骨髓间充质干细胞移植改善糖尿病肾病大鼠血糖及尿总蛋白

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

糖尿病肾病：受到糖尿病高血糖、高血压及高血脂的影响，患者的肾小球微循环滤过压会出现异常上升，促进糖尿病肾病发生和发展，早期表现为蛋白尿、浮肿，晚期发生肾功能衰竭。

骨髓间充质干细胞治疗糖尿病肾病：①直接分化为受损伤的组织细胞。骨髓间充质干细胞可以再生为肾脏组织已经被用于实验性肾脏病模型。②旁分泌及内分泌机制。多项研究表明骨髓间充质干细胞不仅可以通过分泌多种生长因子和细胞因子抑制T细胞、B细胞反应及增生，而且对树突状细胞等抗原呈递细胞和NK细胞也有免疫抑制作用。因此，减轻炎症反应、调节肾组织微环境中细胞因子的分泌，可能是骨髓间充质干细胞促进肾脏细胞修复的重要机制。

背景：糖尿病肾病防治的基本措施包括有效控制血糖、控制血压、抑制肾素-血管紧张素系统和调脂治疗等，但往往无法获得理想的效果。

目的：探讨骨髓间充质干细胞移植糖尿病肾病大鼠的血糖及尿总蛋白改善情况。

方法：45只SD大鼠随机分为3组，每组15只，分别设为正常对照组、糖尿病肾病组和干细胞移植组。糖尿病肾病组和干细胞移植组一次性腹腔注射链脲佐菌素 60 mg/kg制备糖尿病肾病模型，正常对照组注射相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，造模后将2×10⁶(200 μL)骨髓间充质干细胞直接注射到干细胞移植组大鼠左心室，首次移植后7 d进行第2次移植。正常对照组和糖尿病肾病组心内注射相同剂量的无血清L-DMEM培养基。治疗后1，4，8周检测3组大鼠的尿总蛋白和血糖。

结果与结论：①治疗后1，4，8周：干细胞移植组以及糖尿病肾病组的血糖及尿总蛋白水平均显著高于对照组(P < 0.05)。②治疗后1周：干细胞移植组血糖及尿总蛋白水平显著低于糖尿病肾病组(P < 0.05)。③治疗后4，8周：糖尿病肾病组血糖及尿总蛋白水平稍高于干细胞移植组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。④实验结果表明，骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病肾病大鼠可以在短时间内获得良好的治疗效果，显著改善大鼠的血糖及尿总蛋白水平，但长期治疗效果不佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-8784-8132 (杜俊文)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, 糖尿病, 糖尿病肾病, 血糖, 尿总蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Common strategies for preventing diabetic nephropathy include effective control of blood sugar and blood pressure, inhibition of the rennin-angiotensin system and lipid-lowering therapy, but it is often difficult to get the desired results.
OBJECTIVE: To investigate the effect of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells on levels of blood glucose and urinary total protein in diabetic nephropathy rats.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups (n=15 per group): normal control group, diabetic nephropathy group and stem cell transplantation group. Rats in the diabetic nephropathy and stem cell transplantation groups were given single use of 60 mg/kg streptozotocin to make diabetic nephropathy models. The same dose of citric acid-sodium citrate buffer was injected in the normal control group. After modeling, 200 μL of bone marrow mesenchymal stem cell solution (2×106) was injected into the left ventricle of rats in the stem cell transplantation group, and then at 7 days after the first transplantation, the cell transplantation was conducted again. The same dose of serum-free L-DMEM was injected intracardially into the rats in the normal control and diabetic nephropathy groups. Levels of urinary total protein and blood glucose were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: At 1, 4, 8 weeks after treatment, the urinary total protein and blood glucose levels were significantly higher in the stem cell transplantation group and diabetic nephropathy group than the normal control group (P < 0.05). At 1 week after treatment, the urinary total protein and blood glucose levels were significantly lower in the stem cell transplantation group than the diabetic nephropathy group (P < 0.05). At 4 and 8 weeks after treatment, the total urinary protein and blood glucose levels were slightly higher in the diabetic nephropathy group than the stem cell transplantation group, but there was no significant difference (P > 0.05). These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in diabetic nephropathy rats can get good results in a short period, significantly improve the blood glucose and urinary total protein levels, but the long-term treatment effect is poor.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验与随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至8月在河北医科大学附属人民医院完成。

1.3 材料健康雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量300 g左右，由南京君科生物工程有限公司提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组从50只SD大鼠中随机选择5只作为供体源，获得动物骨髓，进行骨髓间充质干细胞分离与培养，其余45只大鼠随机分为3组，每组15只，分别设为正常对照组、糖尿病肾病组、干细胞移植组。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养与表面抗原检测于无菌条件下，对5只供体源SD大鼠进行常规麻醉，获得双侧股骨、胫骨，利用含胎牛血清的L-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液并接种在培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱进行培养。观察细胞生长情况，待细胞达到80%-90%融合时进行传代培养和扩增纯化。取第3代骨髓间充质干细胞，利用流式细胞仪检测其表面抗原表达。

1.4.3 建立大鼠糖尿病肾病模型糖尿病肾病组和干细胞移植组制备糖尿病肾病模型，具体方法：实验动物一次性腹腔注射链脲佐菌素60 mg/kg，3 d之后检测尾静脉血糖，连续检测3 d，如果血糖水平均在16.7 mmol/L以上，则表示糖尿病模型建模成功^[9]。糖尿病模型建模成功之后4周，检测大鼠尿量和尿蛋白水平，如果尿量高于原尿量的150%以上，24 h尿蛋白水平在30 mg以上，则视为糖尿病肾病建模成功^[10]。正常对照组仅注射相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，不做其他特殊处理。

1.4.4 骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病肾病取第2代骨髓间充质干细胞，利用胰蛋白酶进行消化，用含胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，离心，用无血清L-DMEM培养基悬浮细胞。使用26G针头，将2×10⁶(200 μL)骨髓间充质干细胞直接注射到干细胞移植组大鼠左心室，首次移植后7 d，进行第2次移植。正常对照组和糖尿病肾病组心内注射相同剂量的无血清L-DMEM培养基。

1.4.5 标本采集与检测于末次注射骨髓间充质干细胞后1，4，8周，每个时间点取5只大鼠，收集24 h尿液，利用全自动生化检测仪测定24 h尿总蛋白水平，然后进行断尾处理获得血液标本，利用全活力型血糖仪进行血糖水平检测。

1.5 主要观察指标 ①SD大鼠骨髓间充质干细胞形态和表面抗原阳性表达。②各组SD大鼠尿总蛋白水平和血糖水平。

1.6 统计学分析计量资料采用x(_)±s表示，使用SPSS 19.0软件，组间数据比较予以单因素方差分析，两两比较予以LSD法检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者最常见的并发症之一，长期血糖控制不佳，会导致肾脏超负荷工作，最终损害肾脏^[11-14]。同时，血糖升高容易导致血管病变引发高血压，加重肾脏损害^[15]。如果肾脏受累，导致体内的代谢废物和多余的液体清除不充分，又会使血压进一步升高，肾脏损害进一步加重，形成恶性循环^[16-19]。临床采用常规降血糖等治疗往往无法获得理想的效果。

随着干细胞理论的不断发现，干细胞疗法开始被积极应用于治疗糖尿病肾病^[20-22]。干细胞移植治疗糖尿病肾病可以实现对受损胰岛β细胞的良好修复，进而促进胰岛正常功能恢复，保护肾脏，达到治疗疾病目的^[23-26]。盖维等^[27]建立糖尿病肾病大鼠模型，并在建模成功后尾静脉注射骨髓间充质干细胞，结果表明骨髓间充质干细胞可以上调足细胞nephrin的表达，改善足细胞融合，并促进足细胞再生，从而减少尿蛋白，对肾脏起到一种保护作用。闵小春等^[28]分离培养大鼠自体脂肪间充质干细胞，经尾静脉注射到糖尿病大鼠模型体内。移植8周后，脂肪间充质干细胞组大鼠的血糖、尿素氮及肾质量/体质量比值均低于糖尿病组(P < 0.05)，且胰岛素水平较糖尿病组有所升高(P < 0.05)。另外，脂肪间充质干细胞组较糖尿病组的24 h 尿蛋白和血肌酐水平下降，但差异无显著性意义，结果表明自体脂肪间充质干细胞组移植能够在一定程度上改善和缓解1型糖尿病大鼠的肾功能紊乱。骨髓来源的间充质干细胞具有高度可塑性且来源广泛，易于在体外扩增，还可以诱导分化为多种组织细胞并易于被外源基因转染且稳定表达，被认为是组织工程、细胞及基因治疗的理想靶细胞^[29-36]。

实验通过腹腔注射链脲佐菌素方式建立糖尿病肾病大鼠模型，并进行骨髓间充质干细胞移植治疗。蛋白尿是肾病的典型症状之一，通过检测尿总蛋白水平可以较为直观的了解到糖尿病肾病的治疗效果。实验结果显示，治疗后1，4，8周干细胞移植组以及糖尿病肾病组的血糖及尿总蛋白水平均显著高于对照组(P < 0.05)；治疗后1周，干细胞移植组血糖及尿总蛋白水平显著低于糖尿病肾病组(P < 0.05)；治疗后4，8周，糖尿病肾病组血糖及尿总蛋白水平稍高于干细胞移植组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，上述结果表明，骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病肾病大鼠可以在短时间内达到降血糖以及降尿总蛋白的效果，但长期治疗并无法保持较好的效果。分析出现这一结果的原因，可能是因为糖尿病肾病的出现是受到血糖以及血压异常等长期作用的结果，实验过程中对糖尿病肾病大鼠进行骨髓间充质干细胞移植治疗时，动物已经处于失代偿阶段，因此，到达肾脏的干细胞数量较少^[37-39]，很难逆转现有的病理改变^[40-43]。Kang等^[44]将骨髓直接注射到NOD糖尿病小鼠体内，治疗时机选择在糖尿病发病前，可以获得理想的治疗效果，显著降低小鼠的血糖水平，但如果选择在糖尿病发病之后进行移植治疗，则无法改善小鼠的血糖水平。因此，对糖尿病肾病进行骨髓间充质干细胞移植治疗，需要掌握恰当的治疗时机，以提高治疗效果，改善预后。

综上所述，利用骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病肾病大鼠可以在短时间内获得良好的治疗效果，显著改善大鼠的血糖及尿总蛋白水平，为临床治疗糖尿病并发症提供了新的策略和希望，但长期治疗效果不佳，值得在今后予以进一步分析研究。