壳聚糖-胶原角膜修复材料的制备及生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：将胶原和壳聚糖按一定比例制成复合膜后，能够降低壳聚糖的正电荷，改善壳聚糖的吸附力，促进细胞的黏附生长、迁移和增殖，增强壳聚糖的生物学性能，成为十分优良的生物材料。
目的：制备壳聚糖-胶原复合膜，观察其与角膜基质层的组织相容性。
方法：制作壳聚糖-胶原复合膜材料。将16只新西兰兔随机分为两组，实验组于右眼角膜基质袋内植入壳聚糖-胶原复合膜，对照组右眼角膜基质袋内植入壳聚糖膜。移植后进行裂隙灯显微镜、前节-光学相干断层成像及组织学观察。
结果与结论：①裂隙灯显微镜：移植后第8周，实验组膜片中央出现降解浸润，皱褶屈曲不明显；对照组膜片全部浸润，皱褶屈曲明显。②前节-光学相干断层成像：移植后第6周，实验组的复合膜边界模糊，密度与正常角膜组织很接近，角膜形态恢复正常。③组织学观察：移植后第8周，实验组膜片表层少量降解，降解材料与角膜基质融合，膜片周围角膜基质有少量炎性细胞浸润；对照组膜片表层降解程度大于实验组，降解物质与角膜基质交织融合，膜片周围角膜基质有较多炎性细胞浸润。表明壳聚糖-胶原复合膜具有可降解性和良好的组织相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料材料相容性, 角膜修复材料, 壳聚糖-胶原复合膜, 壳聚糖, 制备

Abstract:

BACKGROUND: The collagen and chitosan composite membrane made at a certain percentage can reduce the positive charge of chitosan, improve the adsorption force of chitosan, promote the cell adhesion and growth, migration and proliferation, and enhance the biological properties of chitosan, which has become a very excellent biological material.
OBJECTIVE: To prepare chitosan-collagen composite membrane and observe its histocompatibility with corneal stroma layer.
METHODS: Chitosan-collagen composite membrane was prepared. Totally 16 New Zealand rabbits were randomly divided into experimental and control groups. The chitosan-collagen composite membrane was implanted into right eye cornea stroma bag in the experimental group, and the chitosan membrane was implanted into right eye cornea stroma bag in the control group. The slit lamp microscope, anterior segment optical coherence tomography and histological observation were conducted after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Slit lamp microscope observation results showed that after 8 weeks of transplantation, degradation infiltration was visible in the center of the diaphragm, crease buckling was not obvious in the experimental group; the diaphragm was infiltrated completely and crease buckling was notable in the control group. The anterior segment optical coherence tomography results showed that at the 6th week after
transplantation, the composite membrane boundary was fuzzy, its density was very close to the normal corneal tissue, and the corneal shape recovered to normal in the experimental group. The histological findings showed that after 8 weeks of transplantation, in the experimental group, the membrane surface was degraded a little; biodegradable materials were fused with the corneal stroma; there were a small amount of inflammatory cells infiltrated on the corneal stroma around the iris. In the control group, the membrane degradation was greater than that of the experimental group; degradable substances intertwined and fused with corneal stroma; there were more inflammatory cells infiltrated on the corneal stroma around the iris. These results demonstrate that chitosan-collagen composite membrane has degradability and good histocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

中图分类号:

R318

杜倩. 壳聚糖-胶原角膜修复材料的制备及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(52): 8433-8437.

Du Qian. Preparation and biocompatibility of chitosan-collagen corneal repair materials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(52): 8433-8437.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 16只兔均进入结果分析。

2.2 裂隙灯显微镜观察结果植入后第1天，两组动物均有球结膜充血、前房闪辉。

植入后第4天，两组球结膜充血减轻，前房闪辉减少。植入后第1周，两组球结膜充血和前房闪辉消失。

植入后第2周，植入膜片周边出现白色降解点状浸润(图1A，B)，随观察时间延长，范围逐渐扩大并向植片中心进展(图1C，D)。

植入后第8周，实验组膜片中央出现降解浸润，皱褶屈曲不明显(图1E)；对照组膜片全部浸润，皱褶屈曲明显(图1F)，在各观察时间点，实验组降解浸润程度小于对照组。植入后第6周，两组各有1只角膜上皮缺损(图1G，H)。

植入后8周内，实验组未见角膜新生血管发生，对照组有2只发生角膜新生血管，但范围未及角膜1/3，且未接近植片周围(图1I)。

2.3 切片染色结果植入后第8周，实验组膜片表层少量降解，降解材料与角膜基质融合，材料边界易辨认，膜片周围角膜基质有少量炎性细胞浸润，角膜基质纤维排列有序，见图2A，B；对照组膜片表层降解程度大于实验组，膜片结构疏松，膜片周围角膜基质有较多炎性细胞浸润，多为中性粒细胞，降解材料与角膜基质交织融合，见图2C，D。

2.4 前节-光学相干断层成像检查结果移植后第2周，实验组壳聚糖-胶原复合膜与正常角膜有着十分明显的分界，密度高于正常角膜组织，见图3A；移植后第6周时出现模糊的复合膜边界，密度与正常角膜组织很接近，这说明复合膜出现了降解，并且角膜组织也没有溶解坏死现象，基质的厚度及密度没有明显差异，见图3B；移植后第6周，角膜形态恢复正常，植片不易分辨，中央角膜厚于周边角膜，见图3C，D。

参考文献

[1] 黄飞华,孔繁智,朱婉萍,等.不同相对分子质量壳聚糖乳酸盐体外抑菌实验研究[J].中国海洋药物,2009,28(2):36-39.
[2] 李玉文,张梁栋.甲壳素及其衍生物在医药领域的应用[J].潍坊学院学报,2011, 11(4):80-84.
[3] Pillai CKS,Paul W,Sharma CP.Chitin and chitosan polymers: chemistry, solubility and fiber formation.Prog Polym Sci. 2009; 34(7):641-678.
[4] Cheba BA.Chitin and chitosan:marine biopolymers with unique properties and versatile applications.Global J Biotech Bio-Chem.2011;(3):149-153.
[5] 马群,刘万顺,韩宝芹,等.角膜组织工程支架壳聚糖基共混膜的制备及性能评价[J].功能材料,2010,41(9):1547-1551.
[6] Liang Y, Liu W, Han B,et al.Fabrication and characters of a corneal endothelial cells scaffold based on chitasan.J Mater Sci: Mater Med.2011;22(1):175-183.
[7] Keogh MB,O' Brien FJ,Daly JS.A novel collagen scaffold supports human osteogenesis--applications for bone tissue engineering.Cell Tissue Res.2010;340(1):169-177.
[8] 王家鸣,任力,龙玉宇,等.壳聚糖-胶原复合膜渗透性能的研究[J].功能材料,2012,43(20):2747-2750.
[9] Wang L,Stegemann JP.Thermogelling chitosan and collagen composite hydrogels initiated with beta-glycerophosphate for bone tissue engineering. Biomaterials. 2010;31(14): 3976- 3985.
[10] 马群,刘万顺,韩宝芹,等.角膜组织工程支架壳聚糖基共混膜的制备及性能评价[J].功能材料,2010,41(9):1547-1551.

[11] Venugopal J,Prabhakaran MP,Zhang Y,et al.Biomimetic hydroxyapatite-containing composite nanofibrous substrates for bone tissue engineering.Philos Trans A Math Phys Eng Sci. 2010;368(1917):2065-2081.
[12] Melton JT,Wilson AJ,Chapman-Sheath P,et al.TruFit CB bone plug: chondral repair, scaffold design, surgical technique and early experiences.Expert Rev Med Devices. 2010; 7(3): 333- 341.
[13] 龙玉宇,任力,王家鸣,等.角膜修复用改性明胶交联膜的生物相容性评价[J].生物医学工程学杂志,2013,20(1):170-175.
[14] Badawi AA,El-Laithy HM,El Qidra RK,et al.Chitosan based nanocarriers for indomethacin ocular delivery.Arch Pharm Res.2008;31(8):1040-1049.
[15] Shah A,Brugnano J,Sun S,et al.The development of a tissue-engineered cornea: biomaterials and culture methods. Pediatr Res.2008;63(5):535-544.
[16] 王雪,颜华.组织工程角膜上皮支架材料研究进展[J].眼科研究, 2010,28(10):998-1002.
[17] Bu P, Vin AP, Sethupathi P,et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.Exp Eye Res. 2014;121: 143-146.
[18] Murphy CM, O'Brien FJ.Understanding the effect of mean pore size on cell activity in collagen-glycosaminoglycan scaffolds.Cell Adh Migr.2010;4(3):377-381.
[19] 侯江平,李国星,李玉莉,等.角膜内不同部位植入壳聚糖-胶原复合膜的生物相容性[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(34):6319-6322.
[20] Hongyok T,Chae JJ,Shin YJ,et al.Effect of chitosan-N- acetylcysteine conjugate in a mouse model of botulinum toxin B-induced dry eye.Arch Ophthal mol. 2009;127(4):525-532.
[21] 郭丽,王迎军,任力,等.明胶固定化壳聚糖膜的细胞相容性评价[J].功能材料,2009,40(9):1525-1528.
[22] Qu C,Xiong Y,Mahmood A,et al.Treatment of traumatic brain injury in mice with bone marrow stromal cell-impregnated collagen scaffolds.J Neurosurg.2009;111(4):658-665.
[23] Notara M,Hernandez D,Mason C,et al.Characterization of the phenotype and functionality of corneal epithelial cells derived from mouse embryonic stem cells.Regen Med. 2012; 7(2): 167-178.
[24] Hu K,Shi H,Zhu J,et al.Compressed collagen gel as the scaffold for skin engineering.Biomed Microdevices. 2010; 12(4): 627-635.
[25] 周晓伟,李国星,朱显丰,等.壳聚糖胶原复合膜在兔角膜基质层间的组织相容性[J].眼视光学杂志,2009,11(6):419-426.
[26] Wang F,Li Y,Shen Y,et al.The functions and applications of RGD in tumor therapy and tissue engineering.Int J Mol Sci. 2013;14(7):13447-13462.
[27] 李娜,周伟,孙恒.人工角膜的研究进展[J].医学综述, 2009,15(4): 575-579.

引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点于2014年5月至2015年1月在南阳市中心医院完成。

1.3 材料

实验动物：4周龄健康大耳白兔16只，体质量约2.1 kg，购自上海生旺实验动物养殖有限公司，许可证编号：SCXK(2013-0013)。

试剂与仪器：乙酸溶液(天津市化学试剂一厂)；壳聚糖(上海伯奥公司)；胶原(广州创尔生物技术有限公司)；裂隙灯显微镜(Haag-Streit 900型，瑞士)；前节-光学相干断层成像(ZEISS VISANTE OCT)。

1.4 实验方法

壳聚糖-胶原复合膜的制备：在3%乙酸溶液中加入壳聚糖并使其溶解，配制成10 g/L的乙酸-壳聚糖溶液，在其中混合胶原水溶液，使胶原的质量分数为30%，搅拌混合溶液，去除气泡，将其放在模具中，经过自然风干成为膜片，之后将其放置在5%NaOH溶液中浸泡30 min，然后使用去离子水冲洗，反复几次，在其中浸泡24 h，干燥备用，最后制成的材料即为壳聚糖-胶原复合膜，厚度约为20 µm。

角膜材料植入实验：取16只健康大耳白兔，均在术前使用裂隙灯显微镜、前节-光学相干断层成像检查双眼角膜。将16只兔随机分为2组，每组8只，均在右眼鼻下方切口，使用隧道刀、虹膜恢复器在1/2角膜厚度处分离出约4 mm×4 mm的板层囊袋，实验组将壳聚糖-胶原复合膜植入囊袋内，对照组将壳聚糖膜植入囊袋内。采用10-0 缝线间断结节缝合创口边缘。

1.5 主要观察指标植入后第1天、第4天、第1周及以后每周的相同时间点，都由同一观察者通过裂隙灯显微镜、前节-光学相干断层成像检查术眼角膜情况，观察并记录实验动物术眼结膜充血、角膜水肿、前房闪辉、角膜新生血管及植片变化等情况。植入后第8周，无菌情况下取角膜，进行苏木精-伊红染色，在生物显微镜下进行观察。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

壳聚糖是一种新型的生物工程材料，生物学特性优良，具有较好的组织相容性和生物可降解性，无毒、无刺激、无抗原性，可促迸生长因子的合成，具有抑制纤维细胞生长、促进上皮细胞分化的作用，已被广泛应用于医学科学的各个领域。角膜基质纤维排列整齐，维持了角膜的透明性和曲率，这一性质使体外重建角膜基质的难度明显提高。由于角膜基质较厚，仅可使角膜细胞扩增，难以形成三维结构，因此角膜支架材料需要有一定的可塑性及强度^[17]。壳聚糖成膜后拥有十分优良的力学强度和透光率，若用其单独作为生物支架，其表面电荷的作用会阻碍细胞生长和增殖^[18-20]。胶原是角膜基质中的重要组成部分，具有良好的生物相容性，可引导角膜细胞的生长^[21]。但其强度差，移植到体内后降解较快，在没有新建角膜基质形成前就已经丧失了支架功能。将胶原和壳聚糖按一定比例制成复合膜后，能够降低壳聚糖的正电荷，改善壳聚糖的吸附力，促进细胞的黏附生长、迁移和增殖^[22]。在生物医学领域，如骨、血管和神经组织的再生与修复中，壳聚糖-胶原复合膜已被广泛研究和应用^[23]。在角膜组织工程中，壳聚糖-胶原复合膜的应用研究刚刚开始，现有文献报道，体外培养的角膜基质细胞在壳聚糖-胶原复合膜上生长良好^[24-25]。
实验将壳聚糖-胶原复合膜和壳聚糖膜分别植入兔角膜基质层间，术后两组均有炎症反应发生，组织学切片显示，实验组炎症程度小于对照组，可见角膜对复合膜的适应性更加良好。角膜新生血管的发生会破坏角膜的免疫赦免状态，是导致角膜移植后免疫排斥反应的高危因素。角膜营养通路的切断、角膜缺氧、炎性细胞浸润等均可导致新生血管的生长。本实验中，实验组在植入后8周内均未发现角膜新生血管，而对照组发生2只角膜新生血管，可见复合膜的组织相容性相对要优于壳聚糖膜，不易诱发血管新生。角膜上皮缺损多因角膜营养通路的部分阻断，导致上皮营养供给不足，同时上皮基底膜结构的破坏，引起层粘连蛋白减少，致上皮细胞疏松、无法附着而引起。两组各出现1只发生角膜上皮点状缺损，但实验组缺损程度轻于对照组，可见其对于角膜局部代谢的影响相对要小。复合膜降解程度小于壳聚糖膜，这在后期得到了组织学检查证实。总之，壳聚糖-胶原复合膜比壳聚糖膜炎症反应轻，对角膜的局部影响小，不易诱发血管新生，呈现出较好的体内组织相容性。移植后第1周，前节-光学相干断层成像检查结果显示，壳聚糖-胶原复合膜与正常角膜有着十分明显的分界，密度高于正常角膜组织；移植后第4周时复合膜边界模糊，与正常角膜组织密度很接近，这说明复合膜出现了降解，并且角膜组织也没有溶解坏死现象，基质厚度及密度没有明显差异。苏木精-伊红染色光镜显示，实验组移植片与正常角膜有着十分清晰的边界，其间有炎细胞浸润，移植膜纤维排列整齐，内有角膜基质样细胞成分和空泡样结构，组织中无溶解和坏死灶现象的产生，说明胶原-壳聚糖复合膜具有可降解性、无毒性和良好的生物相容性。本实验结果显示复合膜慢慢与正常角膜融合，两种膜的边界渐渐模糊。
角膜修复材料的功能是作为支架材料，帮助角膜组织完成自身修复，而支架材料最终可被完全降解^[26]。角膜修复材料的应用主要考虑到材料与细胞周围基质可以协调作用，具有可降解性，容易被蛋白酶分解，可促进细胞生长代谢。国外的许多研究也表明，胶原作为一种角膜修复材料应用前景十分良好。作为一种高分子聚合物，壳聚糖带正电荷且生物相容性良好，具有可降解性及透明性，且其降解后产生的物质对机体无害，故被广泛应用在组织工程及药物载体的研究中^[27]。将壳聚糖和胶原混合，既可以改善胶原力学性能和透明性差、降解过快的缺点，又可以解决壳聚糖降解过慢、强度过大的弱点，使复合膜的降解速度与角膜组织自身修复速度相互对应，对临床中角膜损伤修复有着十分重要的意义。

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