脂肪组织来源干细胞构建皮肤复合组织修复创面缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.002

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文题释义：

脂肪组织来源干细胞：是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。脂肪组织来源干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植。

创面缺损：皮肤是机体的第一道免疫屏障，皮肤缺损后皮下的组织得不到保护，一般6-8 h会出现创面污染，但是如果创面污染严重或细菌毒性强，当细菌浓度达到1×10⁶/g组织时易形成细菌种植感染，在4-6 h即可变成感染，继之导致感染、组织坏死，甚至最终往往导致截肢的严重后果。临床上对四肢皮肤缺损，特别是合并感染的创面研究较多。

背景：皮下脂肪及干细胞对创面愈合的效果尚未确定。

目的：探索脂肪组织来源干细胞构建皮肤复合组织及修复皮肤缺损的效果。

方法：采用表皮细胞、成纤维细胞、脂肪组织来源干细胞作为种子细胞，并且以牛胶原凝胶作为支架能够构建多种细胞复合物。在大鼠背部两侧建立直径为6 mm的圆形皮肤创面模型，右侧(实验侧)创面缺损部位植入直径为8 mm的多层复合组织，左侧(对照侧)进行简单的创面包扎修复。

结果与结论：①构建的多层皮肤复合组织表皮层连续并成复层，真皮层成纤维细胞分布均匀，而脂肪层则含有脂滴空泡，且细胞分布均匀，在不同层交界处存在明显的细胞聚集。②实验侧创面愈合率、肉芽组织厚度、真皮层厚度以及毛细血管密度显著高于对照侧。③结果显示采用表皮细胞、成纤维细胞、脂肪组织来源干细胞作为种子细胞，以牛胶原凝胶作为支架，能够构建出具有多种细胞的多层皮肤复合组织，修复大鼠创面缺损有促进创面的愈合提高真皮层厚度的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-3920-1283(彭希亮)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 皮肤复合组织, 脂肪组织, 皮肤缺损, 修复, 全厚皮片, 创面愈合, 真皮

Abstract:

BACKGROUND: There is no clear understanding on the effects of subcutaneous fat and stem cells on wound healing.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic effects of skin composite prepared with adipose tissue-derived stem cells on skin defects.
METHODS: Epidermal cells, fibroblasts, adipose tissue-derived stem cells as seed cells and bovine collagen gel as a scaffold were used to build a complex with a variety of cells. A 6-mm diameter circular skin defect was made on the both sides of the rat back. The right side as experimental side was implanted with an 8-mm diameter multilayer skin composite, and the left side (control side) was only treated with a simple dressing.
RESULTS AND CONCLUSION: For the constructed multi-layer skin composite, the epidermal layer was continuously merged into the multi-layer, the fibroblasts evenly distributed in the corium layer, and lipid droplets existed in the fat layer in which the cells distributed uniformly. Cell aggregation was obviously observed at the junction of different layers. In the experimental side, the rate of wound healing, granulation tissue thickness, the thickness of dermis and the capillary density were significantly higher than those in the control side. Taken together, we can construct multilayer skin composites with a variety of cells as seed cells, such as epidermal cells, fibroblasts and adipose tissue-derived stem cells, and bovine collagen gel as a scaffold, which promote wound healing and increase the thickness of dermis.

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图/表（结果） 4

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引言

烧伤、创伤等均会造成皮肤发生严重的缺损，影响患者美观及生活质量。对于皮肤缺损临床研究主要集中在：①如何采取有效的措施促进创面愈合，减少瘢痕形成。②如何解决皮肤再生问题。③研发具有自体皮功能的皮肤代替物。近年来，随着医疗技术的飞速发展，组织工程化皮肤已经成为当前皮肤组织修复中研究的方向。

从1975年Rheimvald和Green等第一次大规模培养出表皮细胞获得组织工程皮肤代替物^[1]。当前，组织工程皮肤替代物依解剖结构可分为表皮替代物、真皮替代物以及表皮/真皮复合皮替代物3种。表皮替代物缺乏真皮的机械支持和营养，创面愈合后上皮瘢痕增生严重，抗感染能力差、易破溃、弹性欠佳、柔软度不足、移植后易脱失，修复效果难以令人满意^[2]。而真皮替代物虽可减少创面收缩，对创面要求不高，但缺少表皮的防护，使感染概率升高，同时缺少表皮覆盖易造成体内水电解质代谢紊乱，真皮替代物修复后外观欠佳，尤暴露部位明显^[3]。表皮/真皮复合皮替代物在化学行为及代谢方面均类似于人正常皮肤，具有良好的机械性能和移植物接受率^[4]。在创面愈合过程中，由于细胞外间质-表皮的相互作用，复合皮移植物可缩短真皮有机化合成时间、抑制瘢痕形成，促进皮肤再生，是目前较成熟的双层组织工程皮肤替代物，可达到永久性修复创面的目的^[5-6]。

有人将前脂肪细胞悬液植入Matriderm支架上构建皮下含脂肪层的多层皮肤复合组织，结果显示该支架能够促进皮肤缺损创面的修复，并且能够获得良好的美容效果^[7]。也有实验采用大鼠的脂肪组织切片作为皮下脂肪层，构建了以脂肪组织来源干细胞为截止的皮肤复合组织^[8-10]。脂肪组织来源干细胞在皮肤复合组织中的构建是一个相对复杂的过程，其关键环节是如何构建组织工程化脂肪，并且选择合适的生物支架等，既往对于这些问题有所研究，但是并没有获得理想的解决方法和统一的结论，导致这些核心问题在以往的研究中并没有获得实质性进展^[11-12]。文章拟探索大鼠脂肪组织来源干细胞构建的皮肤复合组织修复皮肤缺损创面的效果。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年2至9月在郑州大学附属郑州中心医院完成。

1.3 材料清洁级Wistar大鼠10只，鼠龄6个月，雌雄不限，体质量0.13-0.35 kg，平均(0.26±0.01) kg，由郑州大学附属郑州中心医院动物实验中心提供。

实验中对大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》中相关规则，实验均经过医院相关动物伦理委员会批准同意。

1.4 方法

1.4.1 脂肪组织来源干细胞分离及培养取10 mL大鼠脂肪抽吸物(Sigma公司)，1 000 r/min离心3 min，取上部分黄色脂质，剔除血管及结缔组织，PBS冲洗，Ⅰ型胶原酶裂解红细胞，放入培养箱中培养。当脂肪组织来源干细胞生长融合超过80%时加入0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)及0.03%EDTA(美国Gibco公司)消化，传代培养，取第3代脂肪组织来源干细胞定向诱导分化^[13-14]。

1.4.2 成纤维细胞分离及培养将上述步骤中获得的大鼠脂肪组织采用含青霉链霉素和二性霉素B的PBS冲洗，剪去皮下组织，并利用镊子撕掉表皮，用Ⅰ型胶原酶消化。当成纤维细胞生长融合达到80%时弃除培养液，并采用PBS洗涤，加入0.25%胰蛋白酶及0.03%EDTA消化， 1 200 r/min离心5 min，待原代细胞融合80%时，传代培养^[15-16]。

1.4.3 表皮细胞的分离将1.4.2中剪去的皮下组织以PBS冲洗，加入0.25%胰蛋白酶消化30 min，100目筛网(Orange公司)过滤后，1 000 r/min离心10 min，采集细胞备用。

1.4.4 多层皮肤复合组织制备取5×10⁸ L^-¹第3代脂肪组织来源干细胞、2.78×10⁷ L^-¹成纤维细胞以及1.0×10⁸ L^-¹表皮细胞，分别与牛胶原凝胶(HyClone公司)充分混合获得相应单皮肤组织，并根据正常皮肤结构顺序进行组织，培养3 d后获得多层皮肤复合组织^[17]。采用镊子取小块多层皮肤复合组织行苏木精-伊红染色，在显微镜(上海蒲柘光电仪器有限公司)镜下观察。

1.4.5 皮肤创面模型的建立所有大鼠背部两侧建立皮肤创面模型。大鼠以水合氯醛麻醉，保持俯卧姿势，画出直径为6 mm的圆形设计线，采用剪刀沿着设计线除去全厚皮肤，建立大鼠模型(图1)^[18]。

1.4.6 创面修复大鼠背部右侧为实验侧，左侧为对照侧。大鼠造模7 d后进行创面修复，对照侧采用碘伏清洁伤口后进行简单的包扎创面修复，采用凡士林进行包扎。实验侧在创面部位采用碘伏清洁伤后在创面缺损部位植入直径为8 mm的多层复合组织，碘伏清洁伤口^[19-20]。

1.4.7 创面观察在造模后3，4，5，10 d，采用数码相机记录创面情况，采用游标卡尺(上海焮嵘液压件制造有限公司)对创面愈合情况大小进行测量，并计算创面愈合率。创面愈合率=(最初创面大小-未愈合创面大小)/最初创面大小×100%^[21]。

1.4.8 创面组织观察造模7 d后，采用显微镜观察大鼠两侧创面组织肉芽组织厚度、真皮层厚度以及毛细血管密度。

1.4.9 苏木精-伊红染色造模7 d后，取1只大鼠，采集背部两侧创面组织，进行石蜡切片3 mm，并采用苏木精染色2 min，蒸馏水冲洗1 min，体积分数1%盐酸乙醇分化，伊红染色2 min，常规脱水，中性树胶封固，光镜下观察^[22]。

1.5 主要观察指标多层皮肤组织形态及大鼠缺损部位创面愈合情况。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示。采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，以LSD法进一步两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

皮肤替代物是皮肤创面修复中常用的一种方法，它属于是一种可以促进创面愈合的材料^[23-24]。皮肤替代物是一组能封闭伤口的异种材料，依材料性质的不同，分为暂时性或永久性皮肤替代物。临床上，在使用标本治疗方法无法取得满意疗效时，皮肤替代物可代替标准疗法覆盖伤口。按解剖结构，组织工程皮肤替代物可分为表皮替代物、真皮替代物以及表皮/真皮复合皮替代物3种^[25-26]。Groeber等^[27]从移植类型、细胞来源、生物材料及使用寿命等方面分别总结归纳了己商品化的3种皮肤替代物。表皮替代物缺乏真皮的机械支持和营养，创面愈合后上皮瘢痕增生严重，抗感染能力差、易破溃、弹性欠佳、柔软度不足、移植后易脱失，修复效果难以令人满意。真皮替代物虽可减少创面收缩，对创面要求不高，但缺少表皮的防护，使感染机率升高，缺少表皮防护也易造成体内水电解质代谢紊乱，真皮替代物修复后外观欠佳，尤暴露部位。复合皮具有良好的机械性能和移植物接受率，在创面愈合过程中，由于间充质-表皮的相互作用，复合皮移植物可缩短真皮机化时间、抑制瘢痕形成，促进皮肤再生。表皮/真皮复合皮替代物在化学行为及代谢方面均类似于人正常皮肤，是目前较成熟的双层组织工程皮肤替代物，复合皮替代物可达到永久性修复创面的目的^[28-29]。当前，构建真皮替代物中使用较多的细胞为成纤维细胞，此次实验采用表皮细胞、成纤维细胞、脂肪组织来源干细胞作为种子细胞，不仅能够获得免疫率较高的纤维细胞，并且所获得的多组织具有高度的增殖活性，传代后能够获得更加纯净的细胞。本实验构建的多层皮肤复合组织表皮层连续并成复层，真皮层成纤维细胞分布均匀，而脂肪层则含有脂滴空泡，且细胞分布均匀，在不同层交界处存在明显的细胞聚集。此外，收缩是真皮替代物最大的特征，它主要是胫骨成纤维细胞产程的内生力介导形成，它与种植细胞的密度呈现出正相关，与胶原浓度则呈现出反相关，研究中获得的多种细胞的复合物能够在一定程度上提高组织的机械性能^[30-31]。

将获得的脂肪来源组织干细胞修复在大鼠的背部创面后，创面出现明显的收缩，并且能够形成较小的瘢痕，并且能够获得比较成熟的血管^[32]。通过移植真皮替代物能够获得较厚的表皮层和血管，其原因可能和成纤维细胞促进表皮细胞增殖，且该真皮替代物能够分泌血管内皮生长因子等，促进血管内皮细胞增殖；同时，该真皮替代物移植后能够迅速血管化，提高创面的抗感染能力，从而能够缩短创面的愈合时间，促进创面组织修复^[33-34]。实验大鼠背部实验侧创面愈合率、肉芽组织厚度、真皮层厚度以及毛细血管密度显著高于对照侧。

综上所述，采用表皮细胞、成纤维细胞、脂肪组织来源干细胞作为种子细胞，并且以牛胶原凝胶作为支架能够构建出具有多种细胞的复合物，能够促进创面的愈合，提高真皮层的厚度，具有重要的研究意义和价值。