激素性股骨头坏死过程中低氧诱导因子1α与骨细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (51): 8201-8207.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.001

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激素性股骨头坏死过程中低氧诱导因子1α与骨细胞凋亡

赵振群¹，张志峰²，刘万林¹，白锐¹，王文选³，孙亮¹

内蒙古医科大学第二附属医院，¹小儿骨科，²关节外科，³手足外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

收稿日期:2015-11-04 出版日期:2015-12-10 发布日期:2015-12-10
通讯作者: 白锐，博士，副主任医师，内蒙古医科大学第二附属医院小儿骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:赵振群，男，1984年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，内蒙古医科大学第二附属医院小儿骨科，硕士，主治医师。共同第一作者：张志峰，男，1980年生，内蒙古自治区赤峰市人，蒙古族，硕士，主治医师。
基金资助:
内蒙古自治区自然科学基金项目(2015MS08121)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY14138)；内蒙古医科大学第二附属医院院基金(2013YJJ17)

Hypoxia inducible factor-1 alpha and apoptosis of osteocytes in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

Zhao Zhen-qun¹, Zhang Zhi-feng², Liu Wan-lin¹, Bai Rui¹, Wang Wen-xuan³, Sun Liang¹

the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, ¹Department of Pediatric Orthopedics, ²Department of Joint Surgery, ³Department of Hand and Foot Surgery, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2015-11-04 Online:2015-12-10 Published:2015-12-10
Contact: Bai Rui, M.D., Associate chief physician, Department of Pediatric Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Zhao Zhen-qun, Master, Attending physician, Department of Pediatric Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Zhang Zhi-feng, Master, Attending physician, Department of Joint Surgery, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Zhao Zhen-qun and Zhang Zhi-feng contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2015MS08121; the Scientific Research Program in Universities of Inner Mongolia Autonomous Region, No. NJZY14138; a grant from the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2013YJJ17

摘要/Abstract

摘要：

背景：激素性股骨头缺血坏死发病机制未明，缺血缺氧是其根本原因，缺氧状态下低氧诱导因子1α参与多种信号通路传导。作者的前期研究发现，骨细胞凋亡与激素性股骨头缺血坏死存在关联。
目的：分析低氧诱导因子1α和骨细胞凋亡是否与激素性股骨头缺血坏死存在关联。
方法：选健康5月龄新西兰白兔20只，随机分为空白对照组和实验组，每组10只。实验组兔给予激素联合内毒素制备激素性股骨头缺血坏死模型。最后一次给药后第4周处死所有实验动物，取双侧后肢股骨头，光镜与电子显微镜下观察形态与超微结构变化，计算各组空缺骨陷窝；应用免疫组织化学技术检测低氧诱导因子1α表达，应用TUNEL法检测骨细胞凋亡。
结果与结论：实验组空缺骨陷窝率高于空白对照组(P < 0.01)；实验组骨细胞凋亡高于空白对照组(P < 0.01)；实验组低氧诱导因子1α低于空白对照组(P < 0.01)；实验组中低氧诱导因子1α表达与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.675)，实验组中空缺骨陷窝率与细胞凋亡率呈正相关(r=0.793)。结果说明，在激素性股骨头缺血坏死早期，低氧诱导因子1α的低表达与骨细胞凋亡存在相关性，二者参与了激素性股骨头缺血坏死的病理变化过程，骨细胞的死亡方式为凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 股骨头, 骨坏死, 糖皮质激素, 凋亡, 低氧诱导因子1α, 骨细胞, 动物模型, 发病机制, 内蒙古自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although the pathogenesis of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head is unknown, ischemia/hypoxia is the fundamental reason. Under hypoxic conditions, hypoxia-inducible factor-1α is involved in various signal transduction pathways. Preliminary studies have found that osteocyte apoptosis is associated with steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between hypoxia inducible factor-1α and apoptosis in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.
METHODS: Twenty New Zealand white rabbits, 5 months old, were randomly divided into control group and experimental group, 10 rabbits in each group. Animal models of avascular necrosis of the femoral head were
made in the experimental group using steroid and endotoxin. Four weeks after the final administration, all animals were sacrificed to take the bilateral femoral heads that were observed morphologically and ultrastructurally under electron microscope. Number of vacant lacunae was calculated in each group. Immunohistochemical technique and TUNEL methods were used to detect hypoxia inducible factor-1α and osteocyte apoptosis, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Lacuna vacancy rate of the experimental group was higher than that of the control group (P < 0.01); the osteocyte apoptosis rate of the experimental group was higher than that of the control group (P < 0.01). In the experimental group, the apoptosis rate was negatively correlated with the expression of hypoxia inducible factor-1α (r=-0.675), but positively correlated with the lacuna vacancy rate (r=0.793). These findings indicate that in the early stage of steroid-induced avascular necrosis, low expression of hypoxia-inducible factor-1α is related with apoptosis of osteocytes, and they are both involved in the pathological process of femoral head necrosis. Apoptosis is the death way of osteocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中图分类号:

R318

赵振群，张志峰，刘万林，白锐，王文选，孙亮. 激素性股骨头坏死过程中低氧诱导因子1α与骨细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(51): 8201-8207.

Zhao Zhen-qun, Zhang Zhi-feng, Liu Wan-lin, Bai Rui, Wang Wen-xuan, Sun Liang. Hypoxia inducible factor-1 alpha and apoptosis of osteocytes in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(51): 8201-8207.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰兔20只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 实验动物一般情况 20只新西兰兔于动物饲养室适应1周后进行实验，分组后，实验组体质量(2.24±0.19) kg，空白对照组体质量(2.25±0.11) kg。动物造模开始后，实验组动物在毛发光泽上无变化，第2次给药后逐渐出现活动减少，反应相对迟钝，饮食量减少，1周后逐渐恢复至正常，处死前体质量为(2.69±0.17) kg。实验期间，空白对照组实验动物在毛发光泽、活动、反应灵敏度、饮食无明显变化，处死前体质量为(2.65±0.13) kg。20只新西兰兔全部纳入实验研究，两组间造模前后体质量变化差异无显著性意义 (P > 0.05)，见图1。

2.3 苏木精-伊红染色 4周时实验组软骨下区可见骨小梁排列紊乱，细而稀疏，甚至断裂；骨髓内脂肪细胞增大，数目减少，部分脂肪细胞消失；骨髓造血细胞数目减少，部分出现纤维组织，细胞碎片堆积；骨陷窝内骨细胞边聚固缩，骨小梁内空缺骨陷窝增加(图2A，B)。
4周时空白对照组软骨下区骨小梁排列整齐，结构完整；骨髓造血细胞和脂肪细胞形态良好，数量正常；未出现纤维组织，无细胞碎片堆积；骨细胞细胞核清晰可见，骨小梁内空缺骨陷窝较少(图2C，D)。空缺骨陷窝率计算方法：100倍放大倍率下随机选取5个视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝占骨陷窝的百分数。正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8%-12%，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示骨坏死[12]。实验组8只实验动物空缺骨陷窝率> 12%，2只实验动物空缺骨陷窝率< 8%，造模成功率80%。空白对照组10只实验动物均< 8%。实验组空缺骨陷窝率为(30.200±1.050)%，空白对照组空缺骨陷窝率为(7.870±0.572)%，实验组空缺骨陷窝率明显高于空白对照组，经两个独立样本t 检验，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 骨细胞凋亡率细胞凋亡时染色体DNA的断裂，首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300 kb的大片段。而后在核小体单位之间被随机切断，形成180-200 bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称TUNEL法。其染色阳性细胞呈棕褐色或棕黄色，着色定位于细胞核内，少数胞浆内出现阳性颗粒(图3A，B)。骨细胞凋亡率计算方法：100倍放大倍率下随机选取5个视野，每个视野计数50个骨细胞，分别数出凋亡骨细胞数，求出凋亡骨细胞占骨细胞的百分数。实验组骨细胞凋亡率为(33.265±1.315)%，对照组亦出现骨细胞凋亡，凋亡率为(4.896±0.797)%，经两个独立样本t 检验，差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组骨细胞凋亡率高于空白对照组。

2.5 低氧诱导因子1α阳性表达率股骨头组织低氧诱导因子1α免疫组化结果的分析，所有组织切片均采用盲法由2位病理科医生独立阅片，以胞浆内或细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性细胞。随机观察10个高倍镜视野，每个视野计数50个细胞。根据阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定(图4A，B)。
实验组低氧诱导因子1α阳性表达率为(6.200± 1.480)%，空白对照组亦出现大量低氧诱导因子1α阳性表达，低氧诱导因子1α阳性表达率为(19.600±1.670)%，经两个独立样本t 检验，差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组低于空白对照组(表1)。

2.6 相关分析 ①空缺骨陷窝与骨细胞凋亡之间关系，实验组空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡率呈明显正相关(r=0.793，P < 0.01)，回归方程为y(∧) =2.200X-39.033，其中骨细胞凋亡率为自变量x，空缺骨陷窝率为因变量y，提示早期激素性股骨头坏死与细胞凋亡相关(图5 A)。②低氧诱导因子1α阳性表达率与骨细胞凋亡之间关系，实验组低氧诱导因子1α阳性表达率与骨细胞凋亡率呈明显负相关(r=-0.675，P < 0.01)，回归方程为y(∧)=-4.624X-27.360，其中低氧诱导因子1α阳性表达率为自变量x，空缺骨陷窝率为因变量y，提示在激素性股骨头缺血坏死中，低氧诱导因子1α与细胞凋亡负相关(图5B)。

2.7 电子显微镜观察实验组中股骨头切片表现为细胞膜完整，细胞核固缩，染色质边集，细胞器消失，凋亡小体出现。
空白对照组骨细胞的细胞膜完整，细胞核内染色质分布均匀，细胞器清晰可见(图6A，B)。

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引言

非创伤性股骨头缺血坏死好发于青壮年，平均发病年龄38岁，致残率高^[1]，晚期多需要行髋关节置换，患者承受巨大痛苦，耗费较多医疗资源，其预防和早期治疗仍然是临床工作面临的难题。非创伤性股骨头缺血坏死的主要原因包括糖皮质激素应用、酒精中毒、血栓形成倾向和低纤溶状态等^[2]，糖皮质激素是引起非创伤性股骨头缺血坏死的常见原因。激素性股骨头缺血坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)是指应用糖皮质皮质激素(以下简称激素)后引起的股骨头血供障碍，引起股骨头部分或完全缺血，进而导致骨细胞及骨髓细胞坏死，最终导形成股骨头塌陷或变形。
1957年，Kemper等^[3]报道了第1例类风湿性关节炎患者经激素治疗后发生激素性股骨头缺血坏死，1971年，Fisher^[4]等进行大样本病例回顾，研究发现482例股骨头坏死患者中有77例经历过激素治疗。随着激素在临床中的广泛应用，激素性股骨头缺血坏死患者亦逐渐增加，激素与股骨头缺素坏死之间的关系，也得到国内外学者的重视。目前关于激素性股骨头缺血坏死的主要发病学说有血管内凝血、潜在血管炎及血管损伤、脂肪代谢紊乱、骨质疏松、骨内压升高、激素的细胞毒作用、前凝血状态等^[5-8]。激素与激素性股骨头缺血坏死的量效关系虽未确定，但肾移植患者或系统性红斑狼疮患者应用激素超过25-40 mg/d，股骨头坏死风险增加^[9]，应用激素后发生激素性股骨头缺血坏死的风险增加20倍^[10]。激素性股骨头缺血坏死的发病机制未明，缺血缺氧是其根本原因，缺氧状态下低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α)参与多种信号通路传导^[11]_，作者的前期研究发现，骨细胞凋亡与激素性股骨头缺血坏死存在关联^[5]，本实验旨在研究低氧诱导因子1α与骨细胞凋亡是否存在关联，是否参与激素性股骨头缺血坏死早期的发生发展，进一步研究骨细胞凋亡发生机制，为进一步探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机制及防治提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2015年1至6月，于内蒙古医科大学分子病理实验室完成(内蒙古自治区重点实验室)。
1.3 材料 3月龄健康新西兰兔20只，雌性10只，雄性10只，体质量(2.25±0.15) kg，标准饮食，室温下单笼喂养。由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，许可证号：SCXK(陕)2014-001，实验单位使用许可证编号：SYXK(蒙)：2013-0001，合格证号：No.61001600000083。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与动物模型制作将20只新西兰兔应用随机数字表法分成2组，每组10只，分别为空白对照组和实验组。
实验组兔耳缘静脉内注射大肠杆菌内毒素，共2次，每次100 μg/kg，间隔24 h。在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20 mg/kg，间隔24 h，建立激素性股骨头缺血坏死模型。
最后一次注射后第4周将动物空气栓塞法处死所有实验动物，在相对无菌的条件下取双侧股骨头，20只实验动物全部纳入研究。
1.4.2 标本制作股骨头一部分以 5%戊二醛溶液固定(制备电镜切片用)，另外一部分以10%甲醛溶液固定(制备免疫组化检测切片用)，固定时间为24 h。固定后，将股骨头组织放入15%EDTA脱钙液内，液面上加一层液体石蜡，同时在容器上加盖，以温度为40-60 ℃间歇微波脱钙，每次辐射1 min，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却 15 min，并更换新液，这样既可保证脱钙液的温度不会太高，又可弃去脱掉的钙盐，使得脱钙更为充分，增加脱钙强度。以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准。

1.4.3 苏木精-伊红染色 ①将固定脱钙后的股骨头组织进行常规石蜡包埋并制成厚4 μm切片。②苏木精-伊红染色：二甲苯Ⅰ5 min；二甲苯Ⅱ5 min；体积分数95%乙醇Ⅰ3 min；95%乙醇Ⅱ3 min；80%乙醇1 min；蒸馏水   1 min；苏木精液染色10 min；流水稍洗去苏木精液3 s；1%盐酸乙醇3 s；稍水洗30 s；促蓝液返蓝30 s；流水冲洗15 min；蒸馏水过洗2 s；0.5%曙红液染色3 min；蒸馏水稍洗2 s；体积分数80%乙醇稍洗2 s；95%乙醇Ⅰ5 min；95%乙醇Ⅱ5 min；无水乙醇5 min；无水乙醇5min；二甲苯Ⅰ5 min；二甲苯Ⅱ5 min；二甲苯Ⅲ5 min；中性树胶封固。③将上述切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变。
1.4.4 透射电子显微镜标本制备取5%戊二醛固定微波脱钙后的股骨头组织，于股骨头软骨下0.2-0.3 cm切取   1 mm×1 mm×1 mm大小骨块，用PBS充分冲洗标本    10 min，去除PBS后，在4 ℃的环境中将骨标本于四氧化锇固定液(1%锇酸)中固定2 h。在20 ℃的条件下对透射电镜标本进行梯度乙醇脱水：在体积分数30%乙醇中15 min，体积分数50%乙醇中15 min，体积分数70%乙醇中4 h，体积分数80%乙醇中15 min，体积分数95%的乙醇中15 min，无水乙醇中30 min。环氧丙烷15 min，环氧丙烷15 min，环氧丙烷与EPON812于室温下进行等比例混合2 h，环氧丙烷与EPON812于室温下1∶2混合4 h，在37 ℃下纯EPON81 24 h。
配置A液-EPON812(1 mL)+DDSA(1.6 mL)，充分搅拌约2 h；B液-EPON812(10 mL)+ MNA(9 mL)，充分搅拌2 h。将A液与B液充分混合1 h之后，滴加0.345 mL DMP-30并于1 h后进行包埋；样品包埋后置入烤箱进行聚合：经过37 ℃ 16 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 14 h，聚合变硬后取出样品并用温水去除胶囊壳，最后将包埋块清理干净后切片。
1.4.5 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测骨细胞凋亡按试剂说明进行，简述如下：①切片常规脱蜡至水，用新鲜配制的体积分数3%H2O2溶液室温处理10 min。②每个标本加Proteinase K 1滴37 ℃孵育箱消化10 min。③加标记缓冲液(Labeling Buffer，TDT和DIG-dUTP各1 μL，加入18 μL标记缓冲液)20 μL/片，湿盒37 ℃ 2 h。④生物素化抗地高辛抗体50 μL/张切片标本    37 ℃ 30 min。⑤加SABC 10 μL，37 ℃ 30 min。⑥DAB显色：新鲜配好的DAB显色液混匀，每片加1滴，室温显色   5 min左右(根据显色情况而定)，水洗。⑦然后用苏木精复染1 min，在盐酸乙醇中分化30 s。在一系列梯度乙醇中脱水、透明，中性树胶封固后在显微镜下观察。
1.4.6 免疫组织化学方法检测低氧诱导因子1α的表达采用SABC法，先将组织切片在烤箱中60 ℃放置60 min，体积分数30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5-10 min用以灭活内源性酶，然后蒸馏水洗3遍，将组织切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后停止，间隔5-10 min后，反复一两次。冷却后用PBS (pH 7.2-7.6)洗涤一两次，滴加5%BSA封闭液，室温中放置20 min，甩去多余液体，不洗，滴加稀释度为1∶500的兔抗兔低氧诱导因子1α多克隆抗体，20 ℃放置2 h，PBS(pH 7.2-7.6)洗涤2 min×3次。滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37 ℃放置20 min，PBS(pH 7.2-7.6)洗涤5 min×4次；使用DAB显色试剂盒(AR1022)，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后滴加到组织切片上，室温下显色，镜下控制反应时间，约10 min，蒸馏水充分洗涤以终止反应，然后用苏木精复染1 min，在盐酸乙醇中分化30 s。在一系列梯度乙醇中脱水、透明，中性树胶封固后在显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①实验动物一般情况。②股骨头形态观察。③标本苏木精-伊红染色观察。④计算各组股骨头组织空缺骨陷窝率，骨细胞凋亡率，低氧诱导因子1α阳性表达率。
1.6 统计学分析数据均以x(_)±s表示，用SPSS 19.0软件进行统计分析，两组间空缺骨陷窝率、低氧诱导因子1α阳性表达率、骨细胞凋亡率的统计检验采用两个对立样本t 检验。空缺骨陷窝率与细胞凋亡率、低氧诱导因子1α阳性表达率与细胞凋亡率相关分析采用线性相关，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

激素是引起非创伤性股骨头缺血坏死的主要因素之一^[13]，其发病机制仍未完全明了。骨细胞是骨组织内存活时间较长的细胞，是股骨头组织的重要组成部分，通过成骨细胞和破骨细胞保持动态平衡。在生理条件下，骨细胞可以通过凋亡进行代谢调节，但在激素、酒精、缺氧等病理条件下，骨细胞凋亡数量会明显增加[14]。骨细胞凋亡与激素性股骨头缺血坏死之间的关系得到国内外众多学者的共识，Mutijima等^[15]发现在激素性股骨头缺血坏死患者股骨头坏死区内存在骨细胞和成骨细胞的大量凋亡，此外，在酒精性、创伤性股骨头坏死中亦发现异常骨细胞凋亡情况。那么究竟是激素对骨细胞直接产生了毒性作用，导致骨细胞凋亡，还是激素引起了股骨头局部血供障碍，通过不同的信号传导通路间接导致骨细胞凋亡，机制仍不清楚。
作者的前期研究结果证实，氧化应激是激素性股骨头缺血坏死的原因之一，激素性股骨头缺血坏死与骨髓造血细胞DNA氧化损伤及骨细胞凋亡存在关联，前者先于后者发生^[5]。Zhang等^[16]发现在激素性激素性股骨头缺血坏死早期，激素通过Wnt/β-cate nin信号传导通路调节c-Myc，进而调控细胞周期和凋亡。本研究发现在空白对照组中，骨细胞凋亡率为(4.896±0.797)%，说明生理条件下存在细胞凋亡，与之前的研究结果一致。本研究进一步证实，在激素性股骨头缺血坏死早期骨细胞的死亡方式为凋亡，实验组与空白对照组的骨细胞凋亡率存在统计学差异，并且实验组中骨细胞凋亡率与空缺骨陷窝率呈正相关，说明空缺骨陷窝内骨细胞发生了凋亡而不是坏死。此外，在电子显微镜下，实验组凋亡小体的数量明显多于空白对照组，遗憾的是无法进行统计学分析。
低氧诱导因子1α是修复细胞内氧环境的核心调节因子，具有促进干细胞增殖，诱导血管生成等重要作用^[17]。骨生成和血管生成时骨骼生长发育的两个重要环节，低氧诱导因子1α是参与和调节上述环节的关键因子，它可以调节基质和血管生成信号，促进骨内新生血管的形成^[18]。Zhang等^[19]对Legg-Calvé-Perthes导致的骨坏死研究中发现，低氧是骨坏死的病因，低氧条件下软骨细胞凋亡增加，低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子以及软骨细胞凋亡参与骨坏死的发生。骨细胞源于成骨细胞，低氧诱导因子α信号传导通路对骨细胞和成骨细胞的形态和功能调节具有重要作用^[20]。基于低氧诱导因子1α与干细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、凋亡的密切调节关系，本研究发现，在激素性股骨头缺血坏死实验组中，低氧诱导因子1α阳性表达率为(6.200±1.480)%，低于空白对照组(19.600± 1.670)%，差异具有统计学意义，说明在低氧诱导因子1α阳性表达率降低与激素性股骨头缺血坏死相关。而且实验组中低氧诱导因子1α阳性表达率与骨细胞凋亡率呈负相关(y(∧)= -4.624X- 27.360)，证实在激素性股骨头缺血坏死中骨细胞凋亡增加与低氧诱导因子1α阳性表达率降低相关。在低氧诱导因子1α对骨细胞的正向调节作用方面，本研究结果与其他学者研究结果一致，不同之处在于发现了激素性股骨头缺血坏死中骨细胞凋亡和低氧诱导因子1α的负向调节关系。
激素可以调节糖、脂肪、蛋白质代谢，还可以调节氧化应激、细胞的增殖与凋亡等^[21]。激素与缺氧之间的关系密切，当机体组织缺氧时，内源性激素分泌可以调节细胞应答，维持正常的细胞ATP需求；在过多的外源性激素作用下，又可以引起机体某些组织的缺氧^[22]。研究发现地塞米松可以抑制低氧诱导的COX-2蛋白和mRNA的表达，还可以抑制低氧诱导因子1通路，进而影响低氧诱导因子1α mRNA表达和蛋白水平^[23]。在常氧情况下，低氧诱导因子1α经泛素蛋白酶体途径迅速降解，在低氧条件下，低氧诱导因子1α稳定，参与细胞代谢、增殖以及血管生成蛋白编码，低氧诱导因子1α对软骨细胞缺血缺氧状态进行适应调节^[24]。Tsuji等^[25]通过实验研究证实在低氧条件下，骨细胞在大剂量激素作用下发生凋亡更加敏感。外源性激素对于低氧诱导因子1α的作用以及对骨细胞的影响关系仍然不明确，本研究证实，在激素性股骨头缺血坏死中，外源性激素减少了低氧诱导因子1α的表达，促进了骨细胞凋亡。这一结果与Tsuji研究结果一致，并且进一步解释了低氧条件状态下激素致使骨细胞易于凋亡的原因。
综上，实验研究发现在激素性股骨头缺血坏死早期，外源性激素导致股骨头局部产生了低氧环境，并且激素抑制了低氧诱导因子1α的表达，进而促进了骨细胞发生凋亡。本实验尚存在以下不足：应增加样本含量，实验时间点间隔应进一步缩短，以明低氧诱导因子及骨细胞凋亡的系列变化；激素如何导致低氧诱导因子1α表达减低以及低氧诱导因子1α如何促进了骨细胞凋亡。如何减少或消除激素对于低氧诱导因子1α表达减低和骨细胞凋亡增加的诱导因素，可能为激素性股骨头缺血坏死的防治关键。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

激素性股骨头坏死过程中低氧诱导因子1α与骨细胞凋亡

Hypoxia inducible factor-1 alpha and apoptosis of osteocytes in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

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