1.1 设计 病例-对照分析。
1.2 时间及地点 于2014年12月至2015年3月广州中医药大学国家重点骨科实验室完成。
1.3 对象
1.3.1 骨质疏松症组 选择2014年10至12月广州中医药大学第一附属医院骨科因髋关节骨性关节炎住院行髋关节置换的年龄50-70岁绝经后女性患者10例。
纳入标准:①年龄50-70岁。②女性自然绝经(停经1年以上)。③符合原发性骨质疏松症诊断标准及中国人骨质疏松症建议诊断标准[5-6]。④骨密度≤-2.0 SD。⑤患者对指标检测均知情同意。
1.3.2 对照组 同期行髋关节置换的年龄50-70岁绝经后女性患者10例。
纳入标准:①年龄50-70岁。②女性自然绝经(停经1年以上)。③不符合骨质疏松症的诊断。④患者对指标检测均知情同意。
1.3.3 两组排除标准 ①年龄小于50岁或大于70岁。②患精神病或老年痴呆者。③合并心脑血管等系统严重原发性疾病者。④肝肾功能不全患者者。⑤有导致继发性骨质疏松症相关疾病病史,如甲状旁腺功能亢进、类风湿性关节炎等。⑥糖皮质类激素应用史。⑦患者半年内服用可能影响骨代谢的药物者。
根据受试者骨密度测量结果及纳入、排除标准,分为骨质疏松组(实验组)和正常组(对照组)。所有入组人员监测项目均知情同意,研究所取骨组织标本为手术截下之股骨头,不牵涉伦理问题。
1.4 材料
试剂及仪器:H3K9me3、H3K36me3、雌激素相关受体α一抗(英国Abcam公司);JMJD2A、JMJD2B一抗(美国CST公司);免疫组织化学聚合物检测系统试剂盒、Simple Western试剂套装(德国Leica公司);Simon全自动蛋白质表达分析系统、RIPA裂解液、PMSF(美国ProteinSimple公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司);双能X射线骨密度仪、自动脱水机、石蜡包埋机(法国MEDILINK公司);石蜡切片机(德国Leica公司)。
1.5 方法
1.5.1 临床生化样本收集 所有受试者清晨空腹采取静脉血行血常规、生化、肝肾功能等检查,检测血清25-(OH)VitD水平。
1.5.2 骨密度测定方法 依据世界卫生组织(WHO) 2004年发布的骨质疏松症的诊断标准制定的《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识(第三稿•2014版)》[7],采用法国MEDILINK公司双能X射线骨密度仪检测患者腰椎(L2-L4)正位骨密度,骨密度≤-2.0 SD为骨质疏松,骨密度> -1.0 SD为正常。
1.5.3 骨组织标本收集 髋关节置换术中,无菌骨刀凿取股骨头内形态保存完好的松质骨颗粒,大小约1 cm×1 cm× 0.5 cm,立即放入体积分数10%甲醛溶液固定,此为免疫组织化学部分标本;无菌骨刀凿取股骨头内松质骨颗粒,立即装入1.5 mL无菌冻存管,放入液氮中,转运至-80 ℃冰箱保存备用,此为WB部分标本。
1.5.4 免疫组织化学检测松质骨标本JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3、雌激素相关受体α表达
标本处理:将收集的松质骨标本置于体积分数4%甲醛溶液,常温固定24 h,PLANK脱钙液脱钙三四天,期间更换脱钙液1次,隔段时间用注射器针头针刺骨标本以检查脱钙效果,至针头能轻松扎入骨组织而没有明显阻力即脱钙完成。脱钙完成后自来水流水冲洗12 h。系列乙醇脱水、TO透明剂透明、浸蜡,石蜡包埋。Leica病理切片机切成厚度4 μm的蜡片,将蜡片展于标记的防脱载玻片上,60 ℃烤箱烤片2 h使标本贴片牢固。
实验步骤:石蜡切片经脱蜡,抗原修复,封闭,一抗、二抗孵育,DAB显色,苏木精复染,脱水,封固,显微镜下观察染色结果。
结果判定:通过显微镜观察显示JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3、雌激素相关受体α均定位于细胞核,显微镜下每张切片随机观察5个200倍视野,观察核染色程度(0,1,2,3分分别为阴性着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色)和阳性范围评分(1,2,3,4分分别为0-10%、11%-50%、51%-80%、> 80%),两分数相乘:0分为阴性,1-4分为弱阳性,> 4分为强阳性,本实验采取分值高低比较阳性率水平。
1.5.5 免疫印迹法检测松质骨标本JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3、雌激素相关受体α表达
标本处理:将超低温冰箱保存的骨组织标本取出,采用碧云天全蛋白提取试剂盒提取骨组织总蛋白样品,BCA法测定蛋白浓度,分装于-20 ℃冰箱保存备用。
实验步骤:蛋白检测使用美国Simon全自动蛋白质表达分析系统,按照Simple Western试剂套装操作指南及预实验结果,将一抗及内标β-Action按照1∶50稀释,蛋白样品浓度按照1.5 g/L稀释,小心将各样品依次加入微孔板,避免产生气泡,上样完成后,按照软件操作指南上机点击运行,机器自动完成样品跑胶、抗体孵育及染色成像。约 5 h后,机器运行结束,生成结果。结果判定根据Graph view下的Peaks表格中目的蛋白“峰面积”数值来计算蛋白表达量。
1.6 主要观察指标 实验组和对照组雌激素相关受体α、JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表达差异。
1.7 统计学分析
实验数据采用SPSS 18.0录入和处理,实验结果用
x±
s表示,作正态性检验,符合正态性分布的两组间比较采用
t 检验,若不符合正态分布,采用非参数检验,
P < 0.05为差异有显著性意义。