。

1.6 统计学分析所有数据用SPSS 11.5软件处理，数据以x(_)±s表示，对术后2，4，8，12周时3组所得新骨量进行单因素方差分析，并进一步做任意两组均数之间的两两比较，再将各组每个时间段的计量值归为一组，再次进行方差分析及均数的两两比较，检验水准α=0.05。

讨论

骨组织工程的3个关键要素为种子细胞、支架材料、生长因子(骨生长因子、骨诱导因子)。骨生长因子的靶细胞是一些血管周围游走的未分化间充质细胞，其具有多向分化的特性，可不可逆的向软骨细胞、骨细胞方向分化，增大成骨性细胞量，满足大范围缺损修复的需要。支架材料一方面作为信号分子的载体，将其运送到缺损部位，另一方面为新骨生长提供框架。本实验中支架材料选择的是，与天然骨成分和分级结构都很接近的滨珊瑚。骨生长因子则可刺激成骨性细胞的有丝分裂，形成大量新骨，此次实验采用富含多种生长因子的富血小板血浆^[26]。由此可见，骨组织工程的基本出发点是以“诱导成骨”的方式，而不是单纯以“爬行替代”的方式实现骨修复和再生，实验由滨珊瑚+富血小板血浆构建组织工程骨。

实验选用的珊瑚骨为滨珊瑚，其主要成分为碳酸钙，占99%，显微结构为多孔网状，孔径100-300 µm，孔隙率为70%-90%，从结构和成分两方面模拟了天然骨，三维框架结构实现了从纳米到微米级别的骨仿生^[27-28]。多孔的结构，尤其是互联的通道，利于营养的传递和细胞的迁移。对于骨传导，所需的框架的最小孔径是80-100 μm，孔径在100-400 μm的范围是成骨细胞优选的，因为它可为细胞的机械性刺激感受器提供合适的压力和张力^[29]，并取得了良好的实验效果。初步的体内和体外实验证明，此材料是具有生物活性和生物可降解性的。

国内有研究将人成骨细胞与珊瑚骨支架材料复合培养，结果显示成骨细胞在材料表面黏附生长良好，复合生长早期细胞的增殖指数比对照组有显著性提高，支架材料上生长的细胞分裂增殖旺盛^[30]。随着培养时间的延长，细胞数量不断增多，材料的三维立体结构为细胞的生长提供了充足的空间和理想的代谢环境，同时材料表面的纳米级羟基磷灰石结构与天然骨结构相似，也为成骨细胞的分裂增殖提供了适宜的环境。但珊瑚人工骨本身无骨诱导性且降解速度过快，易导致骨修复不完全，如何使其获得骨诱导性、加快成骨速度是解决这一问题的关键。而富血小板血浆含有多种高浓度的骨生长所需要的生长因子，这些生长因子对组织的修复和再生起着重要作用，它们在骨再生的各个不同阶段通过直接或间接的作用促进细胞的分化与增殖，促进新骨再生，而这种促进骨再生的作用在血小板处于中等浓缩浓度时作用最强^[31]。Kim等^[32]研究发现当血小板的浓度在 1 000 000/μL左右时，富血小板血浆具有正面效应，能促进骨的再生。但单独使用富血小板血浆时，考虑其半衰期短、易降解或随血循环稀释，不能在局部保持长期有效浓度^[33]。因此，要为富血小板血浆选择一个良好的载体，有研究证实不与任何载体结合时，富血小板血浆并不能提高骨再生能力^[34]。所以此次实验将富血小板血浆同珊瑚骨复合，相互取长补短，在影像学观察中发现，3组骨缺损区域在12周时均能有效成骨，但成骨时间和成骨质量有所差异。2周时对照组、试验组材料区与宿主骨交界处有少量模糊云雾状致密影，隐约可见材料影像，而空白对照组缺损区中央呈透光影，边界清晰，说明实验组、对照组成骨起始时间早于空白对照组；4周时缺损边缘产生絮状高密度影，空白对照组骨缺损区仅有下颌骨下缘方向边缘模糊，说明空白对照组成骨缓慢；12周时实验组、对照组骨缺损区密度接近宿主骨，空白对照组缺损区整体密度增高，但略低于周围骨组织，说明实验组、对照组成骨质量高于空白对照组。在影像学观察中无法判定在实验组、对照组的成骨差异，但通过计量新骨面积，利用LSD进行组间多重检验，判定出实验组成骨效果更好。有大量新骨形成的富血小板血浆复合材料中的材料降解要比单纯材料快，分析其原因可能为：富血小板血浆所释放的各种因子及各种信号表达，均对血管内皮细胞有较强的趋化作用，促进了新生血管的形成^[35-39]，有利于代谢废物及降解产物的转运及排除^[40-41]。所以复合富血小板血浆珊瑚骨具有良好的生物相容性和骨传导性，作为框架材料可引导再生骨向缺损内生长，促进骨缺损修复。但同时也发现术后4周成骨效果最明显，再随着时间推移，成骨速度有所下降，富血小板血浆对骨的再生与修复的作用有时间依赖性，推测如果是浓度问题，那么如何能更好维持生长因子浓度，保持成骨速度？还是由于成骨细胞成骨时相导致速度放缓，这个问题值得进一步探讨。

实验在对珊瑚骨、富血小板血浆研究的基础上，制备了珊瑚骨+富血小板血浆活性骨修复材料，解决了以往自体骨移植、免疫排斥带来的诸多问题，通过动态观察二者联合的成骨作用，进一步验证应用珊瑚骨+富血小板血浆的可行性，结果发现：珊瑚骨在体内实验过程中，具有良好的生物相容性和骨传导性，作为框架材料可以引导再生骨向缺损内生长，促进骨缺损修复；富血小板血浆有助于诱导并促进活性材料，具有成骨诱导活性，可有效促进骨缺损愈合，第1个月内效果最显著；由珊瑚骨+富血小板血浆构建的组织工程骨，能为成骨、血管化及骨的代谢提供良好的“微环境”，进一步有效促进骨缺损的修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程