骨髓间充质干细胞经尾静脉移植治疗肝纤维化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.012

摘要/Abstract

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文题释义：

骨髓间充质干细胞：骨髓内存在的一类非造血干细胞，也称骨髓基质干细胞。移植到体内可分布于多种组织和器官，并具有多向分化潜能，能够向成骨系细胞、肝细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化。骨髓间充质干细胞具有针对多种疾病发挥治疗作用的潜能，目前有研究发现，骨髓间充质干细胞能够显著性改善肝病的发展过程，延长生存时间1年以上。

肝纤维化：是肝脏纤维结缔组织的过度沉积，各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化。从许多慢性肝病，特别是慢性病毒性肝炎的临床及病理演变来看，肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化必经之阶段。动物研究中多采用四氯化碳致肝脏纤维化的模型，该模型相对稳定，相关病理生理指标均与临床症状相似。

背景：肝纤维化是终末肝病的早期阶段，对肝纤维化进行有效治疗可以防止终末肝病的发生，骨髓间充质干细胞是治疗肝纤维化的一种比较有前景的治疗方法。

目的：探讨骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化的治疗作用。

方法：将18只SD大鼠随机分为3组，对照组、模型组和移植组。模型组和移植组应用四氯化碳诱导建立大鼠肝纤维化模型，造模后移植组大鼠经尾静脉缓慢注入1 mL骨髓间充质干细胞(5×10⁵个)，模型组经尾静脉注入等量的生理盐水；对照组大鼠不予任何处理。移植治疗后4周，检测各组大鼠肝纤维化、肝功能指标，观察大鼠肝脏病理组织学变化。

结果与结论：①对照组肝脏组织结构正常；模型组肝脏组织内门管区见纤维组织增生，有炎症细胞浸润，肝细胞空泡变性，排列紊乱，组织结构破坏；移植组肝脏组织破坏介于正常组和模型组之间。②移植组肝纤维化指标血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平均明显低于模型组(P < 0.05)；移植组肝功能指标血清谷丙转氨酶、血清白蛋白、谷草转氨酶水平均明显低于模型组(P < 0.05)。③结果表明四氯化碳可以诱导大鼠肝纤维化，骨髓间充质干细胞移植可以减轻肝脏纤维化程度，改善肝脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-6087-0671 (王长武)

关键词: 干细胞, 移植, 肝纤维化, 骨髓间充质干细胞, 细胞移植, 肝功能, 四氯化碳

Abstract:

BACKGROUND: Liver fibrosis is the early stage of terminal liver diseases. Effective treatment for liver fibrosis can prevent the occurrence of terminal liver diseases. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is a promising method to treat liver fibrosis.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on liver fibrosis in rats.
METHODS: Eighteen Sprague-Dawely rats were randomized into three groups: control, model and cell transplantation groups. Animal models of carbon tetrachloride-induced liver fibrosis were made in the latter two groups. After modeling, 1 mL bone marrow mesenchymal stem cells (5×105) or the same volume of normal saline was injected via the tail vein into the rats in the cell transplantation and model groups, respectively. Rats in the control group were given no treatment. Degree of liver fibrosis, liver function, histological changes of the liver were detected and observed in the three groups at 4 weeks after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: In the control group, the liver tissues had normal structure with no fibrosis; in the model group, proliferation of fibrous tissues in the portal area of the liver, inflammatory cell infiltration, vacuolar degeneration and irregular arrangement of liver cells, and tissue structure damage were observed; in the transplantation group, liver tissue damage was severer than the control group but milder than the model group. Levels of serum hyaluronidase, type IV collagen and procollagen III were significantly lower in the cell transplantation group than the model group (P < 0.05). These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can alleviate liver fibrosis and improve liver function in rats with carbon tetrachloride-induced liver fibrosis.

王长武，房新辉. 骨髓间充质干细胞经尾静脉移植治疗肝纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(6): 841-847.

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图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞的形态接种后4 h出现细胞贴壁，48 h换液后见形态均一、星形或者短梭形、伸长伪足的散在贴壁细胞，培养6 d见放射状细胞集落，伸出突起，12 d细胞集落不断融合成漩涡状(图1A)。细胞传代培养较原代快，7 d左右铺满瓶底(图1B)。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定结果第3代骨髓间充质干细胞进行免疫组化染色鉴定发现CD44阳性，CD34阴性，成脂诱导油红O染色阳性，表明培养细胞为骨髓间充质干细胞。

2.3 实验动物数量分析共有22只动物参与主要实验过程，其中4只SD大鼠用于提取骨髓间充质干细胞，18只SD大鼠用于动物模型实验，全部进入最终的实验分析。

2.4 肝脏组织病理变化经苏木精-伊红染色：对照组肝脏组织没有纤维增生，没有炎症细胞浸润，组织结构正常(图2A)；模型组肝脏组织内门管区见纤维组织增生，有炎症细胞浸润，肝细胞空泡变性，排列紊乱，组织结构破坏(图2B)；移植组肝脏组织破坏介于正常组和模型组之间(图2C)。

2.5 移植前后各组肝纤维化指标检测结果由表1可以看出，造模后模型组肝纤维化指标血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平均明显高于对照组(P < 0.05)，表明大鼠肝纤维化模型建造成功。移植后血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平均有大幅度下降(P < 0.05)，提示骨髓间充质干细胞移植能够显著性减轻大鼠肝脏纤维化和损伤的进程。

2.6 移植前后各组肝功能指标检测结果由表2可以看出，移植治疗后4周，模型组肝功能指标血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白水平均明显高于对照组(P < 0.01)，表明大鼠肝纤维化模型组肝功能严重损害；移植组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白均明显低于模型组(P < 0.05)，移植组上述3项指标的真实值均接近对照组，提示骨髓间充质干细胞移植后能显著性改善动物肝脏的生理功能。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年2月至2015年2月在郑州大学第五附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康SD雄性大鼠18只，8周龄，清洁级，体质量250-300 g，用于进行动物体内实验；健康SD雄性大鼠4只，4周龄，清洁级，体质量90-110 g，用于分离培养骨髓间充质干细胞。所有大鼠购自河南实验动物中心。实验前饲养于实验室大鼠专用鼠笼，适应性饲养1周，按照实验动物标准进行饲养。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.3.2 主要试剂 DMEM-LG培养基(Hyclone公司)；血清纤维化指标放射免疫分析试剂盒(上海海研医学生物技术有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，吲哚美辛、胰蛋白酶、1-甲基-3-异丙基黄嘌呤(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(上海华精试剂公司)，四氯化碳(上海新中化学厂)，免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉公司)，兔抗大鼠CD44、兔抗大鼠CD34(博士德公司)等。

1.3.3 主要仪器超净工作台(上海博讯实业公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；纯水仪(美国Millipore公司)；冰箱(中国Haier公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；超低温冰箱(美国Forma Scientific.Inc)；普通光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)；电热恒温水浴槽(晋州市康宏线缆仪器设备有限公司)；电热干燥箱(上海医疗器械总厂)；酶联免疫检测仪(日本BIO-RAD公司)；流式细胞仪(沈阳精博科技有限公司)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；微量加样器(德国GILSON公司)；血球计数板(浙江玉环县求精医用仪器厂)；恒温CO₂孵箱(德国Heraeus公司)；冻存管、培养瓶、培养板(广州赛业生物技术有限公司)；离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；石蜡包埋机(德国Leica公司)；手揿计数器(绍兴市医疗器械一厂)；LEICA-RM2025组织切片机(德国Leica公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

骨髓间充质干细胞的分离、培养：采用全骨髓冲洗法分离大鼠骨髓间充质干细胞^[11]，将4只4周龄SD大鼠脱颈处死，无菌分离大鼠胫骨和股骨，低糖DMEM冲洗胫骨和股骨骨髓腔，收集细胞，将细胞过滤洗涤，低糖DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶中进行培养，48 h后进行第1次换液，以后3 d换液1次，待细胞达80%- 90%融合时，开始消化传代。

骨髓间充质干细胞的鉴定：取第3代生长良好的骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，培养3 d后进行细胞爬片，洗涤，多聚甲醛固定，洗涤，H₂O₂+纯甲醇浸泡，BSA封闭，加入一抗孵育，洗涤，加入山羊抗兔IgG孵育，洗涤，加入显色液孵育，洗涤，DAB显色，洗涤，苏木精染色，乙醇脱水，树胶封固，显微镜下观察。取第3代生长良好的细胞接种于6孔板培养，3 d后进行成脂诱导培养，每隔3 d换液1次，倒置显微镜下进行观察。

1.4.2 动物分组将18只SD大鼠随机分为3组，对照组、模型组和移植组，每组6只。

1.4.3 建立大鼠肝纤维化模型模型组和移植组大鼠构建四氯化碳肝纤维化动物模型^[12]，将苯巴比妥注射液(350 mg/L)混入饮用水中给大鼠饮用，1周后给予四氯化碳橄榄油混合液灌肠，四氯化碳和橄榄油的比例为 2︰3，每周灌肠2次，共灌肠8周。每4周动物剪尾取血 1 mL，分离血清测定血清中白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平，经过数据分析和对比，上述指标均大幅度升高，与正常组比较差异有显著性性意义(P < 0.01)，即可认为造模成功。

1.4.4 骨髓间充质干细胞移植建模后对照组大鼠不予任何处理，移植组大鼠经尾静脉缓慢注入1 mL骨髓间充质干细胞(5×10⁵个)，模型组经尾静脉注入等量的生理盐水。

1.4.5 大鼠肝脏纤维化指标和肝功能指标测定移植治疗4周后，10%水合氯醛以3 mL/kg的剂量麻醉后，腹主动脉取血5 mL，3 000 r/min的转速冷冻离心后分离血清，采用化学发光法测定肝纤维化指标血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平，采用全自动生化仪检测白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平。

1.4.6 大鼠肝脏病理组织学检查移植治疗4周后处死大鼠，取出肝脏组织，用甲醛溶液固定，石蜡包埋。苏木精-伊红染色：石蜡切片经脱蜡水化，苏木精浸泡，然后自来水浸泡，稀盐酸乙醇液分色，自来水浸泡蓝化，蒸馏水洗涤，伊红染色，蒸馏水洗涤，乙醇脱水，二甲苯中浸泡，中性树胶封固。

1.5 主要观察指标 ①肝纤维化指标血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平。②肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白水平。③肝脏组织的病理组织学变化。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间均数比较采用SNK法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肝纤维化与慢性炎症反应密切相关，肝脏炎症由轻度发展到重度，重症炎症进一步发展出现肝纤维化，甚至肝硬化。肝纤维化是细胞外基质降解与增生失去平衡，引起肝脏纤维组织沉积的一种可逆性的病理过程。肝脏受到损害时肝脏细胞分泌多种细胞因子，刺激肝脏星状细胞等活化为肌成纤维细胞，分泌细胞外基质，破坏肝脏结构，肝细胞数减少，血管结构紊乱，发生肝纤维化。细胞外基质的降解和沉积失衡是导致肝纤维化的原因，细胞外基质的起源细胞具有成纤维细胞或肌成纤维细胞特性^[13-14]。肝纤维化中的主要细胞因子有转化生长因子β、血小板衍生因子、血管内皮生长因子、缩血管性细胞因子、脂肪素、趋化因子等，这些因子共同参与肝纤维化的发生^[15-16]。肝纤维化的发生机制主要有肝脏受损引起的慢性炎症反应，转化生长因子β通过多种途径诱导肝纤维化，肝脏损伤使肝细胞凋亡缺失诱导肝纤维化，氧化应激导致星状细胞活化引起肝纤维化。肝脏细胞损伤时引起星状细胞活化，与肝细胞、免疫细胞以及内皮细胞互相作用，分泌多种因子引起肝硬化^[17]。肝纤维化的治疗目的为减轻细胞坏死，减轻肝纤维化，减慢疾病发展，防治肝硬化、肝癌及其并发症的发生，延长寿命，改善生活质量^[18]。主要治疗方法有：①治疗原发疾病：去除肝脏纤维化的病因是治疗肝纤维化最有效的方法，酒精性肝病进行戒酒治疗，慢性乙肝的治疗为持续抑制乙肝DNA的复制，阻止进一步发展为肝硬化或者肝癌^[19]，聚乙二醇干扰素联合利巴韦林是治疗丙肝的有效方法^[20-21]。②减少炎症及宿主免疫反应：常用药物为糖皮质激素和水飞蓟素等^[22]。③抑制星状细胞的活化与增殖：抗纤维化治疗的主要靶点是抑制转化生长因子β1和肝星状细胞的过量表达。④促进星状细胞凋亡：促进星状细胞凋亡可以抗肝纤维化。⑤减少细胞外基质的产生或者增加瘢痕基质的降解可以促进肝脏纤维化的逆转^[23]。⑥抗氧化剂治疗：抗氧化剂维生素E和多烯磷脂酰胆碱等可以抑制氧化反应，减少肝脏炎症和纤维化程度^[24]。⑦中药治疗：目前抗纤维化治疗疗效比较确切的药物比较少，中药在抗纤维化方面具有独特优势，其中包括单味药和复方制剂等^[25-30]。⑧基因治疗：比较理想的抗肝脏纤维化治疗应具有肝脏选择性和特异性，基因治疗为肝脏纤维化提供了新的途径^[31]。⑨肝移植和干细胞治疗：对于终末肝病，肝移植是惟一有效的方法，但因资源缺乏，费用昂贵，使其在临床中并没有得到广泛应用。干细胞具有巨大的再生和增殖能力，干细胞移植是目前治疗肝纤维化比较有前景的方法^[32]。

骨髓间充质干细胞在肝纤维化、肝硬化治疗中能够抑制星状细胞增殖，促进其凋亡，减轻肝脏的纤维化程度^[33-35]，能够调节多种细胞因子的免疫作用，并抑制炎症因子的反应^[36]，对肝功能有恢复作用^[37]。骨髓间充质干细胞在治疗肝癌中能够影响肝癌细胞的生长和转移，降低肝癌的转移率和死亡率^[38-39]。骨髓间充质干细胞在治疗肝衰竭中可以通过自身的分化增殖参与肝脏的再生，同时通过合成生长因子，减少肝细胞凋亡、刺激肝血管再生及内源性肝细胞增殖^[40-45]。有研究发现局部注射以及门静脉输注有增加门静脉高压以及肺栓塞的风险^[46]，门静脉注射对肝功能的恢复有促进作用^[47]，小鼠尾静脉注射对慢性肝损伤效果较好^[48]。

实验通过四氯化碳诱导建立大鼠肝纤维化模型，进行骨髓间充质干细胞治疗，结果发现：移植治疗后4周，模型组肝脏组织内门管区见纤维组织增生，有炎症细胞浸润，肝细胞空泡变性，排列紊乱，组织结构破坏，移植组肝脏组织破坏较模型组轻；移植治疗后4周，模型组肝纤维化指标血清透明质酸酶、血清Ⅳ型胶原、血清Ⅲ型前胶原水平均明显升高；移植组的血清肝纤维化指标均明显低于模型组(P < 0.01)，但高于对照组；移植治疗后4周，模型组肝功能指标血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白水平均明显升高；移植组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白水平均明显低于模型组，表明骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化大鼠可能减轻其肝脏纤维化程度，改善各项肝功能指标。