2  结果  Results 

2.1  基于传统的热致相分离法  热致相分离是一种制备类似于天然细胞外基质的聚合物纳米纤维材料的方法。热致相分离首先是将聚合物与高沸点、低分子质量的液态或固态稀释剂混合，在高温时形成均相溶液，再将混合物溶液制成所需要的形状，降低温度使溶液发生相分离，然后用某些溶剂进行萃取除去稀释剂，最后进行冷冻干燥得到孔结构。郑雄飞等^[17]在不结合其他致孔剂方法的条件下，基于单一的热致相分离方法制备出左旋聚乳酸纳米纤维大孔支架(图2)，即将一定量的左旋聚乳酸高温溶解在一定比例的1，4-二氧六环和水的溶剂体系中，再倒入离心管中，然后进行热致相分离和凝胶一段时间，随后使用乙醇水溶液进行冷冻萃取除去1，4-二氧六环和水，最后在室温下干燥除去乙醇，冻干后得到含有100 μm以上的大孔纳米纤维左旋聚乳酸支架。CHEN等^[18]使用了浊点热致相分离法在左旋聚乳酸/1，4-二氧六环/水三元体系中制备出超过300 μm的大孔纳米纤维左旋聚乳酸支架，然后再用壳聚糖溶液将左旋聚乳酸支架进行表面改性得到左旋聚乳酸/壳聚糖支架。相比于常规的热致相分离，支架的孔径会稍微小一点，但在孔壁上会形成血小板样的微观结构。最后用大鼠颅盖骨缺损模型来评估了支架在体内的成骨性，结果显示含有3%壳聚糖的复合支架显著增强了骨骼的再生。WANG等^[19]使用此方法来制备具有80 μm大孔结构的纳米纤维支架-负载人骨形态发生蛋白2的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球/纳米纤维(BMP-2@MS/NF)复合支架，人骨形态发生蛋白2在复合支架的体外释放行为显示可持续释放超过5周。在这些载有人骨形态发生蛋白2复合支架上生长的小鼠原代成骨细胞具有更好的附着力和增殖能力。同样，碱性磷酸酶活性和茜素红S染色结果证明了这一点：载有人骨形态发生蛋白2复合支架显示成骨细胞的体外成骨分化增强。另外，来自大鼠颅盖缺损模型的体内成骨潜能评估组织学结果表明，这些负载人骨形态发生蛋白2的复合支架具有高骨诱导性。这些结果表明，载有人骨形态发生蛋白2的复合支架材料有可能被用作骨植入物，其成骨能力因人骨形态发生蛋白2的延长释放而得到增强。所以在使用单一的热致相分离法来制备纳米纤维大孔支架时，对热致相分离参数(如溶液浓度,溶剂体系,凝胶温度,凝胶时间等)、材料等要求比较高，并且产生的支架的孔隙也较小且不可控，连通性能也不好。

粒子沥滤法被广泛地运用于孔结构骨组织工程支架中。粒子沥滤法是通过将骨组织工程材料和致孔剂粒子进行混合，再利用二者不同的溶解性和挥发性把致孔剂粒子除去，最后致孔剂粒子的原有空间就变成了孔隙。所得到聚合物支架的孔尺寸取决于致孔剂粒子的尺寸。将热致相分离结合粒子沥滤法可制备出一定尺寸大孔结构的纤维支架。HAN等^[20]使用此种复合方法制备由纳米羟基磷灰石颗粒增强的仿生纳米纤维大孔左旋聚乳酸支架，使用了300-450 μm的石蜡微球作为致孔剂来得到300-450 μm大孔的纳米纤维支架。LIU等^[21]也使用了相同的方法和不同直径的石蜡微球(150-250，250-420，420-600 μm)制备出不同大孔结构的纳米纤维明胶支架。LIU等^[22]也使用了相同的方法并且用糖作为致孔剂来制备出几百微米大孔的纳米纤维聚己内酯支架。SALERNO等^[23]使用了200-400 μm和400-600 μm的明胶颗粒作为致孔剂来制备纳米纤维大孔支架。WEI等^[24-25]和GUOTE等^[26]均使用了糖球模板作为致孔剂来制备具有互连大孔和纳米纤维结构的左旋聚乳酸支架。CHEN等^[27]使用了石蜡球来产生具有高度互连的球形大孔结构和纳米纤维结构支架。可以通过改变石蜡球的热处理时间来控制孔间连通性，并且可通过改变支架的孔隙率来控制力学性能。通过互连的大孔结构促进整个支架孔隙中的细胞接种，以及合成的胶原样基质，这些新型基质可能是骨组织工程的优秀支架。ZHANG等^[28]首先将水溶性聚合物材料制成所需大孔结构的三维复制品，然后将聚合物溶液在模具中浇铸到致孔剂组件上，并进行热致相分离以形成纳米纤维基质，再用水浸出致孔剂材料，最终形成具有预先设计的大孔结构的合成纳米纤维细胞外基质。该技术有利于通过致孔剂粒子来控制大孔形状和尺寸，通过组装条件(热处理的时间和温度)控制孔间连通性，通过相分离和后处理参数控制孔壁形态，以及通过聚合物浓度和交联密度来控制力学性能。但是此方法很难将致孔剂除完，并且在除去致孔剂粒子后支架会在一定程度下产生萎缩，从而降低了支架的力学性能和孔与孔之间的连通性。

总之，热致相分离不需要复杂的设备来制备支架。通过使用致孔剂可以更好地控制热致相分离中支架的孔隙率，从而获得高于50 μm的孔径。通过溶剂相互作用方法产生的支架具有宏观构造结构，这不仅有助于细胞在纳米纤维和分化细胞的界面上生长，还有助于微观层面的组织形成。在相分离中，多孔支架不是以特定的、可再现的方式形成的，由于凝胶化、溶剂萃取等过程，制备过程耗时很长。使用有机溶剂作为溶解材料会引起人们对其形成支架中留下残留物的担忧。此外，当支架孔径低于所需孔径的1-20 μm时，将导致体内的支架与细胞整合缓慢。由热致相分离形成的支架在形成期间经历收缩，并且由于该材料具有不足的力学性能，因此通过该技术开发的支架大多数是失效的^[29]。

2.2  基于传统的静电纺丝法  静电纺丝是一种专门制备纳米纤维材料的方法，能够模仿细胞外基质的结构。这些纳米纤维结构由于其高孔隙率和良好的表面积与体积比，以及较强的细胞黏附、迁移和增殖等特征而被广泛用于骨组织工程中。但是由于电纺纳米纤维非常长，缠结并且密集地堆积在表面上形成二维结构，因此电纺纳米纤维难以被用于制备骨组织工程支架的多孔三维结构。这是因为在静电纺丝的过程中，从喷丝头上喷出的射流存在不稳定鞭动，导致纤维随机地沉积到收集装置表面，最后就收集到排列非常紧密的二维纤维支架。

改变静电纺丝内部设备来制备不同孔径大小的纳米纤维大孔支架。CAI等^[30]使用静电纺丝纱线组装技术制备了三维纳米纤维大孔左旋聚乳酸/聚己内酯复合支架，纤维长度在400-900 nm之间，孔大小在60-130 μm之间(图3)。在体外观察到，三维大孔纳米纤维支架有更多的细胞增殖和细胞向内生长，而且在人胚胎干细胞体外分化中明显检测到钙沉积。三维大孔纳米纤维支架修复骨缺损3，6周时，组织学和X射线显示在支架周围及支架内部均有精细的三维骨组织形成。这项研究表明三维大孔纳米纤维支架为人胚胎干细胞的生长提供了结构性支持并指导了骨的形成，表明该新策略成功地将电纺纤维用于骨组织工程。但是单一静电纺丝法制备的支架孔隙较小，力学性能偏低，具有不可控的三维结构。

大多数由天然聚合物制造的纤维不稳定，因此需要交联以提高稳定性和力学性能。MAJIDI等^[31]使用Ca²⁺交联结合静电纺丝来制备三维海藻酸钠/聚氧化乙烯水凝胶纳米纤维大孔支架。TENG等^[32]使用戊二醛一步法交联结合静电纺丝制备了三维纳米纤维大孔明胶支架(图4)。一步法交联纤维的平均长度为(0.96±0.18) μm，短于两步法的交联纤维长度(1.62±0.43) μm；一步法交联的孔大小为(36.36±18.46) μm，大于二步法交联的孔径(13.15±4.13) μm，并且通过一步法交联制备的支架蓬松且多孔。在14 d内，两种纤维的降解率均未发现明显差异。在磷酸缓冲液溶液中浸泡14 d后，许多两步法交联的纤维融合在一起；相比之下，一步法交联纤维的形态和大孔结构没有明显变化(通常保持不变)。两步法和一步法交联明胶纤维的近似交联度分别为40%和54%。荧光显微镜和苏木精-伊红染色的结果表明，一步法交联的纤维支架中的MC3T3-E1亚克隆4细胞分布更加均匀和多样化。一步法交联的纤维增强了MC3T3-E1细胞的增殖和分化潜能。此外，一步法交联纤维对修复大鼠头骨的缺损是有益的。因此，在乙醇浴中通过戊二醛进行一步法交联是制备三维大孔纳米纤维支架最经济有效且简单的方法。该技术保留了明胶纤维的形态和结构，并增强了支架在体外和体内的生物学性能。KIM等^[33]采用适当的加工条件交联以产生薄膜或大孔支架形式的生物玻璃-胶原纳米纤维复合材料，复合材料的平均纤维直径为320 nm，孔径在十到百微米之间。当浸泡在模拟体液中时，观察到生物玻璃纳米纤维均匀分布在基质中，从而在其表面上迅速形成骨状磷灰石矿物质，在体外表现出出色的生物活性。成骨细胞在生物玻璃-胶原纳米纤维复合材料上显示出良好的生长。特别地，纳米复合材料上细胞的碱性磷酸酶活性显著高于胶原蛋白上的碱性磷酸酶活性。所以这种新颖的生物玻璃-胶原蛋白纳米纤维复合材料在骨再生和组织工程应用中具有巨大潜力。这种方法只能加强支架的稳定性和力学性能，但是支架的孔隙还是很小，力学性能偏低且不能形成三维结构。

电纺纳米纤维支架的主要关注之一是二维(2D)阵列中密集堆积的纤维，这阻碍了它们在组织再生中的适用性。为了克服这个问题，JOSHI等^[34]首次提出了静电纺丝结合原位气体发泡法来制备三维纳米纤维大孔聚己内酯/醋酸纤维素支架。将电纺纳米纤维毡浸入硼氢化钠溶液中，在相互连通的孔隙中充满硼氢化钠溶液，硼氢化钠溶液在毛细管力的驱动下水解生成氢气。原位生成的气体分子形成团簇，将导致孔隙成核的自由能降至最低，使纳米纤维重新组织成低密度、大孔、海绵状、多层的三维支架。使用此方法可以将密集堆积的二维电纺膜改性为低密度三维支架，但是导致支架的力学性能较差、孔径很小，三维结构也不可控制。

冷冻干燥也是可以用来制备孔结构的一种方法。HOKMABAD等^[35]使用静电纺丝结合冷冻干燥法制备了掺杂纳米羟基磷灰石的乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸盐纳米纤维大孔支架。乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸盐、乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸-10纳米羟基磷灰石、乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸-20纳米羟基磷灰石和乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸-30纳米羟基磷灰石的平均孔大小分别为(207.05±83.26)，(183.19± 68.81)，(175.29±68.04)和(160.4±57.14) μm。随着纳米羟基磷灰石含量的增加，导致乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸盐支架膨胀，孔隙率和降解性能降低，但是观察到体外生物矿化和力学性能的增加。与原始乙基纤维素接枝聚己内酯/海藻酸盐支架相比，人牙髓干细胞在掺入纳米羟基磷灰石的支架上显示出更高的黏附、增殖和分化(图5)。但是此支架的力学性能还是偏低，孔径大小有待提升，无法形成三维结构。  

静电纺丝支架被广泛用于骨组织工程，然而一个常见的问题是这些纤维支架的小孔径和紧密堆积的结构，导致细胞浸润性差，所以需要使用一种新技术来解决。KIM等^[36-37]使用静电纺丝和10-200 μm的氯化钠作为致孔剂来制备大孔/纳米纤维玻璃酸/胶原复合支架(图6a)，同时利用100-200 μm的氯化钠作为致孔剂来制备具有管状、大孔的纤维支架。软骨细胞黏附和增殖实验显示，随着胶原含量增加，细胞黏附和增殖能力增强，播种的软骨细胞保持成软骨形态的圆形特征。WANG等^[38]同时使用静电纺丝和电雾化的聚氧化乙烯微粒作为致孔剂来制备纳米纤维大孔丝素蛋白支架(图6b)。小鼠3T3成纤维细胞体外培养实验显示，两种支架均可支持细胞附着、扩散和增殖。然而，静态培养条件下的体外细胞浸润只发生在大孔的静电纺丝支架上。HSU等^[39]先使用静电纺丝制备介孔生物活性玻璃纳米纤维，再使用聚甲基丙烯酸甲酯微球作为大孔模板并利用静电液滴发生器来制备含有介孔生物活性玻璃纳米纤维的大孔微珠。含有介孔生物活性玻璃纳米纤维的大孔微珠平均孔大小为(125.91±27.42) μm，大于聚甲基丙烯酸甲酯微球的直径(80 μm)。GHOSH等^[40]使用静电纺丝和250-425 μm氯化钠或100-250 μm的碳酸氢铵晶体作为致孔剂来制备不同孔大小的纳米纤维大孔聚己内酯支架。但是致孔剂很难除干净，即使除去了致孔剂，支架的力学性能也是很差，孔的连通性也不好，而且无法形成三维结构支架。

LEE等^[41]使用静电纺丝结合超声法来制备纳米纤维结构的大孔左旋聚乳酸/明胶支架。他们发现超声处理后可以扩大支架的孔径、孔隙率、厚度。然而，支架的孔径、孔隙率、厚度的大小取决于超声的频率和处理时间。细胞实验显示在含或不含培养基的血清中，NIH3T3细胞黏附纳米纤维支架的数量明显高于非纤维支架。经过4 d的细胞培养发现，纳米纤维支架为细胞增殖提供了良好的环境。细胞与支架之间的相互作用发生在支架的孔壁上。纳米纤维与光滑结构的结合可用于控制表面积、蛋白质吸附和细胞相互作用。这种新型纳米纤维和大孔支架可为细胞黏附、增殖和分化提供更好的环境，以及用于研究细胞-支架的相互作用。与单一的静电纺丝相比，超声处理后可以得到更大孔径的支架，但是在使用超声的同时支架的力学性能将会变差且无法形成三维结构。

2.3  新型制备方法  溶液吹纺与静电纺丝最大的区别在于：溶液吹纺使用的是气体挤压式，而静电纺丝使用电场来挤出纳米纤维。MEDEIROS等^[42]使用溶液吹纺和热致相分离方法来制备掺杂纳米生物活性玻璃的纳米纤维大孔聚D，L-丙交酯复合支架(图7)。通过在形成纤维的同时喷洒水滴，产生纤维和冰微球网络来生成大孔支架。由于存在冰球而具有相互连接的大孔，随后冷冻干燥形成多孔纳米纤维的三维支架。多喷嘴的使用使得冰微球能够原位喷射到纤维中，起到原位多孔化剂的作用，并且冷冻干燥可获得受控孔隙率的三维互连纳米纤维大孔支架。进一步的体内和体外实验显示，与暴露于模拟体液最初24 h内的光滑纤维相比，多孔纤维的可溶性二氧化硅离子释放更快，并且在84 h内羟基磷灰石的沉积是明显的。与单一的静电纺丝相比，此方法可以得到具有更大表面积(更多的开孔结构)和相互连通大孔结构的纳米纤维支架。

快速成型技术已被用于制作组织工程支架。该技术是一种相对先进的技术，用于制造具有完全互连多孔网络的支架^[43]。快速成型技术通常以横截面的周期表示，然后将数据应用于实体自由形式制造机器以生成物理模型，通过从下到上构建各个层，每个新制造的层都堆积在前一层^[44-45]。在制造过程中也可以使用生物制剂，例如生长因子和活细胞^[46-48]。这些技术的优点是它们能够控制机械性能、基质结构(尺寸，形状，互连性，分支，几何和取向)、生物效应和支架的降解动力学^[49-51]。快速成型技术包括不同类型的技术，例如三维印刷^[52]、选择性激光烧结^[53]、立体光刻^[54]、熔融沉积建模等多种技  术^[55]。由于三维打印技术具备速度快、精度高和可定制等优点，已逐渐被应用到骨组织工程领域。BROWN   等^[56]使用静电纺丝结合三维打印技术制备了纳米纤维大孔聚己内酯支架(图8)。尽管允许聚合物按原样加工而不需要有毒溶剂，但基于熔融挤出直接写入骨组织工程的三维打印面临着静电纺丝的不同挑战：目前只能达到比静电纺丝大几个数量级的长丝直径；另一方面，直接熔融写入技术提供了对细丝放置的精确控制，以创建具有高度有序孔的三维结构，足够大的孔径(超过100 μm)以促进细胞浸润和血管形成。这种方法与单一的静电纺丝法相比可以得到结构孔隙可控的、具有良好孔道连通性、真正意义上的三维纳米纤维大孔支架。

除了以上方法之外，还有些研究者运用一些独特的方法来制备纳米纤维大孔支架，如激光切割、水凝胶涂层等。FULLER等^[57]利用了静电纺丝和激光切割压缩技术来制备多层的纳米纤维大孔支架，其中通过激光切割引入30%圆形孔隙率，从而进一步降低了机械完整性。NIVEDHITHA等^[58]将有大孔结构的凝胶涂在纤维支架上来制备微米纤维大孔支架，具有外覆盖物构建体上的蛋白质吸附显著降低，这可以延迟细胞与外层的黏附，并且构建体显示出良好的细胞附着和肌腱细胞的增殖。

组织缺损和器官衰竭严重威胁着人类健康，带来了许多疾病和死亡^[1]。早前修复组织缺损、替换衰竭器官的方法主要有：自体组织移植、异体组织移植和应用人工组织替代品，但是这些方法都存在各自的优缺点，不能完全满足临床需要。自体组织移植具有无免疫排斥反应、组织相容性好等优点，但是会造成修复移植部位的损伤，是一种以健康组织为代价的方法^[2]。异体组织移植虽然克服了自体组织移植的缺点，但是会遇到疾病的感染和产生免疫排斥反应，并且某些组织的供体来源严重不足。人工组织替代材料(如合成高分子材料、陶瓷类骨替代材料、金属骨替代材料等)在近年来使用较为广泛，但是这种材料具有生物惰性，生物相容性差，不能使受者组织愈合而成为人体组织的一部分，更不能参与正常的新陈代谢活动。组织工程就是在这样的背景下应运而生的^[3]。

1988年美国国家科学基金会正式将“组织工程学^[4]”定义为：应用生命科学和工程学的原理和方法，在正确认识哺乳动物正常和病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究、开发能够修复和维护损伤后的人体各组织、器官功能和形态的生物替代物的一门新兴学科^[5]。

骨组织工程的基本原理和方法可概述为：将干细胞在体外培养扩增，种植在具有良好生物活性、可降解的搭载材料上，培养一段时间后移植到生物体内相应的部位，在体内继续生长繁殖并分泌细胞外基质，伴随材料的逐渐降解最终新生骨组织取代搭载材料，达到修复结构、恢复功能的目的^[6]。

骨组织工程的研究内容包括：种子细胞，支架材料，生物活性因子^[7]，即组织工程学的“三要素”，其中支架材料的特征与性能是组织工程技术至关重要的一环。在损伤修复过程中，支架材料作为细胞生长、黏附、迁移、增殖、分化等生物学功能的场所，是决定损伤部位的组织结构能否实现再生、恢复组织工程构建的关键因素^[8-9]。

研究表明，理想的骨组织工程支架材料应满足以下几点：能提供良好的细胞界面，利于细胞黏附、增殖、分化；良好的生物相容性，材料及其代谢产物不会产生炎症和毒性反应；合适的生物降解性，能降解并被吸收；三维立体多孔结构，孔隙率至少应达90%，提供细胞生长空间；可加工性和合适的生物力学强度，可塑成各种形状^[10]。因此，采取仿生手段在结构和组成上模拟天然细胞外基质的支架材料，是当前的骨组织工程研究的热门领域之一。

天然细胞外基质是主要由胶原蛋白和弹性蛋白等多个大分子交织形成的三维纤维网络结构，因此大量研究集中于设计制备具有纤维结构的支架材料来进行模拟，从而实现指导细胞迁移、提供机械支持并调节细胞活动的功能^[11]。其中，纳米纤维相比于微米纤维支架有更大的优势。纳米纤维支架具有更大的比表面积，可为细胞提供更多的黏附位点，增强细胞与支架之间作用力。值得提出的是，为细胞植入与营养物质运输提供通道的支架大孔结构也是必须的。因此，设计大孔与纳米纤维结构兼具的支架材料具有重要的科学与应用意义。

目前制备纳米纤维的3种主要技术有分子自组装、热致相分离和静电纺丝。BENIASH等^[12]开发了一类肽两亲物分子，生理条件下其在多价金属离子存在下自组装成三维纳米纤维网络。可以通过将肽两亲物溶液添加到细胞培养基或含有多价金属离子的其他合成生理流体中来触发组装。当流体含有悬浮细胞时，肽两亲物自组装会捕获纳米纤维基质中的细胞，并且细胞在培养物中存活至少3周。结果表明包裹的细胞使纳米纤维内化，并可能在其代谢途径中利用肽两亲物分子。用于纳米纤维制造的自组装优点包括简单的制造工艺、在水凝胶中容易细胞包封、用于原位支架形成的可注射形式。虽然可以将肽两亲物自组装的水凝胶力学性能调整到一定程度，但它们通常不足以为骨组织工程提供稳定的三维几何形状。还存在其他限制，例如自组装分子的选择有限，耗费时间和昂贵的肽两亲物合成，难以控制水凝胶支架内的孔径和形状，以及纤维直径显著小于胶原蛋白。HSU等^[13]使用溶胶凝胶/静电纺丝法来制备介孔生物活性玻璃纳米纤维，模拟天然细胞外基质的三维结构，结果发现介孔生物活性玻璃纳米纤维基质通常以六边形、高度有序的一维通道为特征，具有良好的载药效率，有优异的体外生物活性，有利于细胞的黏附、分化、增殖、矿化及相关基因的表达，具有良好的骨再生性能。除了材料选择的灵活性之外，静电纺丝的另一个优点是通过调整加工参数(例如电压，聚合物溶液浓度，喷丝头和收集器之间的距离，流速和喷丝头直径)来控制纤维形态。然而静电纺丝的主要不足在于没有孔隙或者孔隙很小，导致材料的力学性能太差，很难做成三维结构的纳米纤维支架。LIU等^[14]使用热致相分离法制备了具有微孔和微/纳米纤维结构的丝素蛋白/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合支架，探索了热致相分离参数对支架孔大小、孔隙率和纤维直径的影响。该方法虽然不需要复杂的设备，但是制备过程耗时较长、有机溶剂对支架有影响、支架在成型期间的收缩会导致支架力学性能变差。

骨组织工程支架的孔尺寸、孔隙率和相连的孔形态对细胞的行为有很大影响，尤其决定了细胞和组织长入支架的程度。在这里定义大孔孔径大于100 µm，微孔孔径为10-100 µm。其中小孔径(小于10 µm)不促进细胞浸润和组织向内生长到支架。支架的微孔对细胞的黏附、迁移、增殖、形态、分化、细胞外基质的分泌等方面都有影响。然而多孔结构可以容纳细胞，并允许交换营养物质和代谢废物。孔径除了决定支架内部的物质交换，还能影响细胞铺展过程中的骨架张力，进而调节细胞行为。如果孔径远远大于细胞直径，细胞会将孔表面识别成一个平面或者是一个微小弧度的培养面来黏附。这与在平面基质(例如组织培养板)上培养细胞的方式非常相似，从而激活了细胞的机械转导机制。关于孔径对成骨分化的研究也比较多，普遍认为100-450 µm的孔径比较有利于骨组织的形成，但是孔径的具体范围还与特定的种子细胞有关系。比如，孔径为100-300 µm的支架有利于骨髓来源间充质干细胞的成骨分化，孔径为200 µm的支架有利于人体骨髓间充质干细胞的成骨分化。另外，孔径为400 µm和200 µm的支架比孔径为100 µm的支架更利于关节软骨的成长，呈现出更好的软骨修复效果。

对于不同的细胞，支架的最适孔径尚无定论，但几十到几百微米的孔径对于细胞的迁移和长入支架内部是必需的^[15]。合适的孔尺寸、高的孔隙率(>90%)和相连的孔形态对于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄及血管和神经的内生长都起着决定作用^[16]。然而，单一的热致相分离法、静电纺丝法和自组装法只能制备出较小孔径甚至无孔的纳米纤维支架。为了解决这一问题，可将热致相分离法和静电纺丝法结合其他方法来制备出具有大孔结构的纳米纤维支架。最后归纳总结这些年来能制备大孔纳米纤维支架的方法，并指出这些方法的不足之处。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  资料来源  由第一作者应用计算机在2019年4月以“bone tissue engineering，nanofibrous， macroporous，scaffolds”为英文检索词，以“骨组织工程、纳米纤维、大孔、支架”为中文检索词，在Web of science、知网、百度学术数据库中检索已发表的相关文献。

1.2  入选标准  首先根据文章题目和摘要进行初步的筛选，再通过泛读和精读文献来确定是否与骨组织工程纳米纤维大孔支架制备技术相关的文献。

1.3  数据的提取和质量的评估  首先通过文献题目和摘要进行初步筛选，并对所有的检索文献进行质量评估，删除无关和重复的文献，排除不符合入选标准的文献，最后共选入58篇文献。文献检索流程见图1。

总之，以上传统方法虽然满足了骨组织工程的需要，但所制备的骨组织工程支架仍然存在问题，其中最大的问题在于很难提供一个三维相互连通的大孔结构来模拟体内微环境，诱导细胞的迁移、生长、分化、增殖，最终再生新的组织和器官。三维打印技术为这一问题提供了很好的解决方案，一方面三维打印技术对材料的选择十分广泛，能满足支架的生物学性能；此外，三维打印对于结构的调控十分精确，可对支架内部结构及外部形状进行定制，达到双重调控，满足骨组织工程支架的需求，为骨组织工程的将来带来了发展。

纳米纤维结构具有与天然细胞外基质相似的结构，使所制备的支架具有仿生天然细胞外基质的生物学功能，并且大孔结构为细胞生长提供了很好的微环境。因此，纳米纤维大孔支架有望成为理想的骨组织工程支架。文中综述了多种复合方法来制备具有纳米纤维结构的大孔支架，并且它们与单一制备纳米纤维大孔支架的方法相比起到了不同的作用，但是还存在一些问题有待解决：力学性能较差，不能准确地控制支架的孔隙大小、形态、整体的孔隙率和孔隙之间的连通性等。虽然纳米纤维大孔骨组织工程支架已越来越受关注，但是想要制备出真正意义上的三维结构还是一个重大的挑战。

理想的骨组织工程支架材料不仅应具备相互连通的大孔结构，还应具备介孔和微孔的多级孔径结构，这种形态的多级孔结构不仅增加了材料的比表面积，更利于细胞的黏附，而且提供足够的空间使细胞向内迁移增殖、分化形成三维网状结构，还有利于营养物质的运输和新陈代谢废物的排泄等。之后，再结合生长因子来促进组织的再生、血管化，也许将成为未来骨组织工程的发展方向之一。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

热致相分离：是一种特殊的制备类似于天然细胞外基质的聚合物纳米纤维材料的方法，首先是将聚合物与高沸点、低分子质量的液态或固态稀释剂混合，在高温时形成均相溶液，再将混合物溶液制成所需要的形状，降低温度使溶液发生相分离，然后用某些溶剂进行萃取除去稀释剂，最后进行冷冻干燥得到孔结构。

纳米纤维：是指直径为纳米尺度而长度较大的具有一定长径比的线状材料，此外，将纳米颗粒填充到普通纤维中对其进行改性的纤维也称为纳米纤维。狭义上讲，纳米纤维的直径介于1-100 nm之间；广义上讲，纤维直径低于1 000 nm的纤维均称为纳米纤维。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

使用了多技术手段   (静电纺丝或者热致相分离法结合了一些能制备大孔结构的技术)来制备具有大孔结构的纳米纤维支架，能更好地模拟天然细胞外基质和体内的微环境，更加有利于细胞的长入、迁移、生长、分化、增殖和促使三维骨组织(器官)的再生。特别是三维打印技术不仅对材料的选择非常广泛，而且能最大程度上调控内部结构和外部形状，从而制备出具有连通和可控多级孔道结构(包括大孔结构)的三维纳米纤维支架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程