脂肪干细胞分离、纯化和保存：研究进展与未来方向

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.020

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (10): 1508-1520.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.020

• 干细胞综述 stem cell review • 上一篇

脂肪干细胞分离、纯化和保存：研究进展与未来方向

陈犹白^1，2，陈聪慧³，Qixu Zhang²，韩岩¹

¹解放军总医院整形修复科，北京市 100853；²美国德克萨斯大学MD安德森肿瘤中心整形外科，美国休斯敦 77030；³美莱医疗美容医院口腔美容中心，北京市 100020

收稿日期:2016-01-16 出版日期:2016-03-04 发布日期:2016-03-04
通讯作者: 韩岩，主任医师，教授，博士生导师，解放军总医院整形修复科，北京市 100853 并列通讯作者：Qixu Zhang，助理教授，美国德克萨斯大学MD安德森肿瘤中心整形外科，休斯敦 77030
作者简介:陈犹白，男，1986年生，黑龙江省齐齐哈尔市人，汉族，解放军医学院在读博士，美国德克萨斯大学MD安德森肿瘤中心联合培养博士，医师，主要从事脂肪干细胞和组织工程的研究。

Isolation, purification and preservation of adipose-derived stem cells: research progress and future development

Chen You-bai^{1, 2}, Chen Cong-hui³, Qixu Zhang², Han Yan¹

¹Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; ²Department of Plastic Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston 77030, Texas, USA; ³Dental Cosmetic Center, Mylike Aesthetic and Plastic Surgery Hospital, Beijing 100020, China

Received:2016-01-16 Online:2016-03-04 Published:2016-03-04
Contact: Han Yan, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 1000853, China Corresponding author: Qixu Zhang, Assistant professor, Department of Plastic Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston 77030, Texas, USA
About author:Chen You-bai, Studying for doctorate, Physician, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 1000853, China; Department of Plastic Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston 77030, Texas, USA

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

基质血管成分：即脂肪组织经过消化离心后获得的细胞沉淀，其中脂肪干细胞约占10%，此外还包括脂肪前体细胞、内皮祖细胞、内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、造血干细胞、白细胞、红细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等。很多研究忽略了基质血管成分的异质性，误将基质血管成分作为脂肪干细胞研究。只有区分基质血管成分和脂肪干细胞，才能明确脂肪干细胞的功能和作用。

Cytori：是一种FDA批准的自动脂肪干细胞分离系统，此系统将分离时间缩短至1.0-2.0 h内，获得的细胞可以直接应用于患者。基于此系统的细胞疗法称为Cytori Cell Therapy^TM，已被批准应用于治疗慢性心衰、急性心肌梗死和乳腺癌术后乳房重建等，其他适应证如硬皮病、骨关节炎、热灼伤和辐射伤、尿失禁等一系列不同阶段的临床试验正在开展之中。

背景：2001年，Zuk等从吸脂术抽出的脂肪中发现了脂肪干细胞，揭开了干细胞研究的新篇章。近年来的研究证实，干细胞广泛存在于体内各组织，但脂肪干细胞以其来源广泛、获取简单等优点，一直以来是整形修复科、组织工程和再生医学等相关学科的研究重点。

目的：从脂肪组织的取材、脂肪干细胞的分离、纯化、传代培养和冻存等方面进行综述，讨论上述过程中影响脂肪干细胞产量、增殖和分化能力的主要因素，同时提出目前的问题和未来的研究方向。

方法：于2015年9月10日在PubMed中以(adipose stem cells[Title]) OR (adipose-derived stem cells[Title]) OR (adipose-derived mesenchymal stem cells[Title])作为检索式进行检索，在SinoMed中以(“脂肪干细胞”[中文标题:智能])or(“脂肪间充质干细胞”[中文标题:智能])作为检索式进行检索。通过标题及摘要判断其主要内容，最终选取81篇代表性文献。文章还介绍了美国德克萨斯大学MD安德森肿瘤中心整形科和TRAMCEL实验室(Tissue Regeneration and Molecular Cell Engineering Lab)的相关经验。

结果与结论：脂肪组织分布广泛，给脂肪干细胞提供了充足的来源。利用吸脂术获得脂肪组织，患者痛苦小，供区损伤低。胶原酶消化法操作简单，产量高，仍然是基础实验中脂肪干细胞的主要分离方法，但是临床应用中一般不分离脂肪干细胞，或者利用临床级的无异种胶原酶甚至无酶的分离方法。脂肪干细胞的产量、表型、增殖和分化能力等生物学特性会受到取材和分离过程中多种因素的影响，因此目前需要制定标准化的脂肪干细胞分离准则。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-6810-2957 (韩岩)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 分离, 纯化, 冻存, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: In 2001, Zuk et al found adipose-derived stem cells (ASCs) from the aspirate of liposuction for the first time, which launched a new era of stem cell research. In recent years, stem cells have been proved to widely exist in many tissues and organs. ASCs are always in the spotlight of plastic and reconstructive surgery, tissue engineering and regenerative medicine because of extensive sources and simple isolation.
OBJECTIVE: To review the fat tissue harvesting and ASCs isolation, purification, expansion, and cryopreservation, to discuss the main factors which influence the yield, proliferation capacity and differentiation potential of ASCs, and to predict the future research interests based on current issues.
METHODS: On September 10th, 2015, relevant articles were searched in PubMed using the following format: (adipose stem cells[Title]) OR (adipose-derived stem cells[Title]) OR (adipose-derived mesenchymal stem cells[Title]) and in SinoMed using the following format in Chinese: (“adipose-derived stem cells” [Title])or(“adipose-derived mesenchymal stem cells”[Title]). Finally, 81 representative articles were included according to their titles and abstracts. In this review, we also introduced relevant experience about the aforementioned procedures from the Department of Plastic Surgery and Tissue Regeneration and Molecular Cell Engineering Lab of University of Texas, MD Anderson Cancer Center, USA.
RESULTS AND CONCLUSION: The widely dispersed fat tissues potentially provide abundant stem cells for tissue engineering and regenerative medicine. Liposuction is a mini-invasive approach for harvesting fat tissues. Collagenase digestion is the major method for ASCs isolation due to its simplicity and high yield in basic research. However, clinical fat transplantation without ASCs isolation or non-collagenase isolation of stromal vascular fraction or ASCs is preferred. The phenotype, proliferation and differentiation capacity of ASCs may be affected by several factors during the fat tissue harvesting and ASCs isolation. Therefore, a standard protocol for ASCs isolation is needed.

陈犹白，陈聪慧，Qixu Zhang，韩岩. 脂肪干细胞分离、纯化和保存：研究进展与未来方向[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1508-1520.

Chen You-bai, Chen Cong-hui, Qixu Zhang, Han Yan. Isolation, purification and preservation of adipose-derived stem cells: research progress and future development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1508-1520.

图/表（结果） 4

2.1 脂肪组织的获取

2.1.1 人脂肪组织的获取实验室通过收集手术切除和吸脂术后的废弃的脂肪组织，其中吸脂术主要采用机械负压吸引(750 mm Hg真空+100%负压)、Coleman法(10 mL注射器+3 mm钝针+人工负压吸引)以及Cytori(后文详细介绍)3种方法。获取的脂肪存于冰盒中从手术室运至实验室，直接进行消化分离。

2.1.2 大鼠脂肪组织的提取 CO₂处死大鼠后备皮，浸入体积分数为75%乙醇中消毒10 min，超净台中无菌条件下于腹部做十字切口，皮下游离至腹股沟，将腹部和腹股沟处皮下脂肪剪下放入50 mL离心管，加入PBS，放入冰盒，运至实验室直接进行消化分离。尽量加快取材速度，避免大鼠死亡时间过长影响脂肪质量。

2.2 脂肪取材中影响脂肪干细胞的主要因素

2.2.1 供体年龄 Schipper等^[9]认为年轻人的脂肪干细胞产量、增殖速度和分化能力均优于老年人。Alt等^[10]从基因水平证实了随着年龄的增长，脂肪干细胞的衰老基因表达增加，而负责调节细胞周期、凋亡和分化的miRNA表达和细胞维持内稳态的能力降低。Shi等^[11]和Zhu等^[12]的研究显示年龄并不影响脂肪干细胞的增殖和分化能力。Aust等^[13]的研究表明脂肪干细胞的衰老和年龄无关。Mojallal等^[14]的研究证实脂肪

干细胞的产量和增殖能力和年龄无关(表1)。

2.2.2 供者性别 Aksu等^[15]认为男性的脂肪干细胞分化能力强于女性。而Ogawa等^[16]认为雌性小鼠的成脂能力优于雄性，可能与雌激素促进成脂作用有关。

有研究显示女性的脂肪干细胞生长速度快，死亡率低，且有更强的向肌细胞分化潜能，其旁泌血管内皮生长因子和肝细胞生长因子的能力也较强。

2.2.3 供者健康状态 ①体质量指数：Aust等^[13]认为脂肪干细胞的衰老倾向和供者的体质量指数成负相关。Mojallal等^[14]则认为脂肪干细胞的产量和增殖能力和体质量指数无关。van Harmelen等^[17]认为肥胖人群的脂肪干细胞分化能力较低，可能不适合作为细胞治疗的理想供体。②糖尿病：糖尿病大鼠来源的脂肪干细胞和健康大鼠来源的脂肪干细胞在体外的增殖速度和生长曲线上并无明显差异，但脂肪干细胞处于高糖培养液中增殖能力降低。糖尿病大鼠来源的脂肪干细胞分泌更多的瘦素和脂连蛋白，因此推测糖尿病患者可能不适合作为脂肪干细胞的理想供体^[18]。③癌症：正常人的脂肪干细胞(Lonza,Poietics,USA)和从癌症患者提取的脂肪干细胞的增殖和分化能力并无明显差别。更为重要的是，部分学者认为乳腺癌患者自体脂肪移植重建乳房后，脂肪干细胞可能通过HGF/c-Met信号通路导致乳腺癌复发^[19]，此发现引起了较大争论，目前尚无足够证据证明脂肪干细胞的致瘤作用。

2.2.4 脂肪取材部位 Schipper等^[9]认为人前臂脂肪组织中的干细胞含量最多，而腹部皮下浅层脂肪来源的脂肪干细胞的生命力和抗凋亡能力最强。Van Harmelen等^[17]认为皮下脂肪来源的脂肪干细胞比内脏脂肪来源的脂肪干细胞增殖能力强。Oedayrajsingh-Varma等^[20]认为腹部、臀部和乳房的脂肪干细胞产量无明显差异。Faustini等^[21]则认为男性的腹部脂肪干细胞产量高于背部和膝盖。Macotela等^[22]、Hauner等^[23]认为皮下脂肪来源的脂肪干细胞分化成脂能力优于内脏和大腿脂肪来源的脂肪干细胞。Toyoda等^[24]认为腹部皮下脂肪和腹腔大网膜脂肪来源的脂肪干细胞增殖能力没有明显差异，但是前者具有更强的分化能力。Cawthorn等^[25]认为内脏脂肪来源的脂肪干细胞的成脂能力强于皮下脂肪来源的脂肪干细胞，但是增殖能力则较弱。Jurgens等^[26]认为腹部脂肪提取的脂肪干细胞产量比侧腹、臀部、大腿等部位高，但其增殖能力和分化成骨和软骨能力没有差异。Fraser等^[27]的研究显示侧腹的脂肪干细胞产量高于腹部。Prunet-Marcassus等^[28]认为腹股沟脂肪组织分离的基质血管成分的分化和增殖能力较强。Jacob等认为皮下深层脂肪来源的脂肪干细胞可能更适合作为细胞疗法的脂肪供区。Sinno等^[29]回顾分析了相关脂肪移植的相关文章，发现不同部位的脂肪活性无明显差异(循证等级Ⅳ)。

课题组对比了腹部、侧腹和腋窝的基质血管成分和脂肪干细胞产量，发现腹部的基质血管成分产量明显高于侧腹和腋窝，但是3者的脂肪干细胞产量无显著差异^[30]，见表2，3。

2.2.5 取材方法吸脂术损伤较小，并发症发生率不到1%，是目前获取脂肪的主要方法。Vallee等^[31]认为吸脂术获得的脂肪有更好的成脂分化能力。多位学者的研究表明吸脂术本身并不会影响分离的基质血管成分细胞的活性。但是Oedayrajsingh-Varma等^[20]认为超声可能会使脂肪干细胞的产量减少，并降低脂肪干细胞的增殖能力。也有研究显示吸脂针粗细和医生的力量会影响脂肪颗粒的大小，进而影响脂肪干细胞的分离程度和产量。Faustini等^[21]认为手术切除法和吸脂术提取的基质血管成分细胞和脂肪干细胞产量相等。Schreml等^[32]研究则表明手术切除法获得的脂肪提取的基质血管成分细胞数要高于吸脂术，但是两种方法获得的脂肪干细胞量相同。Pu等^[33]认为Coleman法提取的脂肪细胞多于吸脂术。Aya等使用MicroAire助力抽脂机和钝针(30 cm×3 mm)吸脂，所得脂肪干细胞的表型、增殖和分化能力、衰老比例与切除法相比未见明显差异。Sinno等^[29]认为注射器吸脂和真空泵负压吸引，获得脂肪干细胞的活性无明显差异。吸脂术中的麻醉肿胀液也可能对脂肪干细胞有一定的影响。Keck等^[34]认为局麻药对脂肪细胞的活性、提取数量和分化成脂能力均有较大影响。国内学者的研究显示以利多卡因、罗哌卡因或布比卡因为主要成分的麻醉肿胀液对脂肪干细胞具有一定毒性，主要表现为抑制增殖，但不影响其成脂分化能力。因此需PBS彻底洗净局麻药，而以Gino为代表的一些学者则认为无需洗涤脂肪，Sinno等^[29]近来的研究显示利多卡因可能是抑制脂肪干细胞的主要因素，但没有客观数据证实局麻药和注射前清洗对脂肪移植的存活率有影响。

课题组对比了手术切除、Coleman法和普通吸脂术提取脂肪组织的基质血管成分和脂肪干细胞数量，发现手术切除法获得的脂肪组织分离的基质血管成分和脂肪干细胞最多，Coleman法其次^[30]。作者认为这可能与不同的脂肪取材方法获得的脂肪组织密度不同有关，Coleman法比普通吸脂术获得的脂肪更黏稠，而手术切除的脂肪则是纯固态，可以合理的推测同等体积的脂肪组织中，手术切除法的脂肪密度更高，因此可以提取更多的基质血管成分细胞和脂肪干细胞(表4)。值得注意的是，脂肪提取后的放置时间和温度等也有可能影响分离的脂肪干细胞的质量和数量，所以提取后需尽早进行分离，如条件不允许则低温冻存。

2.3 脂肪干细胞的分离目前主流的脂肪干细胞分离方法仍是胶原酶消化法，Eom等^[35]认为胶原酶消化法可更充分的发挥脂肪干细胞的贴壁特性，但需在取材8 h内消化。Reshak等研究表明利用0.075%Ⅰ型胶原酶在37 ℃下振荡消化1 h，是分离人脂肪干细胞的最好方法。各实验室的胶原酶消化法大同小异，现将作者所在实验室方法概括如下。

2.3.1 人脂肪干细胞的分离将吸脂术收集的脂肪用PBS冲洗，每5 mL脂肪分装入50 mL离心管，以 1︰2的比例加入10 mL 0.075%的Ⅰ型胶原蛋白酶，放入37 ℃恒温摇床以80 r/min的摇速消化1 h。加入与胶原等量的细胞培养液10 mL以中和胶原酶。细胞培养液由基础培养液、体积分数为10%胎牛血清和1%的青霉素链霉素谷氨酰胺构成。4 ℃下400×g离心10 min，弃上清后获得的细胞沉淀即基质血管成分。基质血管成分中脂肪干细胞约占10%^[36]，此外还包括脂肪前体细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、

造血干细胞、白细胞、内皮祖细胞、红细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等^[37]。细胞培养液重悬，经过70 μm的细胞筛过滤至新的50 mL离心管，4 ℃下400×g离心10 min，弃上清。用1mL 10%的红细胞裂解液重悬(每5 mL脂肪用1 mL红细胞裂解液)，室温孵育5 min，加入PBS，4 ℃下400×g离心 10 min，弃上清。细胞培养液重悬，取出10 μL悬液，加入30 μL锥虫蓝染色，镜下细胞计数。根据实验目的和需要细胞的时间不同，以不同的密度接种于培养瓶中。在培养瓶上标记细胞类型、代数、时间等，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂、95%湿度条件的温箱培养。脂肪干细胞获得的具体数量和脂肪取材方法、抽脂部位、细胞分离方法等密切相关，不同学者的研究结果差异较大。Brian等研究显示每毫升吸脂术提取的脂肪组织可分离出5×10³个脂肪干细胞。有学者认为每毫升脂肪可获得(0.7-2.0)×10⁶个脂肪干细胞。有学者认为每克脂肪可获得(2.0-2.9)×10⁵个细胞，而每毫升抽脂物可获得4×10⁵个细胞。

2.3.2 大鼠脂肪干细胞的分离将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管，其余步骤与人脂肪干细胞的分离一致(图1)。根据作者的观察，经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织消化后原代培养24 h，肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜，轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落，镜下观察发现大部分细胞都附着于这层膜上，通过吸脂术获取的人脂肪组织消化后则无此现象。增加胶原酶的量和消化时间也无法避免，作者推测这可能是取材时的毛细血管或脂肪间结缔组织未被完全消化，穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。胶原蛋白酶虽然可以特异性水解胶原蛋白的三维螺旋结构，但不会损伤其他蛋白质。处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶消化5 min。然后利用40 μm的细胞筛过滤后传代。根据作者的经验，每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×10⁶个。原代培养2.24×10⁷个大鼠基质血管成分细胞，40 h后传代时约剩余6.2×10⁶个细胞，细胞剩余率27%。

2.3.3 其他分离方法目前胶原酶消化法的主要问题是缺乏统一的标准，各实验室使用的酶的类型、浓度、消化时间不完全一致，比如酶的浓度从0.75 g/L至2.5 g/L不等，消化时间从0.5 h至3 h不等，可能导致分离后的脂肪干细胞表型、增殖和分化能力有一定的差异^[38-39]。有学者利用胰蛋白酶代替胶原蛋白酶消化脂肪，认为胰蛋白酶对细胞的损伤更小，获得的细胞稳定性更高，但是其缺点是产量较低。开发优质生产规范的非动物来源的胶原酶(如Celase等)以减少异种蛋白的污染是酶消化法的研究方向。Carvalho等曾使用临床级的无异种蛋白酶消化脂肪组织，证实获得的干细胞活性和功能与普通胶原酶无明显差别。

除了酶消化法外，还有组织块贴壁法、吸附柱法、直接离心法、机械振荡法、胎牛血清法等^[40-45]，上述方法的共同优点是分离过程中不使用胶原酶，避免了异种污染，但通病是消化时间长，干细胞产量低。Priya等^[41]将脂肪剪成组织块后贴壁培养，但操作中很难保证组织块全部贴壁，换液时容易漂浮。Doi等^[43]设计了一个网格直径为100 μm的吸附柱，将吸脂术的液体通过吸附柱时，贴壁细胞被吸附至柱中，再冲洗出细胞进行培养，但仅适用于抽脂术的液体成分，且细胞提取率不高。有学者对比了几种主要分离方法，认为机械振荡法分离的脂肪干细胞活性要高于酶消化法^[44]。Swenn等研究表明机械法对脂肪干细胞的分化能力无影响，且分离的脂肪干细胞生长速度更快。Zeng等^[45]研究利用体积分数为100%的胎牛血清代替胶原酶和胰蛋白酶来消化脂肪组织，但消化耗时长达3 d。

除了人工分离方法外，目前市场上还有几种商业化的脂肪干细胞自动分离系统，例如Cytori公司的Celution^®系统、Tissue Genesis公司的Icellator^®系统以及Medi-Khan公司的Maxstem^®系统等。以作者所在科室较常用的Cytori为例，将分离时间缩短至1.0-2.0 h内，获得的基质血管成分可以直接应用于患者，目前经过临床试验，被FDA批准用于治疗慢性心衰、急性心肌梗死和乳腺癌术后乳房重建等，以治疗硬皮病、骨关节炎、热灼伤和辐射伤、尿失禁等为目的一系列临床试验正在开展之中。

2.4 脂肪干细胞分离中的主要影响因素

2.4.1 离心 Kurita等^[46]的研究显示吸脂术配合离心提取的脂肪细胞和脂肪干细胞量均高于单纯吸脂术。Yoshimura等^[47]认为过度离心会破坏脂肪干细胞，1 200 r/min为最佳离心力，能获得最高产量。离心机有×g和r/min两个单位，其换算公式为：

RCF or G-force= 1.12×R×(RPM/1000)²

其中R为离心机转轴中心和离心管中心的距离，即离心半径。课题组研究显示离心后基质血管成分细胞量更多，而对脂肪干细胞没有影响。

2.4.2 种植密度接种密度低，细胞形成克隆慢，培养时间长，但可避免细胞克隆间的相互作用^[48]。接种密度大，形成克隆快，传代间隔短。Krähenbühl等^[49]将2-4代的脂肪干细胞以每平方厘米325/750/ 1 500/3 000的密度种植后，发现细胞增殖无明显差异，但高密度种植可以更快获得足够的细胞。

2.4.3 培养液 ①基础培养液：脂肪干细胞的基础培养液一般是Minimum Essential Media(MEM)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM), RPMI-1640或DMEM:F12等。不同类型的基础培养液对脂肪干细胞的增殖和分化可能有一定影响^[50]。Lee等^[51]认为L-DMEM比α-MEM更适合培养脂肪干细胞。②血清：血清体积分数对脂肪干细胞的分化也有影响，体积分数为10%左右的血清最宜，过低则缺乏营养和生长因子的刺激，细胞的增殖缓慢；而过高易引起细胞早衰^[52]。Bunnell等^[53]认为体积分数为25%的血清可能促使脂肪干细胞向脂肪细胞分化，而低氧低血清可增加脂肪干细胞的凋亡。有学者认为高体积分数的血清通过增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达从而促进脂肪干细胞的成脂分化，也有学者认为高体积分数的血清中过高浓度的生长因子可能降低脂肪干细胞的分化能力，无血清的培养基对脂肪干细胞的成脂分化没有影响。有研究显示含体积分数2%血清的MesenPRO RS培养液比普通培养液更适合用于成脂分化诱导。异种血清可能引起感染和免疫反应等，因此在临床试验中人血清是胎牛血清的一种替代品，例如AB血清、凝血酶激活的富血小板血浆、人血小板裂解物等。Chieregato等^[54]发现含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子的3%人血小板血浆的培养液能够取代胎牛血清用于脂肪干细胞的培养，且具有更好的促进干细胞体外生长的作用。Tunaitis等^[55]对比了添加胎牛血清、预处理的胎牛血清、人同种异体血清和人造血清4种不同成分的培养液，发现人造血清中培养的脂肪干细胞增殖和分化能力更好。然而人造血清来源有限，且不同批次间的差异是限制其大规模生产应用的主要障碍。无血清培养基是未来细胞培养的发展方向，Dromard等^[56]将脂肪干细胞作为浮动的球体培养在无血清培养基中，显示其仍能维持较好的分化能力。目前仍需要大量实验来验证无血清培养液的标准配方及其安全性和有效性。③糖浓度：Mischen等^[57]的研究表明低糖环境更利于维持脂肪干细胞的多分化潜能，这也解释了糖尿病患者的脂肪干细胞分化能力降低的原因，而是否添加抗生素对脂肪干细胞的细胞表型和分化能力无影响。有研究显示高糖培养液可以促进干细胞向软骨细胞等方向分化，其原因是高糖培养减少了因缺氧引起的细胞凋亡，并抑制了细胞有氧呼吸。Krähenbühl等^[49]对比了几种不同的培养液，发现89%DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1%l-glut的培养液可以为不同代数的细胞提供最稳定的环境。④pH值：有研究显示7.2是最适合脂肪干细胞生长增殖的pH值。

2.5 脂肪干细胞的纯化和培养

2.5.1 脂肪干细胞的纯化如上文所述，基质血管成分中脂肪干细胞仅占10%左右，如果把未经纯化的基质血管成分细胞作为脂肪干细胞研究，可能对细胞表型、增殖和分化等一系列研究结果产生混淆，因此需对脂肪干细胞进行纯化。一般利用脂肪干细胞的贴壁特性进行纯化，Zuk等^[58]认为脂肪干细胞接种后4 h贴壁，24 h完成贴壁。根据观察，基质血管成分接种后1 h内即可见细胞开始贴壁，24 h内贴壁完成。除了脂肪干细胞和成纤维细胞等外，基质血管成分中其余大多数细胞漂浮在培养液中，无法贴壁。但是贴壁后的细胞形态均为梭形，因此无法通过形态区分脂肪干细胞^[59]。有学者认为原代培养48 h后，所有贴壁的活细胞均为脂肪干细胞^[60]。

实验室通过传代完成脂肪干细胞的纯化，具体过程为：在细胞融合达70%-80%时弃培养液，PBS漂洗2次，每次10 min，弃PBS，培养瓶中加入胰蛋白酶+EDTA，37 ℃下反应5 min，吸管反复吹打，镜下确认细胞完全漂浮和分离，加入等量的细胞培养液中和胰蛋白酶，转移至离心管，4 ℃下1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞培养液重悬细胞沉淀，细胞计数后接种于新的培养瓶内。第一次漂洗非常重要，因为不同的细胞所需的贴壁时间不同，所以早期漂洗可以显著降低细胞的异质性。传代比例按照所需的细胞数量和时间计算，从1︰2至1︰4不等。

除此之外，还可利用流式细胞术、免疫磁珠分选法和密度梯度离心等其他纯化方法^[61]。免疫磁珠分选法的原理是基于细胞表面抗原与磁珠上的特异性单抗结合，当细胞悬液通过磁场时，与磁珠相结合的细胞被吸引滞留在磁场中，其重点在于磁珠上抗体的选择，若只用单一特异性标记物可能造成其他脂肪干细胞亚群的丢失。由于脂肪干细胞的特异性标记物目前仍没有定论，所以此方法筛选脂肪干细胞有一定的局限性。此外筛选出的细胞具有人工修饰的非自身的免疫球蛋白片段，进行细胞移植时可能会引发一系列免疫反应，产生活性氧，引起炎症反应，降低脂肪干细胞的修复能力。Gierloff等^[62]使用免疫磁珠法从培养的大鼠脂肪干细胞中纯化出CD29⁺/CD71⁺/CD73⁺/ CD90⁺的脂肪干细胞亚群，并证明均有分化成脂能力，且CD29⁺亚群的成脂能力较强。密度梯度离心法是根据不同颗粒之间的沉降系数不同，在一定离心力的作用下，不同颗粒以不同速度沉降，在密度梯度不同区域形成区带，从而分离不同密度的细胞。有学者采用此法分离了负压抽脂的猪皮下脂肪50 g，可获得(2.1-2.7)×10⁶个脂肪干细胞。此法的重点在于介质及其最佳密度的选择上，目前常用的离心介质包括聚蔗糖和经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液。一些研究证明不同介质、不同密度的同一介质体外分离纯化骨髓干细胞的产量、活性、表型不同^[63]，但是对脂肪干细胞的影响尚缺少研究。

2.5.2 脂肪干细胞的培养 Zuk等^[58]研究表明脂肪干细胞原代培养24-48 h细胞生长停滞，48 h后细胞有触角伸出，呈纤维细胞样的短梭形，五六天后细胞呈集落样生长，有克隆形成。根据作者观察，脂肪干细胞传代后24 h内增殖速度较慢，细胞多独立贴壁生长，48-72 h是增殖速度最快的阶段，细胞呈梭形伸展，生长有方向性，3-5 d后生长显著加快，与其他学者的研究结果基本一致。脂肪干细胞的倍增时间与细胞活力、种植密度和培养条件等密切相关，平均为30-60 h^[64]。

在脂肪干细胞的培养中最关键的是防止污染。一般用T25或T75的无菌培养瓶培养脂肪干细胞，从温箱取出后立即转移入通风柜，注意减少脂肪干细胞的暴露时间，操作前后乙醇消毒。注意观察培养液，若出现浑浊或絮状物，则很有可能是发生了污染。通过观察培养液还可以判断是否需要换液，因为培养液的颜色具有酸碱依赖性，正常时为淡粉红色，如果长时间未换液则逐渐变为黄色。通过显微镜观察细胞的形态可判断细胞生长状态，如果细胞核周围出现结节，胞质形成空泡，细胞壁破损或不连续，细胞从培养瓶壁上脱落等，可能提示培养液中营养缺乏、有毒或微生物污染等。

2.5.3 代数对脂肪干细胞的影响脂肪干细胞的抗衰老能力较强，1代时没有出现衰老迹象，10代后衰老细胞少于5%，15代时低于15%。脂肪干细胞的细胞活力可保持到第10代，此时其增殖速度达到高峰，而其分化能力却逐渐降低，所以第10代细胞是脂肪干细胞各项功能的临界点，15-20代之间细胞抗原的表达最显著^[65]。Wan等^[66]研究显示10代之后的脂肪干细胞逐渐衰老，不适合作为细胞疗法临床应用。Wall等认为随着代数增加，脂肪干细胞的生长速度下降。Kocaoemer等^[67]认为从第4代开始脂肪干细胞的生长能力逐渐降低，Krähenbühl等认为脂肪干细胞在4-6代时生长放缓，外形变大，6代以上则更为明显。Zhu等认为不同代数的脂肪干细胞增殖能力没有明显差别。作者所在实验室使用的脂肪干细胞大多是1-4代。

2.6 脂肪组织和脂肪干细胞的保存

2.6.1 脂肪组织的冻存 Matsumoto等^[68]的研究表明将脂肪组织存于4 ℃ 3 d或室温下24 h，不影响脂肪干细胞的细胞形态、数量和活性，但是室温储存时间过长脂肪细胞会逐渐变性和破裂。Chaput等^[69]的研究证实吸脂术提取脂肪冷冻7 d后注射到小鼠体内，其脂肪移植效果和吸收率与新鲜脂肪无明显差异。Choudhery等^[70]认为吸脂术获得的脂肪冻存1个月以内，其表面标记物、增殖和分化能力无变化。Erol等^[71]的研究将吸脂术提取物冻存3-6个月后用于面部注射，相比新鲜提取的脂肪，医生和患者的满意度未见差别。Atik等^[72]研究显示小鼠腹股沟区的脂肪冻存6个月后的活性与新鲜脂肪无差异。Sean等对比了不同年龄患者(26-62岁)和不同冻存时间(2-1 159 d)的脂肪组织融化后提取的脂肪干细胞活性和数量，发现冻存1年以内的脂肪组织中分离的活细胞数量明显多于冻存2年以上的脂肪组织，但冻存并不影响脂肪干细胞的增殖能力和细胞表型。作者建议在脂肪取材后尽量早期分离脂肪干细胞，一般不超过24 h，最好不超过8 h，避免污染以及脂肪细胞的死亡等。

2.6.2 脂肪干细胞的冻存程序降温1.0-2.0 ℃/min并应用防冻剂是最佳的冻存方法，脂肪干细胞可以耐受长期的低温冻存，复苏后存活率高，对增殖和分化能力无明显影响^[73-74]。Krähenbühl等研究表明将脂肪干细胞冻存于-80 ℃14 d后，细胞活性仍然维持在97%。Gonda等^[75]研究显示脂肪干细胞在-196 ℃的条件下保存6个月而不影响细胞的增殖和分化能力。Dariolli等^[76]研究表明猪脂肪干细胞冻存3-12个月后，其表面标记物、扩增时间、衰老标记物以及染色体异常等方面均未发生明显改变。

作者所在实验室同样采用慢冻快融的方法冻存和解冻脂肪干细胞，具体过程：胰蛋白酶-EDTA将脂肪干细胞收获后离心，与传代步骤相同，重悬时加入1.0-2.0 mL的10%二甲基亚砜+90%细胞培养液(内含体积分数为10%的胎牛血清)中，保证每毫升有(1.0-2.0)×10⁵个细胞，每1 mL分装入冰冻管，放入盛有异丙醇的盒子再放入-80 ℃冰箱或液氮中，这样可以保证冷冻速度较慢，大约每分钟下降1 ℃。融化时直接取冷冻管放入37 ℃水浴箱中。部分学者的研究显示胚胎干细胞解冻后的增殖速度明显放缓，作者在脂肪干细胞中尚未见到此现象。

冻存中最关键的步骤是选择最合适的防冻剂及其浓度，以减少细胞冻伤^[77]。今后的发展方向是发明更好的防冻剂，例如无二甲基亚砜、无血清的防冻剂等，并逐步优化和标准化脂肪和脂肪干细胞的冻存标准^[78-80]。Kar等对比了0.25 mol/L海藻糖、5%二甲基亚砜、10%二甲基亚砜、5%二甲基亚砜+体积分数为20%胎牛血清、10%二甲基亚砜+体积分数为20%胎牛血清以及目前标准的10%二甲基亚砜+体积分数为90%胎牛血清冻存脂肪干细胞后，发现仅用5%二甲基亚砜不添加胎牛血清冻存脂肪干细胞，细胞的表型、增殖和分化能力也没有明显改变，并且增强了其干性标记物如NANOG、OCT-4、SOX-2和REX-1的表达水平，其研究结果提示了利用无异种血清的防冻剂冻存积累大量的脂肪干细胞，构建细胞银行，有利于更好的开展脂肪干细胞的临床应用^[81]。

周细胞、成纤维细胞、

参考文献

[1] Zuk PA. The adipose-derived stem cell: looking back and looking ahead. Mol Biol Cell. 2010;21(11): 1783-1787.

[2] Becker AJ, Mcculloch EA, Till JE. Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature. 1963;197:452-454.

[3] Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 1968;6(2):230-247.

[4] Prindull G, Prindull B, Meulen N. Haematopoietic stem cells (CFUc) in human cord blood. Acta Paediatr Scand. 1978;67(4):413-416.

[5] Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 1992;255(5052): 1707-1710.

[6] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-228.

[7] Shore EM, Ahn J, Jan de Beur S, et al. Paternally inherited inactivating mutations of the GNAS1 gene in progressive osseous heteroplasia. N Engl J Med. 2002;346(2):99-106.

[8] 吴尉,梁芳,宋小琴,等.人脂肪干细胞的提取和鉴定[J].中国组织工程研究,2015,19(28):4498-4502.

[9] Schipper BM, Marra KG, Zhang W, et al. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 2008; 60(5):538-544.

[10] Alt EU, Senst C, Murthy SN, et al. Aging alters tissue resident mesenchymal stem cell properties.Stem Cell Res. 2012;8(2):215-225.

[11] Shi Y, Niedzinski JR, Samaniego A, et al. Adipose-derived stem cells combined with a demineralized cancellous bone substrate for bone regeneration. Tissue Eng Part A. 2012;18(13-14): 1313-1321.

[12] Zhu M, Kohan E, Bradley J, et al. The effect of age on osteogenic, adipogenic and proliferative potential of female adipose-derived stem cells. J Tissue Eng Regen Med. 2009;3(4):290-301.

[13] Aust L, Devlin B, Foster SJ, et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 2004;6(1):7-14.

[14] Mojallal A, Lequeux C, Shipkov C, et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plast Surg. 2011;35(6):1097-1105.

[15] Aksu AE, Rubin JP, Dudas JR, et al. Role of gender and anatomical region on induction of osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 2008;60(3):306-322.

[16] Ogawa R, Mizuno H, Watanabe A, et al. Adipogenic differentiation by adipose-derived stem cells harvested from GFP transgenic mice-including relationship of sex differences. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 319(2):511-517.

[17] van Harmelen V, Skurk T, Röhrig K, et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. Int J Obes Relat Metab Disord. 2003; 27(8):889-895.

[18] Cianfarani F, Toietta G, Di Rocco G, et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing.Wound Repair Regen. 2013;21(4):545-553.

[19] Eterno V, Zambelli A, Pavesi L, et al. Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells (ASCs) may favour breast cancer recurrence via HGF/c-Met signaling. Oncotarget. 2014;5(3):613-633.

[20] Oedayrajsingh-Varma MJ, van Ham SM, Knippenberg M, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 2006;8(2): 166-177.

[21] Faustini M, Bucco M, Chlapanidas T, et al. Nonexpanded mesenchymal stem cells for regenerative medicine: yield in stromal vascular fraction from adipose tissues.Tissue Eng Part C Methods. 2010;16(6):1515-1521.

[22] Macotela Y, Boucher J, Tran TT, et al. Sex and depot differences in adipocyte insulin sensitivity and glucose metabolism. Diabetes. 2009;58(4):803-812.

[23] Hauner H, Entenmann G. Regional variation of adipose differentiation in cultured stromal-vascular cells from the abdominal and femoral adipose tissue of obese women. Int J Obes. 1991;15(2):121-126.

[24] Toyoda M, Matsubara Y, Lin K, et al. Characterization and comparison of adipose tissue-derived cells from human subcutaneous and omental adipose tissues. Cell Biochem Funct. 2009;27(7):440-447.

[25] Cawthorn WP, Scheller EL, MacDougald OA. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. J Lipid Res. 2012;53(2): 227-246.

[26] Jurgens WJ, Oedayrajsingh-Varma MJ, Helder MN, et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell Tissue Res. 2008;332(3): 415-426.

[27] Fraser J, Wulur I, Alfonso Z, et al. Differences in stem and progenitor cell yield in different subcutaneous adipose tissue depots. Cytotherapy. 2007;9(5): 459-467.

[28] Prunet-Marcassus B, Cousin B, Caton D, et al. From heterogeneity to plasticity in adipose tissues: site-specific differences. Exp Cell Res. 2006;312(6):727-736.

[29] Sinno S, Wilson S, Brownstone N, et al. Current Thoughts on Fat Grafting: Using the Evidence to Determine Fact or Fiction. Plast Reconstr Surg. 2016; 137(3):818-824.

[30] Iyyanki T, Hubenak J, Liu J, et al. Harvesting technique affects adipose-derived stem cell yield. Aesthet Surg J. 2015;35(4):467-476.

[31] Vallée M, Côté JF, Fradette J. Adipose-tissue engineering: taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathol Biol (Paris). 2009;57(4):309-317.

[32] Schreml S, Babilas P, Fruth S, et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 2009;11(7):947-957.

[33] Pu LL, Coleman SR, Cui X, et al. Autologous fat grafts harvested and refined by the Coleman technique: a comparative study. Plast Reconstr Surg. 2008;122(3): 932-937.

[34] Keck M, Zeyda M, Gollinger K, et al. Local anesthetics have a major impact on viability of preadipocytes and their differentiation into adipocytes. Plast Reconstr Surg. 2010;126(5):1500-1505.

[35] Eom YW, Lee JE, Yang MS, et al. Rapid isolation of adipose tissue-derived stem cells by the storage of lipoaspirates. Yonsei Med J. 2011;52(6):999-1007.

[36] 肖建红,张阳春,张常然,等. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2015,19(32):5155-5161.

[37] Locke M, Windsor J, Dunbar PR. Human adipose- derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. ANZ J Surg. 2009;79(4): 235-244.

[38] Gimble JM, Bunnell BA, Frazier T, et al. Adipose- derived stromal/stem cells: a primer. Organogenesis. 2013;9(1):3-10.

[39] 赵娜.脂肪干细胞诱导分化的现状及前景[J].中国组织工程研究, 2015,19(6):969-974.

[40] 刘琴,王丽平,喻晶,等.组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014,18(1):88-93.

[41] Priya N, Sarcar S, Majumdar AS, et al. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. J Tissue Eng Regen Med. 2014;8(9):706-716.

[42] Jing W, Xiao J, Xiong Z, et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artif Organs. 2011;35(2): 105-112.

[43] Doi K, Kuno S, Kobayashi A, et al. Enrichment isolation of adipose-derived stem/stromal cells from the liquid portion of liposuction aspirates with the use of an adherent column. Cytotherapy. 2014;16(3):381-391.

[44] Markarian CF, Frey GZ, Silveira MD, et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnol Lett. 2014;36(4): 693-702.

[45] Zeng G, Lai K, Li J, et al. A rapid and efficient method for primary culture of human adipose-derived stem cells. Organogenesis. 2013;9(4):287-295.

[46] Kurita M, Matsumoto D, Shigeura T, et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 2008;121(3): 1033-1041.

[47] Yoshimura K, Shigeura T, Matsumoto D, et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 2006;208(1):64-76.

[48] 张鉴清,季佳霖,崔新明,等.小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定[J].中国组织工程研究, 2014,18(28):4535- 4541.

[49] Krähenbühl SM, Grognuz A, Michetti M, et al. Enhancement of Human Adipose-Derived Stem Cell Expansion and Stability for Clinical use. Int J Stem Cell Res Ther. 2015.

[50] 依里牙尔•依里哈木,王云海,王理,等.脂肪干细胞体外分离培养鉴定及免疫学性质[J].中国组织工程研究, 2014, 18(14):2167-2172.

[51] Lee RH, Kim B, Choi I, et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 2004;14(4-6):311-324.

[52] Strem BM, Hicok KC, Zhu M, et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 2005;54(3):132-141.

[53] Bunnell BA, Flaat M, Gagliardi C, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 2008;45(2):115-120.

[54] Chieregato K, Castegnaro S, Madeo D, et al. Epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor-bb can substitute for fetal bovine serum and compete with human platelet-rich plasma in the ex vivo expansion of mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue. Cytotherapy. 2011;13(8):933-943.

[55] Tunaitis V, Borutinskait? V, Navakauskien? R, et al. Effects of different sera on adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. J Tissue Eng Regen Med. 2011;5(9):733-746.

[56] Dromard C, Bourin P, André M, et al. Human adipose derived stroma/stem cells grow in serum-free medium as floating spheres. Exp Cell Res. 2011;317(6): 770-780.

[57] Mischen BT, Follmar KE, Moyer KE, et al. Metabolic and functional characterization of human adipose-derived stem cells in tissue engineering. Plast Reconstr Surg. 2008;122(3):725-738.

[58] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12):4279-4295.

[59] 侯晓琳,郁卫东,崔梅花,等.小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢[J].中国组织工程研究, 2015,19(6): 854-860.

[60] 刘子琪,孙同文,万有栋,等脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化[J].中国组织工程研究, 2015,19(32):5182-5187.

[61] Francis MP, Sachs PC, Elmore LW, et al. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 2010;6(1):11-14.

[62] Gierloff M, Petersen L, Oberg HH, et al. Adipogenic differentiation potential of rat adipose tissue-derived subpopulations of stromal cells. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2014;67(10):1427-1435.

[63] Jiang A, Li M, Duan W, et al. Improvement of the survival of human autologous fat transplantation by adipose-derived stem-cells-assisted lipotransfer combined with bFGF. ScientificWorldJournal. 2015; 2015:968057.

[64] 曹菁,姜南,徐扬阳,等.人脂肪干细胞促进小鼠随意型皮瓣血管的新生[J].中国组织工程研究,2014,18(19):2993- 2998.

[65] Yu G, Wu X, Dietrich MA, et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 2010;12(4):538-546.

[66] Wan Safwani WK, Makpol S, Sathapan S, et al. The changes of stemness biomarkers expression in human adipose-derived stem cells during long-term manipulation. Biotechnol Appl Biochem. 2011;58(4): 261-270.

[67] Kocaoemer A, Kern S, Klüter H, et al. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 2007;25(5):1270-1278.

[68] Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 2007;120(6): 1510-1517.

[69] Chaput B, Orio J, Garrido I, et al. A clinical scalable cryopreservation method of adipose tissue for reconstructive surgery assessed by stromal vascular fraction and mice studies. Plast Reconstr Surg. 2014; 133(4):815-826.

[70] Choudhery MS, Badowski M, Muise A, et al. Cryopreservation of whole adipose tissue for future use in regenerative medicine. J Surg Res. 2014;187(1): 24-35.

[71] Erol OO, Agaoglu G. Facial rejuvenation with staged injections of cryopreserved fat and tissue cocktail: clinical outcomes in the past 10 years. Aesthet Surg J. 2013;33(5):639-653.

[72] Atik B, Oztürk G, Erdo?an E, et al. Comparison of techniques for long-term storage of fat grafts: an experimental study. Plast Reconstr Surg. 2006; 118(7): 1533-1537.

[73] 刘玉平,刘涛,王明明,等.人髌下脂肪垫来源脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定[J].中国组织工程研究, 2015, 19(41):6566-6571.

[74] 曹娜,裴路,张微.脂肪干细胞和生物支架应用于牙槽骨修复[J].中国组织工程研究, 2014, 18(1):137-142.

[75] Gonda K, Shigeura T, Sato T, et al. Preserved proliferative capacity and multipotency of human adipose-derived stem cells after long-term cryopreservation. Plast Reconstr Surg. 2008;121(2): 401-410.

[76] Dariolli R, Bassaneze V, Nakamuta JS, et al. Porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells retain their proliferative characteristics, senescence, karyotype and plasticity after long-term cryopreservation. PLoS One. 2013;8(7):e67939.

[77] 戴兵,徐海艇,金海东,等.低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响[J].中国组织工程研究, 2014,18(29):4630-4635.

[78] 张慧,郑红光,张德伟,等.雌激素影响冻存肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的成脂分化[J].中国组织工程研究, 2013, 17(27):4998-5004.

[79] 马洪斌,李运祥,王铭伦.腺病毒携带骨形态发生蛋白14基因转染脂肪干细胞修复损伤关节软骨[J].中国组织工程研究, 2015,19(1):54-60.

[80] 黄成龙,肖金刚.脂肪干细胞成骨分化及与复合支架结合:在修复骨质疏松症骨缺损中的应用[J].中国组织工程研究, 2014,18(41):6696-6702.

[81] Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. J Nippon Med Sch. 2009;76(2):56-66.

引言

干细胞是一类可自我复制，未分化且有分化潜能的多能细胞。根据其所处的发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。胚胎干细胞来自胚胎中的囊胚内细胞团，在体内及体外都展现出强大的分化潜能，但是出于伦理、法律、政治和安全性等多方面的考虑，其应用一直受到限制，成体干细胞则可以回避上述问题^[1]。 1963年，Becker等^[2]首次描述了小鼠骨髓中一种具有自我复制能力的细胞，即现在熟知的造血干细胞。1968年，Friedenstein等^[3]介绍了骨髓干细胞。1978年，Prindull等^[4]发现了脐血干细胞。1992年，Reynoid等^[5]在鼠纹状体中发现了神经干细胞。2001年，Zuk等^[6]从吸脂术抽出的脂肪中发现了脂肪干细胞，从而揭开了干细胞研究的新篇章。

脂肪来源于间充质，类似于骨髓拥有丰富的基质。脂肪组织中脂肪细胞占50%-70%，除此之外还有脂肪祖细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、血管平滑肌细胞、基质细胞、免疫细胞和造血干细胞等^[1-6]。人体将多余的能量储存在脂肪中，这个过程包括脂肪细胞体积的增大和数量的增加。此外，在狼疮、皮下脂肪坏死、Paget’s病、进行性骨发育异常等疾病中观察到脂肪组织中异位成骨，上述证据表明脂肪组织中存在具有多向分化能力的干细胞^[7]。关于脂肪组织中含有干细胞的原因目前有3种推测，第一种认为脂肪干细胞是通过循环系统迁移至脂肪组织的骨髓间充质干细胞，二者的相似性可以支持这种理论，但是二者的表型有一些差异。第二种认为脂肪干细胞本质上是成纤维细胞，因为二者的形态和生物学特性非常相似。第三种则认为脂肪干细胞是周细胞，因为在体内二者均集中于脂肪组织的血管周围，且周细胞也可以贴壁生长，并具有多向分化的能力。

近年来的研究证实，干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、大脑、神经嵴、皮肤、消化上皮、骨膜、骨骼肌、松质骨、血管、肝脏、胰腺、牙髓、毛囊、眼睑甚至羊水等各种组织中。相比其他来源的干细胞，脂肪干细胞的优点主要包括^[1-8]：①脂肪组织分布广泛，来源充足。②通过吸脂术可轻易获得脂肪，患者痛苦小，供区损伤低。③分离方法简单，产量高，脂肪干细胞的获取率为1%-2%，而骨髓干细胞仅有0.001%- 0.002%，脂肪干细胞是骨髓干细胞的1 000倍。④体外扩增能力强，易于传代培养。⑤具有跨胚层分化能力。⑥免疫排斥低等。近10年来脂肪干细胞一直是干细胞研究的热点，作者对脂肪组织的取材、脂肪干细胞的分离、传代和保存等方面的研究进展进行了综述，并报道了美国德克萨斯大学MD安德森肿瘤中心整形科和TRAMCEL实验室(Tissue Regeneration and Molecular Cell Engineering Lab)的相关经验，同时讨论了目前存在的问题和未来的研究方向。

材料方法

1.1 文献检索和筛选要求

1.1.1 检索数据库科学数据库：Medline，SinoMed。

1.1.2 选择理由各为英文和中文文献最全面的数据库。

1.1.3 检索途径、检索词和各检索词逻辑关系为全面、准确地检索出撰写该综述的相关文献，文章写作过程中综合考虑了检索途径的选择、检索词的选择和各检索词间逻辑关系的配置，制定了科学的检索策略。

检索途径：标题检索，标题是一篇文章的浓缩，用一句话高度概括了整个文章，最重要信息的都集中在标题中。

检索词：除ASCs之外，文献中脂肪干细胞曾有adipose (derived) adult/mesenchymal stem/stromal cells, lipoblast, pericyte, pre-adipocyte, processed lipoaspirate(PLA) cells等不同命名，为了避免繁杂的命名产生混淆，国际脂肪应用技术协会(International Fat Applied Technology Society, IFATS)达成一致用adipose-derived stem cells(ASCs)来表示脂肪干细胞^[1]，文章中也遵循这一规定。在Medline中以“adipose-derived stem cells”作为检索词，在SinoMed中以“脂肪干细胞”作为检索词。

检索词的逻辑组配：在Medline中以“(adipose stem cells[Title]) OR (adipose-derived stem cells[Title]) OR (adipose-derived mesenchymal stem cells[Title])”作为检索式进行检索。在SinoMed中以(“脂肪干细胞”[中文标题:智能])or(“脂肪间充质干细胞”[中文标题:智能])作为检索式进行检索。

检索途径、检索词、检索词的逻辑组配的确定理由：以标题检索的方式比较直接，可以快速获取相关性最高的文献。而由于脂肪干细胞的英文表述比较多，如果将所有用过的表述全都纳入检索词，则无关文献过多。近年来规范adipose-derived stem cells(ASCs)的命名，但是单纯以此检索可能遗漏之前的一些经典文献，例如Zuk等^[6]首次介绍脂肪干细胞，被引量最多的文献，因此首先阅读检索结果中的综述类文献，并从其参考文献中选择未检索到的相关经典文献。

检索的时间范围：于2015年9月10日进行检索，由于脂肪干细胞于2001年才被首次介绍，因此文献时间范围为2001至2016年。重点检索时间范围为近5年内，Medline中5年内共有文献1 269篇，其中综述82篇。SinoMed中5年内共有文献581篇，其中综述75篇。

1.1.4 文献筛选流程和筛选标准

文献筛选流程：按照图1的步骤进行。

文献筛选的标准：通过标题及摘要判断其主要内容与脂肪干细胞的分离、纯化、传代培养和冻存相关，根据被引次数，文献作者和所在期刊进行初选。

文献筛选标准的制定理由：在google scholar或百度学术中可以清楚的看到文献的被引次数，被引次数越高，证明文献工作认可度较高，这一方法较适用于经典文献。而对于新文献，一般结合文章作者和所在期刊决定，比如Zuk研究小组在脂肪干细胞方面的研究较早，多集中于脂肪干细胞的生物学特性方面，而Flynn小组和Zhang小组在脂肪干细胞结合脱细胞组织方面做了很多工作，因此通过文章作者可以快速筛选出最有价值的文献。此外，文献发表的期刊也可以辅助文献筛选，可选择在相关领域声誉较好的期刊，或通过Research Gate等网站查询期刊的影响因子。以干细胞研究为例，首选Cell Stem Cell，而组织工程方面，则以Biomaterial为优。在下载文献后，一般将其按照影响因子+期刊名称+发表年份+文章标题命名，这样文献的重要信息一目了然，便于筛选。

排除的文献：搜索结果共1 850篇，排除1 769篇，剩余81篇。

排除理由：①其他组织来源的干细胞。②脂肪干细胞分离、纯化、传代培养和冻存以外的其他方面，例如细胞表型、增殖和分化能力、临床应用等。

文献筛选结果的输出形式：文献检索和筛选结果的输出采用文献的引用形式(GB/T 7714)，且保持了格式的一致性，文献的引用形式包括作者、题名、期刊名称、发表年代、卷数(期数)、页码等。经筛选纳入评价的文献提供了全文。

脂肪干细胞分离、纯化和保存：研究进展与未来方向

Isolation, purification and preservation of adipose-derived stem cells: research progress and future development

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.