人工虫草复合液对无心跳模型大鼠离体肾的低温保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.010

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (5): 664-670.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.010

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人工虫草复合液对无心跳模型大鼠离体肾的低温保护作用

戴晨¹，王顺¹，徐加波²，刘健¹

¹新疆医科大学第一附属医院肾病科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；²新疆工程学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2015-11-07 出版日期:2016-01-29 发布日期:2016-01-29
通讯作者: 刘健，博士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院肾病科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:戴晨，女，1986年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，2012年新疆医科大学毕业，硕士，医师，主要从事慢性肾小球疾病及肾移植方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2011211A058)；国家自然科学基金项目(青年基金)(11301451)

Protective effect at low temperature of artificial cordyceps compound on isolated kidney from non-heart-beating rat models

Dai Chen¹, Wang Shun¹, Xu Jia-bo², Liu Jian¹

¹Department of Nephropathy, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Xinjiang Institute of Engineering, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2015-11-07 Online:2016-01-29 Published:2016-01-29
Contact: Liu Jian, M.D., Chief physician, Department of Nephropathy, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Dai Chen, Master, Resident physician, Department of Nephropathy, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No.2011211A058; the National Natural Science Foundation (Youth Foundation) of China, No.11301451

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

无心跳供体：有5种：①到达医院时已死亡病例。②心肺复苏失败死亡病例。③撤出生命支持，等待心脏停搏的治疗无效病例。④脑干死亡后心脏停搏病例。⑤重症监护病房内或危重患者发生的意外心脏停搏病例。上述5种又分为两大类，第1，2，5为无准备型无心跳供体，第3，4为有准备型无心跳供体。各分类供体的成功移植均见报道，然而，无准备型无心跳供体后原发性移植物失功发生率高，易致早期死亡；对于有准备型无心跳供体，预后满意，且来源较广，尤其是第3类，是目前无心跳供体的主要来源。

低温保存：在正常体温下缺血称热缺血，在4 ℃低温下缺血称冷缺血，低温可使离体器官对缺血耐受的时间延长。一般情况下器官离体后须先经低温灌注处理。低温保存有2个目的，其一是使器官温度立即降至4 ℃左右，结束热缺血时间；另一是清除器官内的血液包括免疫活性细胞，直至其表面呈均匀的灰白色，静脉流出的液体清澈。

背景：无心跳供体已成为近年来最有潜力的移植供体来源，为进一步改进供体保存液，在常规保存液高渗枸橼酸盐腺嘌呤液的基础上加入人工虫草制备人工虫草复合液，希望通过其抗氧化作用，减少供体损伤，提高供体质量。

目的：探讨人工虫草复合液对无心跳大鼠离体肾的保存作用。

方法：将39只SD大鼠毁损延髓，不进行体外呼吸循环支持，造成脑死亡诱导的无心跳模型后，随机等分为3组，人工虫草复合液组(n=15)、高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组(n=15)和生理盐水组(n=9)，分别用人工虫草复合液、高渗枸橼酸盐腺嘌呤液、生理盐水对离体肾脏进行4 ℃低温保存。

结果与结论：与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，人工虫草复合液组肾组织保存6和12 h后，形态损伤较轻，凋亡指数、丙二醛含量、Bax及Caspase-3表达水平下降，超氧化物歧化酶活力及Bcl-2表达水平上升；而保存24 h后，形态损伤程度接近，丙二醛含量下降，超氧化物歧化酶活力上升。提示人工虫草复合液对无心跳大鼠离体肾的抗氧化、抑制细胞凋亡方面保存效果优于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0002-3208-059X(刘健)

关键词: 实验动物, 移植动物模型, 无心跳供体, 肾移植, 肾脏保存液, 缺血再灌注损伤, 抗氧化, 热缺血, 人工虫草, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Non-heart beating donors have become the most promising source of donor in recent years. To further improve donor preservation solution, on the basis of conventional storage solution hypertonic citrate adenine solution, artificial cordyceps was added to prepare artificial cordyceps compound solution. It is hoped to reduce donor injury and to elevate donor quality by antioxidation.
OBJECTIVE: To investigate the preservation effect of artificial cordyceps compound solution on isolated renal from non-heart-beating rats.
METHODS: Medullas of 39 Sprague-Dawley rats were injured. Without in vitro respiratory and circulatory supports, non-heart-beating models were established and randomly divided into three groups: artificial cordyceps compound group (n=15), hypertonic citrate adenine solution group (n=15) and physiological saline group (n=9). The kidneys of rats in different groups were stored in artificial cordyceps compound solution, hypertonic citrate adenine solution and physiological saline at 4 ℃.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the hypertonic citrate adenine solution group, after 6 and 12 hours of preservation, morphological injury was mild, apoptotic index, malondialdehyde, Bax and Caspase-3 expression levels decreased, superoxide dismutase activity and Bcl-2 expression increased; after 24 hours, the degree of injury was similar, malondialdehyde content decreased, and superoxide dismutase activity increased in the artificial cordyceps compound group. These findings indicated that the preservation effect of artificial cordyceps compound on antioxidation and inhibition of apoptosis was better than that of hypertonic citrate adenine solution in non-hearting beating rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

戴晨，王顺，徐加波，刘健. 人工虫草复合液对无心跳模型大鼠离体肾的低温保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(5): 664-670.

Dai Chen, Wang Shun, Xu Jia-bo, Liu Jian. Protective effect at low temperature of artificial cordyceps compound on isolated kidney from non-heart-beating rat models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(5): 664-670.

图/表（结果） 7

2.1 造模成功动物数量及过程造模成功大鼠为39只，标本以肾脏为单位计数入组，均进入结果分析。

2.2 模型方法的改进且更接近临床实践国外的建模方法主要为夹闭心脏基底部造成急性的心脏停跳。但是，这种心脏停跳方式并不符合临床心死亡供体在心脏停跳前后的血液流变学的变化，为此实验模拟临床可控性心脏停跳供者死亡过程，通过断延髓法，捣毁其生命中枢，造成脑死亡，不进行体外呼吸循环支持，造成脑死亡诱导的心脏停跳服更加贴近临床，符合实际情况下心脏停跳供体的生理病理过程。

2.3 主要观察结果和次要观察结果

2.3.1 组织学变化光镜下可见，保存6 h后，人工虫草复合液组和高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组肾脏无明显病理改变；保存12和24 h后，与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，人工虫草复合液组肾脏肾小管上皮细胞病理改变较轻(图1)。

肾脏病理损伤半定量评分结果见表2。与生理盐水组相比，高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组和人工虫草复合液组肾脏病理损伤半定量评分明显较低(P < 0.05)，且人工虫草复合液组病理损伤的半定量评分明显低于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组(P < 0.05)。

2.3.2 超微结构变化电镜观察结果显示，保存6 h后，高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组和人工虫草复合液组未见明显超微结构改变。保存12 h后，高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组超微结构轻度损伤，人工虫草复合液组未见明显改变。保存24 h后，与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，人工虫草复合液组的超微结构改变较轻(图2)。

2.3.3 细胞凋亡保存6和12 h，虫草组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数明显低于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组(P < 0.05)；保存24 h，3组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数接近(P > 0.05)，且各组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数随缺血再灌注时间延长而呈升高趋势(表3)。

2.3.4 离体肾组织超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量保存不同时间后，虫草组离体肾组织中超氧化物歧化酶活力均高于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组(P < 0.05)，而丙二醛含量低于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组(P < 0.05)；随保存时间的延长，各组肾组织超氧化物歧化酶活力均呈现逐渐降低的趋势(P < 0.05)，而丙二醛含量随着保存时间的推移而升高(P < 0.05)(表4，5)。

2.3.5 离体肾组织凋亡相关蛋白的表达水平与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，保存6 h后，人工虫草复合液组离体肾脏组织中Bcl-2的表达水平明显增多(除保存24 h外， P < 0.05)，Bax的表达水平明显较弱(P < 0.05)，Bcl-2/Bax的比例较高(P < 0.05)；保存24 h后，与和高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，虫草组离体肾脏组织中Bcl-2的表达水平增多(除保存24 h外，P > 0.05；表6-8)。

与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，保存6和12 h，虫草组肾组织中Caspase-3的表达水平明显较低(P < 0.05)；而保存24 h后，高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组与虫草组肾组织中Caspase-3的表达水平接近(P > 0.05；表9)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2011年1月至2012年1月在新疆医科大学第一附属医院科技楼动物实验室及免疫组化实验室完成。

1.3 材料

动物：健康清洁级雄性SD大鼠39只，鼠龄12-14周，体质量(230±10) g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(新) 2011-0003。实验期间，动物室温控制在25-28 ℃，湿度70%，12 h交替照明。大鼠自由饮水、进食，保持垫料干燥。实验由新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会审批通过，审批号：A-20101020020。

药物：人工虫草复合液：采用水提法将人工虫草发酵菌粉(江西济民可信金水宝制药有限公司)制备成生药浓度3.0 g/mL的高浓度人工虫草提取液，然后按每15 mL高渗枸橼酸盐腺嘌呤液(上海长征医院)中加入0.168 mL人工虫草提取液配置成人工虫草复合液^[17]。经过⁶⁰Co核辐射消毒，密封后使用。人工虫草复合液与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液的溶液的理化指标的差异见表1。

1.4 方法

1.4.1 无心跳大鼠模型的建立所有大鼠以氯胺酮 100 mg+加地西泮10 mg+阿托品0.5 mg腹腔麻醉后，仰卧位固定，暴露并游离肾脏及其附属结构，阴茎背动脉注射 1 500 U肝素，毁损延髓，确认心脏停跳。将39只大鼠随机分为人工虫草复合液组(n=15)、高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组(n=15)和生理盐水组(n=9)。

1.4.2 肾低温保存 30 min后，人工虫草复合液组、高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组和生理盐水组大鼠分别分别用人工虫草复合液、高渗枸橼酸盐腺嘌呤液和生理盐水进行原位双肾灌洗，灌注液温度2-4 ℃，压力2.66-3.32 kPa，灌注直至肾静脉流出液清亮，肾脏变为均匀苍白，然后放入盛有2-4 ℃相应保存液的无菌冰桶内，置入4 ℃冰箱内保存。

1.4.3 取材肾脏保存6，12，24 h后，留取肾组织标本，制成30-50 μm的切片。

1.4.4 病理观察

肾脏损伤程度：肾脏切片以苏木精-伊红染色，光镜下肾小管刷状缘消失；细胞水肿；核浓缩或消失；管腔内出现蛋白小滴及脱落物；肾小管上皮细胞极性消失；肾小管上皮细胞基底膜连续性破坏等。损伤分级分为0-4级^[18]，0级：基本无肾小管损伤/视野；1级：< 25%的肾小管损伤/视野；2级：25%-50%肾小管损伤/视野；3级：51%-75%肾小管损伤/视野；4级：> 75%肾小管损伤/视野。并按以下赋分条件进行半定量评分：0级=0分，1级=1分，2级=2分，3级=3分，4级=4分。

肾脏组织超微结构变化：在蜡板上将肾组织切成约 1 mm³小块，立即放入3%戊二醛中固定，经1%四氧化锇固定，梯度乙醇脱水，EPON-812环氧树脂浸透包埋，制备超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅重染色后，行透射电镜观察。

1.4.5 细胞凋亡的检测采用TUNEL法检测细胞凋亡率。制作石蜡切片，用二甲苯常规脱蜡，采用TUNEL法测定凋亡率，按检测试剂盒说明书操作。最后脱水、透明、封固。光镜下观察，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。每张切片随机选10个连续不重叠的400倍视野，计算细胞平均凋亡指数，凋亡指数=肾组织凋亡细胞总数/细胞总数×100%。

1.4.6 凋亡相关蛋白的分析免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达。免疫组化按常规方法及试剂盒说明操作，显微镜下观察。胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。每张切片随机选5个连续不重叠的400倍视野，应用图像分析系统计算平均吸光度值。

1.4.7 氧化应激指标的检测取肾组织约0.3 g加入冰生理盐水2.7 mL，用玻璃匀浆器制成10%的匀浆，低温3 000 r/min离心15 min，留取上清液，再将10%的匀浆上清加生理盐水按1∶9稀释成1%的组织匀浆。紫外分光光度仪波长595 nm下计算蛋白含量。黄嘌呤氧化酶法测定并计算超氧化物歧化酶活力，硫代巴比妥酸法测定并计算丙二醛含量。

1.5 主要观察指标肾脏组织中细胞凋亡、凋亡相关蛋白的表达水平及氧化应激指标。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。数据以x(_)±s表示，多组间计量资料采用单因素方差分析，方差分析有意义的情况下组间比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

肾移植已经成为治疗终末期肾衰竭的最有效的手段，供肾短缺已成为全球性难题。如何解决器官来源成为热点问题。中国的主要肾移植供体源主要有尸体供肾及活体供肾两种；活体供体又可分为亲属供肾及非亲属供肾；中国法律明文规定，禁止非亲属供肾移植。而活体亲属供肾违背了医学伦理学中的“无伤害原则”。为了解决这一问题，专家集中聚焦于心脏死亡器官捐献供器官的获取^[19-21]，因此，心脏死亡供体将成为中国今后肾移植的主要供肾来源，但该供体移植术后早期移植物失功和移植物排斥反应等并发症发生率仍偏高^[22-25]。缺血再灌注损伤引起的移植肾功能障碍是影响肾移植治疗效果的重要因素。氧化应激是缺血再灌注损伤产生的重要机制。大量细胞毒性氧自由基的产生可引起脂质和DNA的氧化损伤，产生炎症反应，导致肾脏细胞的坏死和凋亡；而坏死细胞释放的各种炎症因子会进一步加重炎症反应，形成恶性循环。因此，减轻细胞毒性氧自由基介导的氧化损伤可能成为改善术后移植肾功能的有效手段。多项研究表明，器官保存期加入抗氧化剂可以减少保存器官的缺血损伤，改善移植器官的保存^[26-30]。其中一些文献显示，在低温所致的细胞毒性级联反应中，活性氧产生致使下游信号通路激活，导致细胞凋亡^[26^，^30]。因此，在移植器官低温保存期采取抗氧化或抗凋亡措施，可减弱低温保存器官缺血损伤，改善移植供体的质量。Belzer等^[31]认为理想的低温保存液应该具备预防再灌注后氧自由基损伤的作用。人工虫草菌丝在化学、药理、临床方面与天然虫草十分相似^[2-6^，¹⁰^，^15-16^，^32-37]。

肾脏缺血再灌注性损伤是综合因素导致的损伤机制，目前认为细胞凋亡是缺血再灌注损伤最主要的组织和器官损伤途径之一^[38-43]。细胞凋亡是细胞死亡的基本机制，对于维持细胞正常发育及稳定有重要意义。细胞凋亡与临床上许多疾病的发生密切相关^[54-46]。当细胞凋亡过度，则扩大表现为组织器官的损伤。人工虫草具有很强的抗氧化作用^[11^，^47]，能够减轻缺血再灌注损伤所引起的脂质过氧化损伤，减轻肾小管细胞凋亡程度，提高肾脏保存效果^[48-49]。本实验发现，人工虫草复合液保存肾脏后，细胞凋亡指标及过氧化损伤指标明显低于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液保存的肾脏，组织病理学也证实这一点。

缺血再灌注损伤后，机体内爆发性产生大量氧自由基，机体内的氧自由基清除能力超负荷，最终导致氧化应激反应的发生。当氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化反应直接导致细胞膜的损伤，形成严重的氧化应激状态，通过激活凋亡相关基因，诱导细胞凋亡发生，当细胞凋亡过度，则扩大表现为组织器官的损伤。细胞凋亡的发生，由细胞内外的凋亡诱导因素转导细胞内凋亡信号，激活凋亡基因并开启凋亡通路。其中，线粒体在凋亡通路中的始动因素，Bcl-2/Bax在凋亡通路的上游发挥调节细胞凋亡结局的作用^[50]，Caspase主要是细胞凋亡效应的执行者^[51]，其活性的高低能间接反映组织细胞的凋亡程度。本实验结果显示，与高渗枸橼酸盐腺嘌呤液组相比，人工虫草复合液组肾组织中超氧化物歧化酶含量较高，细胞凋亡指数明显减低，且Bcl-2/Bax的比例较高，Caspase-3活性明显降低，同时肾病理形态也明显改善。

结合此次实验结果，人工虫草复合液可通过以下机制发挥对无心跳供体肾脏的保护效应：其抗氧化活性可增加组织细胞的氧自由基清除力，主要表现在使超氧化物歧化酶增加为主，减少细胞膜及超微结构(主要为线粒体)的脂质过氧化反应，稳定细胞的内环境，减轻细胞水肿及钙超载的发生，上调细胞膜、细胞质、线粒体膜上的Bcl-2表达，下调胞浆内Bax蛋白的表达，使Bcl-2与Bax形成的异源二聚体增加，从而阻止Bax在线粒体外膜形成孔道，减少线粒体膜通透性的增加，以阻止细胞色素C的释放，减少对凋亡通路下游凋亡效应蛋白Caspase-3酶原的激活，抑制Caspase-3的蛋白酶活性，阻止其与细胞核内的凋亡底物反应，最终减少细胞凋亡，发挥对无心跳供体肾组织的保护效应。综上所述，人工虫草复合液通过抗氧化机制下调细胞凋亡途径从而发挥对无心跳供体离体肾组织的保护效应。

总之，人工虫草复合液对无心跳供体离体肾具有保护作用，在抗氧化、改善缺血再灌注损伤方面优于高渗枸橼酸盐腺嘌呤液。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

人工虫草复合液对无心跳模型大鼠离体肾的低温保护作用

Protective effect at low temperature of artificial cordyceps compound on isolated kidney from non-heart-beating rat models

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