胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (11): 1597-1602.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.012

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胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用

李向辉，王贵吉

郑州大学第一附属医院肿瘤科三病区，河南省郑州市 450052

收稿日期:2016-02-07 出版日期:2016-03-11 发布日期:2016-03-11
通讯作者: 王贵吉，教授，郑州大学第一附属医院肿瘤科三病区，河南省郑州市 450052
作者简介:李向辉，男， 1986年生，汉族，河南省周口市人，郑州大学在读硕士，医师。
基金资助:
国家自然科学基金(81170520)

Effect of gastric cancer stem cells CSC-G on invasion and metastasis of gastric cancer cells

Li Xiang-hui, Wang Gui-ji

Third Ward, Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2016-02-07 Online:2016-03-11 Published:2016-03-11
Contact: Wang Gui-ji, Professor, Third Ward, Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Li Xiang-hui, Studying for master’s degree, Physician, Third Ward, Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81170520

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

胃癌干细胞：被认为是引起胃癌耐药、转移以及复发的根本原因，胃癌在经过常规手术治疗或者辅助化疗治疗后，胃癌干细胞的数量并没有减少，并出现富集的现象，从而导致胃癌的转移和复发。

胃癌干细胞的分离和鉴定：①分子标记物分选法：用于胃癌干细胞分选的分子标志物主要有CD44⁺，CD90⁺，CD44⁺CD24⁺，CD44⁺CD54⁺等多种分子标志物。②侧群细胞法：根据肿瘤干细胞具有外排荧光染料能力的特性进行分选肿瘤干细胞。③成球培养法：胃癌细胞可以在无血清的培养基中成球生长，成球培养法可以用于胃癌干细胞的分离培养。④化疗药物富集法：采用化疗药物长春新碱诱导的胃癌细胞具有干细胞的特性，也可以用于胃癌干细胞的分离和培养。

背景：研究表明肿瘤干细胞在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用，关于胃癌干细胞在胃癌的侵袭和转移中的作用的研究不多。

目的：观察胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用。

方法：对胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞进行为期10 d的体外培养。进行球形克隆形成实验，Western blot法检测胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的OCT4，SOX2，E-cadherin和CD44蛋白表达，Transwell法检测胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的侵袭性和迁移能力。

结果与结论：①细胞形态：胃癌细胞SGC7901在RPMI1640培养基中呈现贴壁生长，传代后细胞为四边形或者多角形；胃癌干细胞CSC-G在无血清培养基中呈悬浮生长，贴壁生长的胃癌干细胞呈梭形或圆形；②细胞侵袭性和迁移性：与胃癌细胞SGC7901相比，胃癌干细胞CSC-G的OCT4，SOX2，CD44蛋白表达：瘤球数量，穿过基底膜的细胞数明显升高(P < 0.05)，E-cadherin蛋白表达降低(P < 0.05)；③结果表明，实验成功体外培养了胃癌干细胞CSC-G，其侵袭性和迁移能力与胃癌细胞相比明显增强，说明胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0001-7851-419X(王贵吉)

关键词: 组织构建, 组织工程, 胃癌, 干细胞, 胃癌干细胞, 更新, 分化, 侵袭, 转移, 复发, 球形克隆无血清培养, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that cancer stem cells play an important role in tumor invasion and metastasis, but studies on the role of gastric cancer stem cells in invasion and metastasis of gastric cancer cells were rarely reported.
OBJECTIVE: To study the effect of gastric cancer stem cells CSC-G on invasion and metastasis of gastric cancer cells.
METHODS: Gastric cancer stem cells CSC-G and gastric cancer cells SGC7901 were cultured in vitro for 10 days followed by spherical colony formation assay, western blot assay for detecting OCT4, SOX2, E-cadherin and CD44 protein expression levels in gastric cancer stem cells CSC-G and gastric cancer cells SGC7901, and Transwell assay for detecting the invasion and migration of gastric cancer stem cells and gastric cancer cells SGC7901.
RESULTS AND CONCLUSION: Gastric cancer cells SGC7901 in RPMI1640 medium presented with adherent growth and were quadrilateral or polygonal after passage; gastric cancer stem cells CSC-G in serum-free medium presented with suspension growth, and adherent gastric cancer stem cells were spindle-shaped or round. Compared with gastric cancer cells SGC7901, the protein expressions of OCT4, SOX2 and CD44, the number of cancer cell spheres and the number of trans-membrane cells were significantly increased in the gastric cancer stem cells CSC-G (P < 0.05), and the expression of E-cadherin protein was significantly decreased (P < 0.05). These findings indicate that the gastric cancer stem cells CSC-G can be successfully cultured in vitro, and have enhanced invasion and migration compared with the gastric cancer cells SGC7901, which play an important role in gastric cancer invasion and metastasis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

李向辉，王贵吉. 胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1597-1602.

Li Xiang-hui, Wang Gui-ji. Effect of gastric cancer stem cells CSC-G on invasion and metastasis of gastric cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(11): 1597-1602.

图/表（结果） 3

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引言

胃癌是中国比较常见的消化系统恶性肿瘤，一般难以早期诊断，发现时常为胃癌中晚期，预后比较差^[1]。胃癌目前的治疗主要为手术治疗，围手术期联合化疗提高胃癌的治疗效果，增加总有效率，延长胃癌患者寿命，但5年生存率仍比较低^[2-3]。

分子靶向药物治疗是胃癌的一种新的治疗方法^[4]，但分子靶向药物治疗的治疗效果欠佳。研究胃癌的化疗耐药性以及逃避靶向药物治疗的发生机制具有比较重要的意义。肿瘤干细胞是一类具有分化和更新能力的干细胞，首先在血液疾病中被分离，后来在肝癌、结肠癌、胃癌以及乳腺癌等癌症中被分离^[5-7]。

肿瘤干细胞具有比较强的DNA修复能力，自我更新和分化能力，少量肿瘤干细胞就可以形成肿瘤，是肿瘤发生转移和复发的主要原因，肿瘤干细胞能够进行不对称分裂维持不断更新，进行对称分裂不断增殖，从而维持肿瘤的侵袭与增殖^[8-10]。肿瘤干细胞同时具有分化血管的能力，能够分化为血管内皮细胞，肿瘤干细胞分化的血管内皮细胞可以抵抗肿瘤血管分子靶向药物，并加快肿瘤的转移以及复发^[11]。

目前胃癌干细胞被认为是引起胃癌耐药、转移以及复发的根本原因，胃癌在经过常规手术治疗或者辅助化疗治疗后，胃癌干细胞的数量并没有减少，并出现富集的现象，从而导致胃癌的转移和复发^[12-16]。研究表明，肿瘤干细胞在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用，关于胃癌干细胞在胃癌的侵袭和转移中的作用的研究不多。

实验通过对胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞进行培养，并进行球形克隆形成实验，检测两种细胞的OCT4，SOX2，E-cadherin和CD44蛋白表达水平，检测两种细胞的侵袭性和迁移能力，发现胃癌干细胞能够被成功培养，培养的胃癌干细胞具有干细胞的特性，侵袭性和迁移能力明显增强，胃癌干细胞在胃癌的侵袭和转移中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2014年9月至2015年8月在郑州大学第一附属医院实验室完成。

1.3 材料胃癌干细胞CSC-G和胃癌SGC7901细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞复苏将胃癌SGC7901细胞冻存管从液氮罐中取出，置入水浴中融化，将冻存细胞移到培养皿中，加入培养液进行培养，第2天更换培养液，光学显微镜下观察细胞的生长情况。

1.4.2 细胞传代待培养皿中的细胞生长至85%以上融合时进行传代培养，吸出培养液，PBS洗涤，胰蛋白酶(美国Sigma公司)消化，消化完成后加入含血清的培养液终止消化，制成细胞悬液，将细胞悬液进行分装到不同培养瓶中继续培养。

1.4.3 细胞冻存选择生长良好的细胞，吸取培养液，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，然后移至离心管中离心，弃去上清液，加入冻存液悬浮细胞，然后分装到冻存管中置入-80 ℃冰箱冷冻，次日转入液氮罐中冻存。

1.4.4 SGC7901胃癌细胞的培养将SGC7901胃癌细胞接种到RPMI培养基(Hyclone公司)中培养，SGC7901胃癌细胞呈贴壁生长，每隔2 d进行1次换液，细胞达90%以上融合时胰蛋白酶进行消化，并进行传代培养。

1.4.5 胃癌干细胞的培养将胃癌干细胞接种到无血清DMEM/F12培养基中进行培养，胃癌干细胞呈悬浮生长，胃癌干细胞接种后每日添加培养液，10 d进行传代培养。

1.4.6 SGC7901胃癌细胞和胃癌干细胞的球形克隆形成实验传代培养10 d，将SGC7901胃癌细胞和胃癌干细胞接种到6孔板中，加入无血清DMEM/F12培养基进行培养，每天显微镜下观察细胞瘤球的形成情况。将胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞接种于6孔板中，加入无血清培养基进行培养21 d，取3个视野计数瘤球个数，取平均值。

1.4.7 Western blot检测传代培养10 d，提取细胞总蛋白：取生长良好的细胞，PBS洗涤，消化离心，加入RIPA裂解液进行细胞裂解，超声细胞粉碎仪对细胞进行粉碎，离心，得到细胞总蛋白；蛋白浓度测定：采用BCA法对蛋白浓度进行测定：将细胞蛋白加入96孔板中，并加入BCA工作液孵育，酶标仪对吸光度值(A_{562 nm})进行测定；蛋白免疫印迹：配制SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，取细胞蛋白和上样缓冲液进行变形，离心，恒压电泳，电泳结束后，去除浓缩胶，加入蛋白转移缓冲液漂洗，裁剪PVDF膜，低温转膜，丽春红染色，脱脂奶粉封闭，加入β-actin和蛋白一抗过夜孵育，TBST漂洗，HRP标记的二抗孵育，TBST漂洗，ECL显色观察。

1.4.8 细胞侵袭性检测采用Transwell对胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的侵袭性进行检测：用无血清培养基稀释ECM基质胶进行培养，加入到Transwell小室中，将胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞进行悬浮，将Transwell小室下室加入含胎牛血清的培养基，上室加入无血清培养基，细胞悬液加入上室中进行培养，取出小室，将其风干，加入结晶紫染液染色，PBS洗涤，显微镜下进行拍照计数。

1.4.9 细胞迁移能力检测采用Transwell对胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的迁移能力进行检测：24孔板中介入含血清培养基，对胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞进行消化，接种到小室内进行培养，计数透膜的细胞数，将小室进行甲醇固定，PBS洗涤，加入结晶紫染液染色，显微镜下进行拍照观察细胞的透膜情况。

用无血清培养基稀释ECM基质胶进行培养，加入到Transwell小室中，将胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞进行悬浮，将Transwell小室下室加入含胎牛血清的培养基，上室加入无血清培养基，细胞悬液加入上室中进行培养，取出小室，将其风干，加入结晶紫染液染色，PBS液洗涤，光学显微镜下进行拍照计数。

1.5 主要观察指标胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的干细胞标志物鉴定结果，球形克隆形成情况，侵袭性检测结果，E-cadherin和CD44的表达水平检测结果及细胞迁移能力。

1.6 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 18.0软件进行数据处理，组间数据差异的比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前，利用肿瘤干细胞治疗癌症是医学界的研究热点。癌症成为当今世界上人类死亡的主要原因，癌症转移是癌症死亡的首要原因，大量癌症患者死于癌症的转移，乳腺癌、食管癌和胃癌等癌症患者在早期难以发现，常就诊时已为癌症中晚期，有部分患者在治疗时已发生远处转移，癌症的远处转移使手术无法对癌组织彻底切除，给癌症患者的治疗带来了很大困难。癌症具有异质性的特点，癌症组织中有侵袭转移性的细胞是引起癌症的侵袭和转移的主要原因，肿瘤干细胞即为具有侵袭转移能力的细胞，在癌症的侵袭和转移中发挥重要作用^[17-40]。

肿瘤干细胞是癌症组织中的一小部分具有自我更新和多向分化能力、具有成瘤性的肿瘤细胞。肿瘤干细胞是具有侵袭和转移性质的肿瘤细胞亚群，一般处在肿瘤侵袭的前缘，肿瘤中的肿瘤干细胞越多，患者发生肿瘤侵袭和转移的可能性越大，治疗起来越困难，预后越差。

肿瘤干细胞的侵袭和转移和肿瘤干细胞的上皮间质转化有关，肿瘤细胞离开原发灶向远处侵袭转移的主要过程是肿瘤细胞发生上皮间质转化，在肿瘤细胞发生上皮间质转化的过程中发生分子表达的变化，主要的分子表达变化为上皮细胞标志物表达不断丢失，间质细胞标志物表达不断增加，基质金属蛋白酶的分泌不断增多，肿瘤细胞表面的分子发生变化使肿瘤细胞离开原发灶部位，并具有向远处运动的能力，分泌增多的基质金属蛋白酶能够使发生上皮间质转化的细胞存活，肿瘤细胞通过上皮间质转化不仅能够使肿瘤细胞得到运动迁移的能力，还能够使其得到干性特性，具有干性的肿瘤细胞增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。

肿瘤干细胞都具有异质性，但并不都具有侵袭转移性，通过上皮间质转化的肿瘤细胞多具有干性特点，并通过上皮间质转化获得迁移能力，因此将发生上皮间质转化的细胞称为迁移性肿瘤干细胞，迁移性肿瘤干细胞的侵袭和迁移能力更强。目前分离的肿瘤干细胞有乳腺癌肿瘤干细胞、结肠癌肿瘤干细胞、肝癌肿瘤干细胞以及胃癌肿瘤干细胞等多种肿瘤干细胞。

胃癌干细胞研究对于胃癌的治疗有很重要的意义。胃癌的发生发展机制尚不清楚，胃癌干细胞的兴起为胃癌的发生发展机制的研究提供了新的思路。肿瘤干细胞的来源一般认为是由正常干细胞转化而来，也可能是通过突变获得干性的分化细胞或者正常祖细胞，胃癌干细胞也认为是胃干细胞通过基因突变而来，胃癌细胞的上皮间质转化也可以诱导胃癌干细胞的产生。胃癌干细胞的分离和鉴定是胃癌干细胞研究中的难点问题，目前胃癌干细胞的分离和鉴定有以下几种方法：①分子标记物分选法：用于胃癌干细胞分选的分子标志物主要有CD44⁺，CD90⁺，CD44⁺CD24⁺，CD44⁺CD54⁺等多种分子标志物。②侧群细胞法：根据肿瘤干细胞具有外排荧光染料能力的特性进行分选肿瘤干细胞。③成球培养法：不少肿瘤干细胞能够在一定条件培养基中成球生长，形成的细胞球具有多向分化、自我更新以及成瘤的特点，胃癌细胞可以在无血清的培养基中成球生长，成球培养法可以用于胃癌干细胞的分离培养。④化疗药物富集法：采用化疗药物长春新碱诱导的胃癌细胞具有干细胞的特性，也可以用于胃癌干细胞的分离和培养。胃癌干细胞具有自我更新的能力，具有成瘤性，同时具有高度的侵袭转移性，胃癌干细胞的侵袭转移的重要事件是细胞的运动迁移，在胃癌的侵袭转移中胃癌干细胞发挥重要作用，胃癌干细胞还具有耐药性，胃癌干细胞的耐药性是胃癌治疗抵抗的根本原因。

实验通过对胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞进行培养，并进行球形克隆形成实验，检测胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的OCT4，SOX2，E-cadherin和CD44蛋白表达水平，检测胃癌干细胞和SGC7901胃癌细胞的侵袭性和迁移能力。结果发现：SGC7901胃癌细胞在RPMI1640培养基中呈现贴壁生长，传代后细胞为四边形或者多角形；胃癌干细胞在无血清培养基中呈悬浮生长，贴壁生长的胃癌干细胞呈梭形或圆形。胃癌干细胞OCT4和SOX2蛋白的表达水平明显高于胃癌细胞SGC7901的OCT4和SOX2蛋白的表达水平。胃癌干细胞的瘤球个数明显高于SGC7901胃癌细胞的瘤球个数。细胞的侵袭性结果发现胃癌干细胞穿过基底膜的细胞数明显高于SGC7901胃癌细胞穿过基底膜的细胞数。胃癌干细胞E-cadherin蛋白的表达明显低于胃癌细胞SGC7901的E-cadherin蛋白表达；胃癌干细胞CD44蛋白表达明显低于高于胃癌细胞SGC7901的CD44蛋白表达。细胞的迁移能力结果发现胃癌干细胞穿过基底膜的细胞数明显高于SGC7901胃癌细胞穿过基底膜的细胞数。由此可见，胃癌干细胞能够被成功培养，培养的胃癌干细胞具有干细胞的特性，胃癌干细胞的侵袭性和迁移能力与胃癌细胞比明显增强，胃癌干细胞在胃癌的侵袭和转移中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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