脐血间充质干细胞移植对心肌细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.022

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

心肌细胞：又称心肌纤维，受自主神经支配，属于有横纹的不随意肌，具有兴奋收缩的能力。各心肌纤维分支的末端可相互连接构成肌纤维网。根据它们的组织学特点、电生理特性以及功能上的区别，粗略地分为两大类型：一类是普通的心肌细胞，包括心房肌和心室肌，含有丰富的肌原纤维；另一类是一些特殊分化的心肌细胞，组成心脏的特殊传导系统，称为自律细胞，它们含肌原纤维甚小或完全缺乏，故收缩功能已基本丧失。

bax和caspase-3：bax基因属于bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。caspase-3是凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。

背景：研究发现，脐血间充质干细胞移植可为减少心肌细胞凋亡、减轻心肌纤维化、改善心脏功能发挥作用。

目的：观察脐血间充质干细胞移植对大鼠心肌细胞凋亡的影响。

方法：①体外实验：将原代培养72 h的正常心肌细胞作为对照组，阿霉素损伤心肌细胞作为损伤组，阿霉素损伤心肌细胞与脐血间充质干细胞共培养作为共培养组，培养48 h采用TUNEL染色评估心肌细胞的凋亡情况；②体内实验：SD大鼠45只，随机分为正常对照组、阿霉素组、脐血间充质干细胞移植组，移植后2周采用Powerlab检查心功能，蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3表达水平，组织学观察各组心肌病理变化。

结果与结论：①正常对照组的心肌细胞凋亡率较低，损伤组心肌细胞凋亡明显增加，共培养组凋亡率显著降低，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；②与阿霉素组比较，脐血间充质干细胞移植组的心功能指标明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，但仍高于正常对照组(P < 0.05)；③阿霉素组心肌细胞损伤后Bax、Caspase-3表达水平较高，脐血间充质干细胞移植组Bax、Caspase-3表达水平降低 (P < 0.05)，但仍高于正常对照组(P < 0.05)；④与阿霉素组比较，脐血间充质干细胞移植组心肌梗死面积显著减小(P < 0.05)，但仍高于正常对照组(P < 0.05)；⑤结果表明，脐血间充质干细胞作用能够抑制阿霉素诱导的大鼠心肌细胞的凋亡，其发挥作用的途径可能与下调Bax、Caspase-3的表达水平有关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7125-4281(王艳丽)

关键词: 干细胞, 移植, 脐血间充质干细胞, 心肌细胞, 细胞凋亡, 心功能, Bax, Caspase-3

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation can reduce myocardial apoptosis and myocardial fibrosis, thereby improving the cardiac function.

OBJECTIVE: To observe the effect of umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation on myocardial apoptosis in rats.

METHODS: (1) In vitro test: Normal myocardial cells cultured for 72 hours were enrolled as control group. Myocardial cells injured by adriamycin alone were enrolled as injury group. Adriamycin-injured myocardial cells were co-cultured with umbilical cord blood mesenchymal stem cells as co-culture group. After 48 hours of culture, TUNEL assay was used to assess myocardial apoptosis in rats. (2) In vivo test: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomized into normal control, adriamycin, and umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation (cell transplantation) groups. Two weeks after cell transplantation, PowerLab was used to test cardiac function, and western blot employed to detect Bax and Caspase-3 expression levels. Meanwhile, pathological changes of the myocardial tissues were observed in the three groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro test: The apoptotic rate of myocardial cells was significantly increased in the injury group compared with the control group, but decreased significantly in the co-culture group compared with the injury group (P < 0.05). (2) In vivo test: In the cell transplantation group, the cardiac function indexes, expression levels of Bax and Caspase-3 and myocardial infarction size were significantly improved compared with the adriamycin group (P < 0.05), but still not recovered to the normal levels (P < 0.05). These results show that umbilical cord blood mesenchymal stem cells acting on the rat myocardial cells can inhibit adriamycin-induced myocardial apoptosis, and the relevant mechanism is probably related to down-regulation of Bax and caspase-3 expression.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Myocytes, Cardiac, Apoptosis, Tissue Engineering

王艳丽，李金峰，王艳萍，高明. 脐血间充质干细胞移植对心肌细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2123-2128.

Wang Yan-li, Li Jin-feng, Wang Yan-ping, Gao Ming. Effect of umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation on myocardial cell apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2123-2128.

图/表（结果） 7

2.1 脐血间充质干细胞和心肌细胞的形态原代培养的脐血间充质干细胞为圆形，4-7 d后出现贴壁，最初散在分布，培养7 d左右时，逐渐伸出突起，细胞呈长梭形或多角形，部分细胞呈集落状生长，随着培养时间延长，成纤维样的短梭形细胞占优势，也有一部分为多角形。培养八九天时，细胞铺满培养瓶底面，呈漩涡状生长，漩涡中心的细胞为复层生长。三四周细胞生长可达到80%融合。细胞传至第2代，杂细胞生长受到明显抑制，细胞形态为较单一的成纤维样细胞，呈漩涡样生长，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD34、CD45、CD49、CD90及CD105呈阳性表达，脐血间充质干细胞均一性好，纯度达95%以上，见图1。

原代培养的心肌细胞呈圆形，可见少量细胞的节律收缩跳动，24 h后有贴壁细胞出现，贴壁细胞呈多边形或长梭形，培养至第4天时，开始出现集落，细胞的节律收缩明显有力。第3代心肌细胞呈明显集落样生长，细胞搏动呈同步化，见图2。

2.2 大鼠心肌细胞凋亡情况 TUNEL法检测结果显示，正常对照组的心肌细胞凋亡率较低(2.13±0.75)%，损伤组心肌细胞总数明显减少，凋亡的阳性细胞数比例明显增加(22.48±2.68)%，与脐血间充质干细胞共培养后其凋亡率显著降低(16.44±1.59)%，心肌细胞总数较损伤组明显增加，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.3 Powerlab心功能指标的评估移植后2周的Powerlab检查结果见表1。与对照组及损伤组比较，移植组的左心室舒张压等指标明显降低，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 Bax、caspase-3蛋白表达 Western Blot检测结果显示，损伤组的Bax表达水平较高，caspase-3的表达亦上调，而脐血间充质干细胞移植组Bax表达水平明显降低，caspase-3的表达亦明显下调，各组间的表达差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.5 组织学观察大鼠心肌病理变化及梗死面积与对照组及损伤组比较，移植组心肌梗死面积显著减小，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。苏木精-伊红染色可见损伤组的心肌细胞数量明显减少，细胞核大小不规则，细胞分界不清楚；移植组的心肌细胞数量较损伤组明显增加但低于正常组(P < 0.05)，见图4。各组大鼠心肌梗死面积比较见表3。

参考文献

[1] 马群兴,李彤,赵越,等.脐带间充质干细胞与脐血CD34+细胞联合移植治疗心肌梗死[J].中华胸心血管外科杂志, 2014,30(2):82-89.

[2] 杨水祥,黄景玲,朱希山.人脐血间充质干细胞抑制心肌细胞凋亡的作用与安全性[J].中华老年心脑血管病杂志, 2010,12(9):829-832.

[3] 杨水祥,黄景玲.共培养条件下人脐血间充质干细胞抑制心肌细胞凋亡:是否安全有效 [J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(6):1120-1124.

[4] 黄景玲,杨水祥,陈一戎.人脐血间充质干细胞抗缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(27):4979-4983.

[5] Sun Y, Deng T, Lu N, et al. B-type natriuretic peptide protects cardiomyocytes at reperfusion via mitochondrial calcium uniporter. Biomed Pharmacother. 2010;64(3):170-176.

[6] 李鑫辉,黄政德,杜建芳,等.疏肝活血中药对骨髓间充质干细胞移植心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响[J].中国中医药信息杂志,2015,22(3): 56-59.

[7] Ustunel I, Acar N, Gemici B, et al. The effects of water immersion and restraint stress on the expressions of apelin, apelin receptor (APJR) and apoptosis rate in the rat heart.Acta Histochem. 2014;116(5):675-681.

[8] 马南,钟竑,陈德海,等.脐血间充质干细胞移植对急性心肌梗死模型犬残存心肌组织的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(46): 9404-9407.

[9] 樊志刚,白瑞樱.人脐血干细胞向心肌细胞分化中Notch信号的表达[J].医药前沿,2013,3(21):71-72.

[10] Euler G. Good and bad sides of TGFβ-signaling in myocardial infarction. Front Physiol. 2015;6:66.

[11] Wang ZG, Wang Y, Huang Y, et al. bFGF regulates autophagy and ubiquitinated protein accumulation induced by myocardial ischemia/reperfusion via the activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway. Sci Rep. 2015;5:9287.

[12] Hosoda T, Kajstura J, Leri A, et al. Mechanisms of myocardial regeneration. Circ J. 2010;74(1):13-17.

[13] 于洪艳,朱丹,丁宁.丹红注射液预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中医临床研究,2015, 7(13):3-5.

[14] Zhang H, Wang Z, Feng SJ, et al. PEDF improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction via inhibiting vascular permeability and cardiomyocyte apoptosis. Int J Mol Sci. 2015;16(3):5618-5634.

[15] Song Y, Yu Q, Zhang J, et al. Increased myocardial ischemia-reperfusion injury in renal failure involves cardiac adiponectin signal deficiency. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2014;306(9):E1055-1064.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外对比观察，随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2012年4月至2014年12月在河北医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 1-3 d龄的SD乳鼠3只，8周龄SD大鼠45只，雌雄不限，体质量250-300 g，购自河北医科大学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK(冀)20050001。

1.3.2 脐血标本和主要试剂脐血由唐山市开滦总医院提供；L-DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(上海拜力科技公司)；胰蛋白酶(美国Santa Cruz公司)；PBS粉剂(福州迈新)；大鼠心肌细胞培养基(北京裕恒丰科技有限公司)；兔抗鼠Bax抗体、兔抗鼠caspase-3抗体、β-actin兔抗鼠多克隆抗体和辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体(美国SBI公司)；Western blot蛋白检测试剂盒(美国Santa Cruz公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(美国Invitrogen公司)；细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)；SONOS7500惠普多普勒超声诊断仪(美国惠普公司)；二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；倒置显微镜(TE300，日本Nikon公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐血间充质干细胞的分离培养和鉴定在无菌环境下获得脐血50-100 mL，20 U/mL肝素抗凝，4 ℃冰箱保存。标本在采集后12 h内进行分离，将脐血与Hank’s液以1∶1稀释，取无菌离心管数个加入密度为1.077 g/cm³的淋巴细胞分离液，稀释后的脐血以1∶2的比例加入，保持液面分界状态，以800×g离心20 min，小心吸取中间白膜层，用磷酸盐缓冲液冲洗2遍，以彻底弃去上清。分离单个核细胞后，以1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12的培养瓶中培养，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。第1次传代后每3 d换液1次，逐日观察细胞的生长情况，选取生长优良的第3代细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后制成1.0×10⁶的单细胞悬液，每管0.1 mL，加入荧光标记小鼠抗人抗体CD34-FITC、CD45-FITC、CD49-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC及CD29-FITC各20 μL及相应对照标记，在室温下反应30 min，PBS洗涤1遍，1 000 r/min离心5 min，振荡混匀，上流式细胞仪检测表面标记。

1.4.2 SD乳鼠心肌细胞的分离、培养将1-3 d龄的SD乳鼠用体积分数为5%乙醇浸泡消毒约5 min，置于无菌培养皿中，固定好乳鼠躯体，以充分暴露胸部，自胸骨下段1/3部位剪开胸腔，从根部剪断取出乳鼠心脏，置于含4 ℃ PBS平衡盐缓冲液的无菌培养皿中，在冰上进行操作，小心去除心房和大血管，剪取左室组织，用4 ℃ PBS平衡盐缓反复冲洗5遍，清除残留积血，采用眼科剪将心脏组织剪碎成约1 mm³大小的组织块。将心脏组织块转移到无菌锥形瓶中，弃掉PBS平衡盐缓冲液，加入0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶各5 mL的混合消化液，恒温晃动，消化15 min，弃去上清液，置于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基中培养48 h，用0.25%胰酶消化细胞，体积分数为20%胎牛血清终止消化，消化3次，每次15 min。收集每次消化的上清液得到原代心肌细胞，当细胞达80%融合时传代，按1︰3进行传代。取第3代细胞，消化洗涤后送流式细胞仪检测。

1.4.3 体外实验及TUNEL染色取第3代心肌细胞1.0×10⁶加入终质量浓度为1 mg/L的阿霉素作用4 h建立阿霉素损伤心肌细胞模型。取第3代心肌细胞1.0×10⁶不做任何处理作为对照组，阿霉素损伤心肌细胞作为损伤组，阿霉素损伤心肌细胞(1.0×10⁶)与脐血间充质干细胞共培养(1.0×10⁶)作为实验组。3组培养48 h后行TUNEL染色评估心肌细胞凋亡情况。收集各组细胞行细胞爬片，吸弃培养液，自然晾干，40 g/L多聚甲醛溶液固定，新鲜配制体积分数为3% H₂O₂室温处理，0.1% TritonX-100(溶于0.1%枸橼酸钠溶液)打孔，按TUNEL试剂盒说明操作，DAB显色，苏木精轻度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察。每张切片观察3个视野，每个视野连续数300个细胞，计数凋亡细胞百分比即为凋亡指数。

凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%

1.4.4 动物模型建立及分组 8周龄SD大鼠45只，随机分为3组，每组15只。正常对照组不做处理，阿霉素组腹腔注射阿霉素制备心肌梗死模型，每次5 mg/kg (0.6 g/L)，隔日1次，共21 d。脐血间充质干细胞移植组按上述方法造模后，尾静脉移植脐血间充质干细胞悬液1 mL(1×10⁶个)，1次/d，连续3 d。

1.4.5 Powerlab评估心功能移植后2周，经颈动脉插管将Millar测压导管置入左心室，远端接上换能器，Powerlab多功能生理仪监测左心室血流动力学指标，包括左心室收缩压、左心室舒张末压，左室压上升及下降最大速率，取平均值，应用Powerlab系统自带软件分析统计数据。

1.4.6 Western Blot方法检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3的表达水平移植后2周，取各组大鼠心肌组织100 mg加入1 mL蛋白裂解液，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。将提取的总蛋白进行SDS-PAGE分离，取40 μg蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，配制5 mL 12%分离胶溶液，灌注于两玻璃板间，小心覆盖一层无水乙醇，室温下放置约30 min，使胶充分凝固。将未聚合的聚丙稀酰胺除去，并转移至硝酸纤维素膜，用封闭液室温封闭2 h，分别加入兔抗鼠Bax抗体1∶800，或兔抗鼠caspase-3抗体1∶800，37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗体1∶700，37 ℃摇床孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×4次，二甲基联苯胺显色，重复3次，Quantity one图像分析，以目的条带灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白表达。

1.4.7 组织学观察大鼠心肌病理变化及梗死面积移植后2周，SD大鼠腹腔麻醉，开胸取出心脏，剪除左右心房、大血管及附着的结缔组织，于冠状位切取厚度为2.0- 3.0 mm的左室切面，PBS平衡盐缓冲液反复漂洗5次，去除残留积血，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红染色观察各组大鼠心肌病理变化。采用CIMA 2400图像分析仪测量心肌梗死面积和整个心肌横断面面积，计算心肌梗死部分占心肌横断面面积的百分比。

1.5 主要观察指标 ①TUNEL染色评估心肌细胞的凋亡情况。②Powerlab评估大鼠心功能。③Western Blot方法检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3的表达水平。④组织学观察大鼠心肌病理变化及梗死面积。

1.6 统计学分析所有数值以x(_)±s表示。采用SPSS 15.0软件，两组间行t 检验，多组间用方差分析作q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验在体外建立阿霉素损伤心肌细胞模型，模拟急性心肌梗死后心肌细胞的损害应激微环境，通过TUNEL凋亡检测证实了脐血间充质干细胞具有促进心肌细胞恢复的作用，能够抑制阿霉素诱导的大鼠心肌细胞的凋亡。脐血间充质干细胞可在体外诱导分化为多种组织细胞，现已成为国内外干细胞研究领域的热点，其治疗心肌梗死具有广阔的应用前景^[4-6]。

在体外实验的基础上，进行大鼠体内实验，结果显示，脐血间充质干细胞移植组大鼠左心室舒张压等指标明显降低，心肌组织Bax、caspase-3表达呈不同程度降低，同时与阿霉素组比较，心肌梗死面积显著减小，其发挥作用的途径可能与下调Bax、Caspase-3的表达水平有关。研究发现，细胞凋亡的信号转导通路主要有线粒体通路、死亡受体通路、内质网应激启动的凋亡通路等，生理情况下，Bax蛋白在心肌组织几乎不表达，损伤发生后呈高表达，Bax基因家族蛋白在线粒体凋亡通路中是主要调节因子，决定着细胞最终是否凋亡^[7-9]。生理状态下Bax蛋白位于胞质，一旦接受凋亡信号刺激，就转移到线粒体膜PT孔，使Bcl-2等失活，PT孔开放，使膜间隙促凋亡因子释放入胞质^[10-12]，引起染色体凝聚、核破裂、DNA降解，促进凋亡^[13-14]。caspase与线粒体凋亡通路、死亡受体凋亡通路、内质网应激凋亡通路均有密切关联^[15]。死亡信号通路激活后，caspase-3等相继被激活。激活的caspase-3再作用于p38 MAPK激酶，促进细胞凋亡。细胞凋亡是由多种因素共同作用的结果，此研究仅探讨了脐血间充质干细胞移植对Bax、Caspase-3蛋白表达的影响，其他关于心肌细胞的具体凋亡作用机制还需进一步探讨研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程