骨桥蛋白干预体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.004

中国组织工程研究

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

骨桥蛋白干预体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达

朱鹤远¹，雷光华²，高曙光²，张方杰²，曾超²，张凯²

¹湖南省娄底市中心医院骨科，湖南省娄底市 417000；²中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市 410013

收稿日期:2015-11-07 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
通讯作者: 雷光华，博士，教授，中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市 410013
作者简介:朱鹤远，男，1979年生，湖南省双峰县人，汉族，2012年中南大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨与关节研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(8120420、81272034、81373130、81501923)；湖南省自然科技基金(14JJ3032)

Osteopontin promotes the expression of aggrecan and type II collagen in osteoarthritic chondrocytes of the knee joint in vitro

Zhu He-yuan¹, Lei Guang-hua², Gao Shu-guang², Zhang Fang-jie², Zeng Chao², Zhang Kai²

¹Department of Orthopedics, Central Hospital of Loudi, Loudi 417000, Hunan Province, China; ²Department of Orthopedics, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China

Received:2015-11-07 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
Contact: Lei Guang-hua, M.D., Professor, Department of Orthopedics, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Zhu He-yuan, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Central Hospital of Loudi, Loudi 417000, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 8120420, 81272034, 81373130, 81501923; the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 14JJ3032

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨桥蛋白：骨桥蛋白是最早在骨组织中发现的一种非胶原性高度磷酸化和硫酸化的糖蛋白，相对分子质量44 000-75 000，骨桥蛋白可由成骨细胞、破骨细胞、活化的T细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、肌腱成纤维细胞、滑膜细胞等分泌产生，并可存在于多种组织中，如骨、肾脏、平滑肌和腺体上皮细胞等。骨桥蛋白，又称之为早期T细胞活化基因1(Eta-1)或分泌型磷蛋白(Spp1)，可与一系列细胞表面受体如整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5及CD44等结合后介导信号转导、促进细胞黏附和聚集、调节细胞-基质和细胞-细胞间反应，在骨组织代谢、炎性反应和感染性疾病的免疫调节中具有重要作用。

蛋白多糖：结缔组织基质中蛋白质与多糖以共价和非共价键相连构成多种巨大分子称为蛋白多糖或黏蛋白，是通过一个或多个共价键与硫酸软骨素、硫酸皮肤素等连接的核心蛋白。

背景：骨桥蛋白基因和蛋白表达与骨关节炎的病变程度高度相关。

目的：进一步验证骨桥蛋白对体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达的影响。

方法：体外培养人膝骨关节炎软骨细胞。取第1代人膝骨关节炎软骨细胞，分为空白对照组、0.1 mg/L骨桥蛋白组和1 mg/L骨桥蛋白组。骨桥蛋白组加入重组骨桥蛋白0.1 mg/L或1 mg/L干预48 h；空白对照组未予任何干预继续培养48 h。用Real-time PCR测量蛋白多糖与Ⅱ型胶原的mRNA表达量。

结果与结论：经0.1 mg/L与1 mg/L两种质量浓度骨桥蛋白干预后，人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖与Ⅱ型胶原mRNA表达水平显著上升(P < 0.05)，1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖与Ⅱ型胶原mRNA表达水平高于0.1 mg/L骨桥蛋白组(P < 0.05)，人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平与骨桥蛋白干预质量浓度呈正相关(r=0.751，P <0.01)。人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平与骨桥蛋白干预浓度呈正相关(r=0.676，P < 0.01)。结果提示骨桥蛋白上调人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖与Ⅱ型胶原mRNA的表达，并具有浓度依赖性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-1784-7887朱鹤远)(

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 骨桥蛋白, 骨关节炎, 蛋白多糖, Ⅱ型胶原, Real-time, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Osteopontin mRNA and protein expressions are highly correlated with the severity of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of osteopontin on the gene expression of aggrecan and type II collagen in
the human knee osteoarthritic chondrocytes in vitro.
METHODS: Chondrocytes were harvested from human osteoarthritic knees and cultured in vitro. The chondrocytes were cultured with 0 (blank control group), 0.1, 1 mg/L osteopontin, respectively, for 48 hours. Real-time PCR was employed to detect the mRNA expression of aggrecan and type II collagen.
RESULTS AND CONCLUSION: After 0.1 and 1 mg/L osteopontin intervention, the mRNA expression of aggrecan and type II collagen in osteoarthritic chondrocytes was increased significantly (P < 0.05), and the mRNA expression of aggrecan and type II collagen was higher in the 1 mg/L osteopontin group than the 0.1 mg/L osteopontin group (P < 0.05). In addition, the mRNA expression of aggrecan and type II collagen was positively correlated with the concentration of osteopontin (r=0.751, P < 0.01; r=0.676, P < 0.01). These findings indicate that osteopontin up-regulates the mRNA expression of aggrecan and type II collagen in osteoarthritic chondrocytes of human knee in vitro in a dose-dependent manner.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

朱鹤远，雷光华，高曙光，张方杰，曾超，张凯. 骨桥蛋白干预体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.004.

Zhu He-yuan, Lei Guang-hua, Gao Shu-guang, Zhang Fang-jie, Zeng Chao, Zhang Kai. Osteopontin promotes the expression of aggrecan and type II collagen in osteoarthritic chondrocytes of the knee joint in vitro [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.004.

图/表（结果） 5

2.1 人膝骨关节炎软骨细胞培养结果
2.1.1 人膝骨关节炎软骨细胞生长情况在倒置显微镜下，人膝骨关节炎软骨细胞在不同生长阶段呈现不同的生长特点：①原代骨关节炎软骨细胞分离后，悬浮于培养基中，呈大小均一的球形，单个或多个聚集，折光性较强(图1A)。②原代人膝骨关节炎细胞完成贴壁后，可见软骨细胞成团生长，以此为中心向四周扩散生长，软骨细胞多呈椭圆形、短梭形或三角形(图1B)。③第1代人膝骨关节炎软骨细胞分布较均匀，较少出现细胞团，形状多呈梭形或多角形等不规则形状，细胞间有伪足相连，细胞生长情况较好(图1C-E)。④骨桥蛋白干预48 h后，人膝骨关节炎软骨细胞多呈梭形或三角形，较少见伪足相(图1F)。

2.1.2 人膝骨关节炎软骨细胞鉴定结果 Ⅱ型胶原免疫组织化学显示：细胞的周围及胞浆出现棕黄色颗粒，证明有Ⅱ型胶原产生(图2)。

2.1.3 人膝骨关节炎软骨细胞存活率鉴定结果每个标本经过消化后，0.4%锥虫蓝染色后进行鉴定(图3)，原代骨关节炎软骨细胞存活率为(92.11±3.12)%。与文献报道相仿，符合进一步实验要求。

2.2 人膝骨关节炎软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达
检测RNA纯度A260/A280比值均在1.80-2.0之间表示纯度良好，可以用于下一步RNA反转录实验。
实验结果：以cDNA分别和3对引物进行Real time Q PCR反应，获得扩增曲线、熔解曲线，依据每例标本蛋白多糖、Ⅱ型胶原和β-actin的Ct值计算2-??Ct，其中??Ct=[样本A(目的基因CT值-内参基因CT值)-样本B(目的基因CT值-内参基因CT值)]，得出蛋白多糖和Ⅱ型胶原的相对mRNA值(表1)。

2.3 蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达与骨桥蛋白干预质量浓度相关性分析 ①与空白对照组相比，0.1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平(2.819±1.175倍)上升，两者之间差异有显著性意义(P < 0.05)。②与空白对照组相比，1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平(3.731±0.607)倍上升，两者之间差异有显著性意义(P < 0.05)。③0.1 mg/L骨桥蛋白组与1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平相比，两者之间差异有显著性意义(P < 0.05)，1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平高于0.1 mg/L骨桥蛋白组。④人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平与骨桥蛋白干预质量浓度呈正相关(r=0.751，P < 0.01)。⑤与空白对照组相比， 0.1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平[(2.886±0.658)倍]上升两者之间差异有显著性意义(P < 0.05)。⑥与空白对照组相比，1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平[(4.725±2.895)倍]上升，两者之间差异有显著性意义(P < 0.05)。⑦0.1 mg/L骨桥蛋白组与1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平相比，两者之间差异有显著性意义(P < 0.05)，1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平高于0.1 mg/L骨桥蛋白组。⑧人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平与骨桥蛋白干预质量浓度呈正相关(r=0.676，P < 0.01)。见图4。

参考文献

[1] Goldring MB, Goldring SR.Osteoarthritis.J Cell Physiol. 2007; 213(3):626-634.

[2] Sodek J,Ganss B,McKee MD.Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med.2000;11(3):279-303.

[3] Ohshima S,Yamaguchi N,Nishioka K,et al.Enhanced local production of osteopontin in rheumatoid joints. J Rheumatol. 2002;29(10):2061-2067.

[4] McKee MD,Glimcher MJ,Nanci A.High-resolution immunolocalization of osteopontin and osteocalcin in bone and cartilage during endochondral ossification in the chicken tibia. Anat Rec.1992;234(4):479-492.

[5] Pullig O,Weseloh G,Gauer S, et al. Osteopontin is expressed by adult human osteoarthritic chondrocytes: protein and mRNA analysis of normal and osteoarthritic cartilage. Matrix Biol.2000;19(3):245-255.

[6] Attur MG, Dave MN, Stuchin S, et al.Osteopontin: an intrinsic inhibitor of inflammation in cartilage. Arthritis Rheum. 2001; 44(3):578-584.

[7] Cheng C, Gao S, Lei G. Association of osteopontin with osteoarthritis. Rheumatology international 2014;34(12): 1627-1631.

[8] Gao SG, Cheng L, Zeng C, et al. Usefulness of specific OA biomarkers, thrombin-cleaved osteopontin, in the posterior cruciate ligament OA rabbit model. Osteoarthritis Cartilage. 2013;21(1):144-150.

[9] Yagi R, McBurney D, Laverty D, et al. Intrajoint comparisons of gene expression patterns in human osteoarthritis suggest a change in chondrocyte phenotype.J Orthop Res.2005;23(5): 1128-1138.

[10] Yamaga M,Tsuji K, Miyatake K,et al.Osteopontin level in synovial fluid is associated with the severity of joint pain and cartilage degradation after anterior cruciate ligament rupture. PloS one.2012;7(11):e49014

[11] Gao SG, Li KH, Zeng KB, et al. Elevated osteopontin level of synovial fluid and articular cartilage is associated with disease severity in knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18(1):82-87.

[12] Matsui Y, Iwasaki N, Kon S, et al. Accelerated development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis in osteopontin-deficient mice.Arthritis Rheum.2009;60(8):2362- 2371.

[13] Scher JU, Pillinger MH, Abramson SB.Nitric oxide synthases and osteoarthritis. Curr Rheumatol Rep.2007;9(1):9-15.

[14] Martinek V.Anatomy and pathophysiology of articular cartilage.Dtsche Z Sportmed.2003;54(6):166-170.

[15] Jiang W,Lei G,Lin B,et al. Effect of osteopontin on expression of matrix metalloproteinase 13 in human knee osteoarthritic chondrocytes. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2014;28(11):1342-1345.

[16] Xu M,Zhang L,Zhao L,et al. Phosphorylation of osteopontin in osteoarthritis degenerative cartilage and its effect on matrix metalloprotease 13. Rheumatol Int. 2013;33(5):1313-1319.

[17] Yumoto K, Ishijima M, Rittling SR, et al. Osteopontin deficiency protects joints against destruction in anti-type II collagen antibody-induced arthritis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A.2002;99(7):4556-4561.

[18] Petrow PK, Hummel KM, Schedel J, et al. Expression of osteopontin messenger RNA and protein in rheumatoid arthritis: effects of osteopontin on the release of collagenase 1 from articular chondrocytes and synovial fibroblasts. Arthritis Rheum. 2000;43(7):1597-1605.

[19] Takahashi K, Goomer RS, Harwood F, et al. The effects of hyaluronan on matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), interleukin- 1beta(IL-1beta), and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) gene expression during the development of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage.1999;7(2):182-190.

[20] Zheng W, Li R, Pan H, et al. Role of osteopontin in induction of monocyte chemoattractant protein 1 and macrophage inflammatory protein 1beta through the NF-kappaB and MAPK pathways in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum.2009;60(7):1957-1965.

[21] Cheung HS. Calcium crystal effects on the cells of the joint: implications for pathogenesis of disease. Curr Opin Rheumatol. 2000;12(3):223-227.

[22] Ledingham J, Regan M, Jones A, et al. Radiographic patterns and associations of osteoarthritis of the knee in patients referred to hospita.Ann Rheum Dis. 1993;52(7):520-526.

[23] Nalbant S, Martinez JA, Kitumnuaypong T, et al. Synovial fluid features and their relations to osteoarthritis severity: new findings from sequential studies. Osteoarthritis Cartilage. 2003; 11(1):50-54.

[24] Martínez-Calleja A,Velasquillo C,Vega-López M, et al. Osteopontin expression and localization of Ca++ deposits in early stages of osteoarthritis in a rat model. Histology and histopathology.2014;29(7):925-933.

[25] Rosenthal AK, Gohr CM, Uzuki M, et al. Osteopontin promotes pathologic mineralization in articular cartilage. Matrix Biol.2007;26(2):96-105.

[26] Attur MG, Dave MN, Clancy RM, et al. Functional genomic analysis in arthritis-affected cartilage: yin-yang regulation of inflammatory mediators by alpha 5 beta 1 and alpha V beta 3 integrins. J Immunol.2000;164(5):2684-2691.

引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2011年11月至2012年4月在中南大学医学遗传学国家重点实验室完成。

1.3 材料 HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅(上海南阳仪器有限公司)DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；S2一93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；Motie B5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)；恒温振荡培养箱(哈尔滨东联电子公司)；深低温冰箱(青岛海尔公司)；JY3002型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ABI 7900 PCR仪(ABI公司)；高速低温离心机(美国Bermen公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；OD检测仪(ABI公司)；0.05%胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培养基、双抗生素液(青霉素．链霉素)、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶(GIBICO公司)；锥虫蓝(Sigma公司)；Recombinant Human Ostepontin(R&D Systems公司)；一抗：Ⅱ型胶原抗体 (Abcam公司)；二抗：羊抗兔IgG/HRP(TIANGEN公司)；RNA反转录试剂盒、Real time Q PCR试剂盒(Fermentas公司)；引物合成(上海生工生物工程公司)； TRIZOL试剂(美国invitrogen公司)。

1.3.1 PBS配置方法分别称取KCl 0.2 g，KH₂PO₄ 0.2 g，NaCl 8 g，Na₂HPO₄•12H₂O 2.08 g，将其溶于900 mL双蒸水，再用盐酸/氢氧化钠调节pH值7.4左右，用双蒸水定容使液体总容积至1 L。高温高压灭菌，然后在常温下保存备用。

1.3.2 实验标本来源所有人膝骨关节炎软骨标本均取自湘雅医院患原发性骨关节炎的住院患者，收集行人工关节置换术中关节截骨的软骨。采用中华医学会骨科学分会制定的《骨关节炎诊治指南(2007版)》中的膝骨关节炎诊断标准纳入骨关节炎患者。共纳入患者14例16膝，其中男性4例，女性10例，年龄48-73岁，平均年龄(64±6)岁。标本取材于每例标本中关节面骨外露区边缘的软骨退变区，共计16份。人膝骨关节炎软骨标本的取材均先告知患者并征得同意。

1.4 实验方法

1.4.1 人膝骨关节炎细胞的分离与培养人膝骨关节炎软骨细胞的分离采用Ⅱ型胶原酶一步消化法：①收集标本后，将标本立即置于盛有PBS的无菌培养皿中，带到超净工作台进行操作。②去除关节周围附着的各种软组织，再次用PBS将标本冲洗2次，洗净标本。③用20号手术无菌刀片在上述标本上削去表面的薄层软骨，然后在软骨退化磨损严重区的边缘过渡区削取软骨片，大小为15-20 mm²。④再次用5 mL PBS漂洗削取下的软骨片，然后用眼科剪将软骨片剪成大小为1 mm×1 mm×1 mm碎块。⑤收集剪好的软骨碎块置于15 mL离心管中，并加入0.15%的Ⅱ型胶原酶(DMEM/F-12配置)，加入容积约为软骨组织体积的10倍。⑥将离心管置于恒温振荡箱(37 ℃，80 r/minxc)内，消化4-6 h后，可观察到消化液变浑浊，软骨组织基本消失。

1.4.2 人膝骨关节炎软骨细胞的收获和计数 ①待上述消化完成后，1 000 r/min离心8 min，弃上清液。②加入5 mL完全培养基(DMEM/F12含体积分数10%FBS)，充分吹打混匀，即可获得人膝骨关节炎软骨细胞的悬浮液。③取9滴上述人膝骨关节炎软骨细胞悬浮液加入到EP管中，并滴加1滴锥虫蓝(0.4%)，充分混匀，然后取7 μL液体于细胞计数板上，计算细胞的总数及其活力。④按1×10⁸ L^-1细胞浓度将人膝骨关节炎软骨细胞接种于25 cm²培养瓶内(4 mL/瓶)，然后将培养瓶置于37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱进行培养。⑤ 2 d后即更换培养液，然后每3-5 d换液1次，并倒置显微镜观察人膝骨关节炎软骨细胞形态和生长情况，照相并记录。

1.4.3 人膝骨关节炎软骨细胞鉴定取第1代人膝骨关节炎软骨细胞，采用Ⅱ型胶原染色法，对爬片的人膝骨关节炎软骨细胞染色鉴定。

1.4.4 实验分组取体外培养第1代人膝骨关节炎软骨细胞进行实验，先予以含体积分数5%FBS的DMEM/F12孵育24 h，从而使人膝骨关节炎软骨细胞同步化出现在非增殖期和非活动期。然后再继续给予含体积分数10%FBS的DMEM/F12完全培养基孵育。

骨桥蛋白干预48 h分组：空白对照组；0.1 mg/L骨桥蛋白组予以0.1 mg/L骨桥蛋白，干预48 h；1 mg/L骨桥蛋白组予以1 mg/L骨桥蛋白，干预48 h。

1.4.5 人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达实时荧光定量PCR检测分别干预48 h后，参考TRIzol试剂盒说明提取人膝骨关节炎软骨细胞的RNA并鉴定其纯度及完整性，根据Genbank 的序列设计引物探针，蛋白多糖上端引物为5’-CCT GGT GTG GCT GCT GTC-3上端引物为5’-CTG GCT CGG TGG TGA ACT C-3’，Ⅱ型胶原上端引物为5’-GGC AGA GGT ATA ATG ATA AGG-3’ 下端引物为5’-ATT ATG TCG TCG CAG AGG-3’ β-actin为参照，将1 μgRNA加入反转录体系合成CDNA，置于-20 ℃保留，取1 μL CDNA模板加入PCR扩增反应体系中，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，循环40次，计算Aggrecan/β-actin及Ⅱ型胶原/β-actin相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①人膝骨关节炎软骨细胞生长情况。②人膝骨关节炎软骨细胞鉴定结果。③人膝骨关节炎软骨细胞存活率鉴定结果。④人膝骨关节炎软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达。

1.6 统计学分析实验数据均采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，所有试验数据以x(_)±s表示，采用独立样本t 检验和单样本t 检验分析分别进行两组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义，采用相关分析分析蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达与骨桥蛋白干预质量浓度的相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

Ohshima等^[3]证实，骨关节炎患者关节滑膜细胞分泌骨桥蛋白明显高于健康人，且骨关节炎患者关节液中骨桥蛋白高表达，但血浆中骨桥蛋白水平与健康人相比无明显改变，Yaki等^[9]研究发现，严重退变骨关节炎软骨骨桥蛋白mRNA的水平高于较轻度退变骨关节炎软骨。有研究发现：骨关节炎患者滑液及关节软骨骨桥蛋白表达均明显高于与对照者，骨关节炎关节滑液骨桥蛋白水平与关节软骨骨桥蛋白表达呈正相关^[10]，骨关节炎患者关节滑液骨桥蛋白水平与骨关节炎关节放射学KL分级呈正相关，骨关节炎患者关节软骨中骨桥蛋白表达与关节软骨Mankin病理评分呈正相关，骨关节炎关节软骨骨桥蛋白的表达与骨关节炎病变程度呈正相关^[11]。提示关节软骨、滑膜和滑液中骨桥蛋白的高表达与骨关节炎病理改变高度相关，但其是作为一种前因还是后果目前尚有争论。

本研究证实：骨桥蛋白可上调人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA的表达。推测骨桥蛋白可能通过上调软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达，来不断弥补蛋白多糖的丢失和Ⅱ型胶原的崩解以及骨关节炎软骨细胞凋亡所导致的蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成不足，提示骨桥蛋白可能在阻止骨关节炎软骨退变的机制中起重要作用，这与Matsui等^[12]的报道一致。Matsui等^[12]在年龄相关与关节不稳的大鼠骨关节炎模型中采用骨桥蛋白基因敲除的研究显示：骨桥蛋白的缺失加重年龄相关与关节不稳所致骨关节炎，骨桥蛋白的缺失加快软骨组织的结构改变，使蛋白多糖的丢失增加，骨桥蛋白的缺失也诱导基质金属蛋白酶13的产生，而基质金属蛋白酶13可以降解软骨基质的主要成分：Ⅱ型胶原，蛋白多糖的损失及胶原降解酶基质金属蛋白酶13的诱导共同促使骨关节炎的病情发展。提示骨桥蛋白在防止骨关节炎的进展起重要作用，是一个潜在防止软骨退变的分子^[12]。

以往的研究证实白细胞介素1β可诱导基质金属蛋白酶和蛋白聚糖酶表达，还可以通过刺激一氧化氮、前列腺素E2的产生来维持和促进炎症的过程，软骨中的炎症因子不仅介导炎症，而且有助于改变软骨细胞的表型及软骨基质的结构，一氧化氮对软骨细胞产生多种影响，包括抑制胶原与蛋白多糖的合成，激活金属蛋白酶，通过其他氧化剂如过氧化氢增加其对损伤的敏感性，促进细胞凋亡，从而促进关节软骨退变^[13]，基质金属蛋白酶、蛋白聚糖酶可降解软骨细胞外基质。推测骨桥蛋白可能通过下调骨关节炎软骨细胞促炎细胞因子白细胞介素1、一氧化氮、前列腺素E2的表达来促进软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达并且阻止关节软骨退变。

本研究结果还显示：人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA的表达与骨桥蛋白干预浓度呈正相关。曾有研究发现骨关节炎关节软骨骨桥蛋白的表达与骨关节炎病变程度呈正相关^[12]，随骨关节炎的病变程度的加剧，骨关节炎软骨中骨桥蛋白的表达随之增高，则有可能骨关节炎软骨细胞代偿性蛋白多糖和Ⅱ型胶原的产生也随之增加。有文献报道骨关节炎软骨的自身修复通过蛋白多糖和Ⅱ型胶原的产生能够阻止骨关节炎的发展数年，但表层的软骨细胞不能完全代偿蛋白多糖的丢失，最终修复不能满足基质降解酶的高表达和活化所致的退变，结果软骨完全丢失^[14]。所以，骨桥蛋白可能通过蛋白多糖和Ⅱ型胶原的产生来修复退变的骨关节炎软骨，虽然其不能完全阻止软骨的退变的进程，但可能在延缓骨关节炎软骨退变中起重要作用。

多效性蛋白骨桥蛋白，在关节软骨中的作用可能十分复杂，除了上述可能的保护作用外，同时可能也通过其他途径有加速退变的效应。有研究发现骨桥蛋白上调人骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶的基因与蛋白表达^[15-16]，骨桥蛋白在类风湿性关节炎中主要作为一种促炎症分子，加速软骨损伤，Ⅱ型胶原抗体诱导类风湿性关节炎模型鼠研究显示，骨桥蛋白经促进血管生成和诱导软骨细胞凋亡在类风湿性关节炎软骨损伤中起重要作用^[17]。还有研究表明类风湿性关节炎滑膜衬里层成纤维细胞产生的骨桥蛋白和侵入软骨中的骨桥蛋白不但调节滑膜衬里层成纤维细胞黏附于软骨，而且通过刺激关节软骨中胶原酶的分泌促进基质的降解^[18]。类风湿性关节炎中骨桥蛋白可以选择性诱导促炎性细胞因子和趋化因子表达而促进炎性细胞迁移和聚集^[19]。Zheng^[20]发现在类风湿性关节炎中骨桥蛋白通过NF-kappaB 和 MAPK信号通路(包括激活IKKbeta、p38和JNK)而介导细胞因子的表达，在白细胞迁移中起到特殊的作用。病理状态下的基质矿化在骨关节炎中非常常见，双水焦磷酸钙和羟基磷灰石样磷酸钙结晶均存在骨关节炎关节中，体外实验发现，含钙结晶诱导滑膜细胞和关节软骨细胞释放分解代谢因子和蛋白酶^[21]，临床上含钙结晶的出现提示关节损害程度的增加和更快的关节破坏^[22-24]，有实验证明，软骨细胞外基质中骨桥蛋白与双水焦磷酸钙的沉积相邻并与活化的转谷氨酰胺酶靠近；体外培养的软骨细胞的实验显示，骨桥蛋白刺激ATP所诱导的双水焦磷酸钙晶体形成，骨桥蛋白可能在关节软骨的双水焦磷酸钙结晶的形成起重要作用^[25]。推测骨桥蛋白促进关节软骨病理矿化可能为骨桥蛋白致关节退变的一重要机制。

骨桥蛋白的多效性功能，可能和骨桥蛋白与细胞不同受体结合后活化不同的信号通路，影响软骨的合成与分解代谢有关，有关节炎软骨功能性基因分析研究证实，α5β1和αvβ3整合素正负调节关节炎软骨炎性递质，骨桥蛋白和其受体整合素的结合分别很大程度上影响着软骨细胞的功能，用LM609(类似骨桥蛋白的拮抗剂)结合αvβ3模拟骨桥蛋白的功能可下调白细胞介素1β、一氧化氮和前列腺素E2，此研究证实整合素存在交互信号机制，并显示整合素介导从“外”向“内”和从“内”向“外”信号，很可能影响软骨细胞代谢，其反常调节可能在骨关节炎的病理机制中起重要作用^[26]。此研究提示，骨关节炎软骨细胞表面整合素αvβ3是骨桥蛋白优先结合的配体，骨桥蛋白与αvβ3结合后导致炎症因子下调，从而抑制软骨细胞凋亡，促进软骨细胞外基质的产生、抑制软骨的降解，可能是骨桥蛋白调节软骨退变的主要机制。

总之，实验证实骨桥蛋白上调骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达，并且人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达与骨桥蛋白干预质量浓度呈正相关，从骨桥蛋白对骨关节炎软骨细胞的基质产生的调节方面，初步阐述骨桥蛋白在骨关节炎软骨退变中的功能作用，为骨关节炎的防止提供了新的理论依据。

此次实验设计的骨桥蛋白最高干预质量浓度为1 mg/L，蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达在何种浓度达到峰值？人骨关节炎膝关节中的骨桥蛋白质量浓度一般为156-10 000 ng/L，此质量浓度对软骨细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达是否有影响和影响如何仍不清楚。实验干预的时间为48 h，随着干预的时间延长，骨桥蛋白对软骨细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达的进一步影响也不明确。本实验采用的是全长骨桥蛋白，裂解的骨桥蛋白片段对软骨细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达的影响也不明确，影响软骨细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达的机制有待于进一步探讨。

结论：①骨桥蛋白上调人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA的表达，人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mRNA表达水平与骨桥蛋白干预质量浓度呈正相关。②骨桥蛋白上调人膝骨关节炎软骨细胞的Ⅱ型胶原mRNA的表达，人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平与骨桥蛋白干预浓度呈正相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨桥蛋白干预体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达

Osteopontin promotes the expression of aggrecan and type II collagen in osteoarthritic chondrocytes of the knee joint in vitro

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[2]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[3]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[4]	刘欣, 颜飞华, 洪坤豪. 调控水通道蛋白表达延缓膝骨关节炎模型大鼠软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 668-673.
[5]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[6]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[7]	曹旭含, 白子兴, 孙承颐, 杨艳军, 孙卫东. “乳香-没药”治疗膝骨关节炎网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 746-753.
[8]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[9]	宋珊, 胡方媛, 乔军, 王佳, 张升校, 李小峰. 基于生物信息学途径认识骨关节炎滑膜的生物学标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 785-790.
[10]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[11]	郑力, 李大地, 胡维帆, 唐金龙, 赵凤朝. 单侧全膝关节置换后对侧膝关节置换的风险评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 374-379.
[12]	刘金富, 曾平, 农焦, 范思奇, 冯程钦, 黄佳兴. 整合多组微阵列芯片分析骨关节炎患者滑膜中生物标志物和治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3690-3696.
[13]	陈锋, 章晓云, 陈跃平, 廖建钊, 李嘉骏, 宋世雷, 赖渝. 淫羊藿苷元治疗骨关节炎分子机制的网络药理学和生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3704-3710.
[14]	杨威, 陈泽华, 易志勇, 黄旭东, 韩清民, 张荣华. 关节腔内注射透明质酸与安慰剂治疗早中期膝骨关节炎的疗效差异：基于随机、双盲、对照、临床试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3760-3766.
[15]	罗安玉, 刘瀚霖, 谢小飞, 黄琛. 抗氧化合剂对膝骨关节炎模型大鼠结构性退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3625-3629.