缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.021

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (49): 7994-7999.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.021

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缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制

张亚飞，王加中，吉鸿，陆宏伟，卢乐，王晋龙，尚皓，黎一鸣

西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西省西安市 710004

收稿日期:2015-09-07 出版日期:2015-11-30 发布日期:2015-11-30
通讯作者: 黎一鸣，教授，博士生导师，西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西省西安市 710004
作者简介:张亚飞，男，1989 年生，河南省商丘市人，汉族，西安交通大学在读硕士，主要从事肝胆脾胰疾病基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81170454)

Molecular mechanism of hypoxia-reoxygenation injury to hepatocyte membrane F-actin microfilaments

Zhang Ya-fei, Wang Jia-zhong, Ji Hong, Lu Hong-wei, Lu Le, Wang Jin-long, Shang Hao, Li Yi-ming

Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University School of Medicine, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China

Received:2015-09-07 Online:2015-11-30 Published:2015-11-30
Contact: Li Yi-ming, Professor, Doctoral supervisor, Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University School of Medicine, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Zhang Ya-fei, Studying for master’s degree, Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University School of Medicine, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81170454

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立人肝细胞体外缺氧再给氧损伤模型，模拟移植器官缺血再灌注损伤，从细胞分子水平探讨缺血再灌注所致纤维形肌动蛋白微丝损伤的机制，目前尚无相关研究报道。
目的：分析缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制。
方法：建立体外大鼠肝细胞缺氧再给氧模型。肝细胞随机分为正常对照组、缺氧再给氧组。缺氧再给氧组又分为缺氧再给氧2 h、缺氧再给氧4 h、缺氧再给氧6 h组(分别为细胞缺氧3 h后再给氧2，4，6 h)。光镜观察细胞形态，电镜观察超微结构的改变，共聚焦激光显微镜观察纤维形肌动蛋白微丝含量变化，Real-time PCR 检测 HSP27、丝切蛋白基因的转录水平，Western blot检测HSP27、丝切蛋白蛋白的表达水平。
结果与结论：光镜下缺氧再给氧各组梭形细胞显著增多，且脱落细胞明显增多；透射电镜下缺氧再给氧组与对照组相比内质网数量明显减少，线粒体密度深，糖原消失；共聚焦激光显微镜可见缺氧再给氧组纤维形肌动蛋白纤维荧光紊乱，形态明显改变，荧光染色明显减弱，平均荧光强度缺氧再给氧各组明显低于对照组(P < 0.05)；Real-time PCR和Western blot检测H/R各组HSP27、丝切蛋白基因转录和蛋白表达水平显著低于正常对照组(P < 0.05)。表明缺氧再给氧可能是通过抑制肝细胞内HSP27、丝切蛋白的蛋白表达和基因转录，从而影响纤维形肌动蛋白微丝的正确装配以及减弱纤维形肌动蛋白的正常循环，进而改变纤维形肌动蛋白微丝骨架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 细胞损伤修复模型, 纤维形肌动蛋白, HSP27, 丝切蛋白, 缺氧再给氧, 肝细胞, 分子机制, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human hepatocyte models of hypoxia-reoxygenation injury are established to simulate the ischemia/reperfusion injury of transplanted organ. There have been no research reports addressing the molecular mechanism underlying hypoxia-reoxygenation injury to hepatocyte membrane F-actin microfilaments.
OBJECTIVE: To analyze the molecular mechanism of hypoxia-reoxygenation injury to hepatocyte membrane F-actin microfilaments.
METHODS: Rat hepatocyte models of hypoxia-reoxygenation in vitro were established and then randomly divided into control and hypoxia-reoxygenation groups. The hypoxia-reoxygenation group was also subdivided into three subgroups: hypoxia-reoxygenation-2, 4 and 6 hours (after 3 hours of hypoxia, hepatocytes were given oxygen for 2, 4 and 6 hours respectively). Cell morphology was observed by light microscope, ultrastructural
changes by transmission electron microscope and the change in F-actin microfilament content by confocal laser microscopy. HSP27 and cofilin gene and protein levels were determined by real-time polymerase chain reaction and western blot assay respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Light microscope observations showed that spindle cells and exfoliated cells significantly increased in hypoxia-reoxygenation group. Transmission electron microscope observations showed that in the hypoxia-reoxygenation group, the amount of endoplasmic reticulum significantly decreased, mitochondrial density increased and glycogen disappeared compared with the control group. Confocal laser microscopy observations showed that in the hypoxia-reoxygenation group, F-actin microfilament fluorescence disordered, F-actin microfilament morphology significantly changed, staining intensity significantly attenuated and mean fluorescence intensity was significantly lower than that in control group (P < 0.05). Real-time PCR and western blot detection results showed that HSP27, cofilin gene and protein expression levels in the hypoxia-reoxygenation group were significantly lower than in the control group (P < 0.05). These results demonstrate that hypoxia-reoxygenation affects the correct assembly of F-actin microfilaments and weakens the normal cycle of F-actin microfilaments through inhibiting the protein expression of HSP27 and cofilin, and gene transcription in hepatocytes, thereby changing the skeleton of F-actin microfilaments.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

张亚飞，王加中，吉鸿，陆宏伟，卢乐，王晋龙，尚皓，黎一鸣. 缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7994-7999.

Zhang Ya-fei, Wang Jia-zhong, Ji Hong, Lu Hong-wei, Lu Le, Wang Jin-long, Shang Hao, Li Yi-ming. Molecular mechanism of hypoxia-reoxygenation injury to hepatocyte membrane F-actin microfilaments[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7994-7999.

图/表（结果） 5

2.1 模型创新性/材料、方法的改进氯化钴模拟体外缺氧环境的优点是经济便捷，简单易操作，重复性高，实验条件易控制，更易于缺氧状态的平衡与维持。
2.2 模型稳定性本实验采用国内外公认的化学缺氧剂CoCl2(终浓度为100 μmol/L)处理细胞模拟体外缺氧环境，排除了血流动力学、激素、神经反射的影响，能够准确地反映HSP27、Cofilin蛋白在纤维形肌动蛋白微丝损伤中的作用，模型的稳定性较好。
2.3 光镜下细胞形态学变化肝细胞在正常情况下表现为圆形贴壁生长(图1A)；缺氧再给氧各组梭形细胞显著增多，且脱落细胞明显增多(图1B-D)。

2.4 电镜下细胞超微结构的改变正常肝细胞电镜下细胞质中充满线粒体和内质网(图2A )；缺氧再给氧组与对照组相比内质网数量明显减少，线粒体水样变，糖原消失(图2B-D)。

2.5 缺氧再灌注能明显减少纤维形肌动蛋白微丝的分布对照组可见纤维形肌动蛋白纤维密集分布于细胞周边，荧光染色明亮(图3A)。缺氧组中纤维形肌动蛋白的荧光染色和对照组相似(图3B)；缺氧再给氧组纤维形肌动蛋白纤维荧光紊乱，形态明显改变，荧光染色明显减弱(图3C、D)。各组平均荧光强度，在缺氧组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，缺氧再给氧各组和对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05，图4)。

2.6 缺氧再灌注能明显抑制HSP27、Cofilin基因的转录如图5显示，缺氧再给氧2，4，6 h的L-02细胞HSP27、Cofilin mRNA水平显著低于正常对照组(P < 0.05)。

2.7 缺氧再灌注能明显抑制HSP27、Cofilin蛋白的表达如图6A、B显示，缺氧再给氧2，4，6 h的肝细胞HSP25/27、Cofilin 蛋白表达水平显著低于正常对照组(P < 0.05)。

参考文献

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引言

肝脏结构与功能非常复杂，是一个尚未被完全认识的器官，肝脏疾病，特别是终末期肝病，很多治疗方法都束手无策，肝脏疾病是全球发病率和死亡率的主要原因，对人类的健康构成了极大的威胁^[1-3]。
1963年世界首例人体原位肝移植的成功实施，掀起了进行肝移植手术的世界性热潮[4]，目前，肝移植已成为终末期肝病的一种重要治疗手段。然而肝移植术后高发的胆道并发症仍是进行肝移植面临的世界性难题^[5-7]。其中，移植肝缺血型胆道病变(ischemic type biliary lesion，iTBL)为肝移植后胆道并发症的主要类型，而缺血再灌注损伤被认为是导致移植肝缺血型胆道病变的主要危险因素^[7-8]。
胆小管内有许多由肝细胞膜形成的微绒毛，Tsukada等^[9]发现胆小管微绒毛内包含许多纤维形肌动蛋白微丝束，这些微丝从质膜延伸至管腔共同构成胆小管微绒毛的内芯。微丝在胆小管收缩分泌胆汁方面有着重要的作用，并且能够维持肝细胞和胆小管的正常形态和结构^[10-11]。纤维形肌动蛋白微丝连续的聚合与解聚作用实现胆小管的收缩，进而促进胆汁排泄，微丝完整性的丧失将导致胆汁分泌障碍[^12-14]。故当各种原因损伤了肝细胞骨架而出现微丝功能障碍时，使胆小管收缩受阻，进而胆小管扩张，产生胆汁淤积。已有研究证明肝动脉缺血再灌注早期纤维形肌动蛋白微丝微丝破坏^[13，15-17]，微绒毛丧失。然而，对受损纤维形肌动蛋白微丝、微绒毛和肝细胞的形态学及纤维形肌动蛋白微丝发生这种变化的分子机制尚未见研究报道。因此，从临床角度出发，了解纤维形肌动蛋白微丝异常变化发生的分子机制具有极其重要的理论意义。
HSP27是一种小热休克蛋白，能介导纤维形肌动蛋白微丝的正确装配^[18-19]。Cofilin能改变纤维形肌动蛋白微丝扭曲结构，促进纤维形肌动蛋白微丝的循环^[20-21]。本实验通过建立人肝细胞体外缺氧再给氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤模型，模拟移植器官缺血再灌注损伤，检测HSP27、Cofilin的基因转录和蛋白表达情况，电镜观察超微结构的改变，共聚焦激光显微镜观察纤维形肌动蛋白微丝含量变化，从细胞分子水平探讨缺血再灌注所致纤维形肌动蛋白微丝损伤的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料实验于2014年3月至2014年12月在西安交通大学第二附属医院科研实验中心实验室完成。
实验细胞：大鼠肝细胞购于中国科学院上海生命科学研究院；实验过程中对细胞的处理符合伦理学标准。

1.2 造模方法实验分为正常对照组、缺氧再给氧组，缺氧再给氧组又分为3个亚组：缺氧再给氧2 h、缺氧再给氧4 h、缺氧再给氧6 h组(分别为细胞缺氧3 h后再给氧2，4，6 h)。缺氧再给氧模型：肝细胞常规在体积分数95%O2、5%CO2条件下培养。用化学缺氧剂CoCl2(终浓度为100 μmol/L)处理细胞模拟体外缺氧环境。当肝细胞缺氧3 h后换以完全DMEM高糖培养基置于培养箱中(体积分数95%空气，5%CO2)中静置培养到相应时间点。
1.3 造模成功的检测标准 MTT检测肝细胞，抑制率达50%，同时倒置显微镜下肝细胞发生缺氧形态变化，如细胞由多角形变成圆形，细胞间隙增大，电镜下细胞内线粒体水肿，细胞内空泡样物质增多等，说明造模成功。
1.4 主要观察指标细胞形态及超微结构的改变，纤维形肌动蛋白微丝含量变化，HSP27、Cofilin基因的转录水平，HSP27、Cofilin蛋白的表达水平。
1.4.1 细胞形态学观察倒置显微镜观察各组细胞形状变化及生长状态情况。
1.4.2 透射电镜观察超微结构的改变胰酶消化并收集再给氧不同时间点的L-02细胞，离心成团块，制作电镜超薄切片[22]，透射电镜观察细胞超微结构的改变。
1.4.3 共聚焦激光显微镜观察纤维形肌动蛋白微丝含量变化将细胞种植于无菌片上，18 h后用PBS小心漂洗，然后各组给予相应的处理后，用37 g/L的多聚甲醛于室温下固定10 min，PBS洗3次；在避光条件下滴加FITC- Phalloidin染色液(甲醇溶解，PBS稀释至10 mg/L)，室温孵化1 h，PBS冲洗3次，15 min/次，洗去多余荧光，抗荧光衰减封片剂封固，最后于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，测定肝细胞膜平均特异的荧光强度。
1.4.4 Real-time PC检测HSP27、Cofilin基因的转录水平胰酶消化并收集再给氧不同时间点的肝细胞，Trizol提取总RNA。以总RNA为模板，采用RT-PCR 试剂盒反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR循环。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。HSP27、Cofilin上游引物分别为：5’-CGT TGC CAA TAA CACA AACG-3’、5’-CAA GAA GGA CCT GGT GTT C-3’；HSP27、Cofilin下游引物分别为：5’- GGC TTC TAC TTG GCT CCA GA -3’、5’-TTG GAG CTG GCG TAG ATC ATT-3’；β-Actin上游引物: 5’- CCA GGT CAT CAC CAT CGG-3’；β-Actin下游引物：5’- CCG TGT TGG CGT AGA GGT-3’。荧光定量PCR反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s (40次循环)，以目的序列为内参的比值进行统计学分析。
1.4.5 Western blot检测HSP27、Cofilin蛋白的表达水平根据膜蛋白提取试剂盒操作，提取各实验组肝细胞膜蛋白。采用Bio-Rad电泳装置，将膜蛋白液在分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE，将蛋白样品转移到PVDF膜，脱脂牛奶封闭，抗体孵育，显色剂显色，凝胶成像系统扫膜。将所拍照片结果应用Image Pro图像分析软件处理后，分别得出其IA值，然后分别计算出各组HSP27、Cofilin与β-actin IA之比值，数据经统计学处理并进行比较。
1.5 统计学分析实验数据均以x(_)±s表示，用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，各组间比较采用方差分析，Dunnett-t 检验，组间方差不齐时用采用非参数秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

本实验采用国内外公认的化学缺氧剂CoCl2(终浓度为100 μmol/L)处理细胞模拟体外缺氧环境，排除了血流动力学、激素、神经反射的影响，能够准确地反映HSP27、Cofilin 蛋白在纤维形肌动蛋白微丝损伤中的作用，模型的稳定性较好。氯化钴模拟体外缺氧环境的优点是经济便捷，简单易操作，重复性高，实验条件易控制，更易于缺氧状态的平衡与维持。
电镜结果显示：正常肝细胞电镜下细胞质中充满线粒体和内质网，而缺氧再给氧组与之相比内质网数量明显减少，线粒体密度深，糖原消失。荧光变化和电镜超微结构改变相符，对照组可见纤维形肌动蛋白纤维密集分布于细胞周边，荧光染色明亮，而缺氧再给氧组纤维形肌动蛋白纤维荧光紊乱，形态明显改变，荧光染色明显减弱，平均荧光强度缺氧再给氧各组和对照组相比均有显著性差异(P < 0. 05)。说明缺氧再灌注对细胞活性及纤维形肌动蛋白微丝的分布有明显的抑制作用。这种变化与以往体内实验研究相符^[23]，说明本细胞实验能够较好反映体内纤维形肌动蛋白微丝变化情况，且排除了血流动力学、激素、神经反射的影响，能够准确地反映某些因子或因素在肝脏损伤中的作用。
本实验利用Real-time PCR 检测HSP27、Cofilin基因的转录水平，利用Western blot 检测 HSP27、Cofilin蛋白的表达水平，结果显示：缺氧再给氧2，4，6 h的L-02细胞HSP25/27、Cofilin基因转录和蛋白表达水平显著高于正常对照组(P < 0.05)，且随着再灌注时间的延长，其转录和表达水平有进行性增高的趋势，说明缺氧再给氧对HSP25/27、Cofilin 蛋白的表达和基因的转录起到明显的增强作用，这与本实验荧光变化和电镜超微结构改变相符，提示HSP27、Cofilin蛋白活性的改变可能是缺氧再给氧肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的有效机制。
肌动蛋白的聚合过程可分为4个步骤：肌动蛋白单体的活化；肌动蛋白单体聚合成核；肌动蛋白纤维生长的过程；聚合达到动态平衡^[16-17]。热休克蛋白25/27(HSP27)是一种小热休克蛋白，可由细胞应激性刺激诱导表达，起分子伴侣作用，能介导肌动蛋白的正确装配。HSP27的调节机制依赖于它的蛋白及磷酸化蛋白表达，磷酸化的HSP27是一种具有细胞保护功能的活性形式，但HSP27的磷酸化将破坏其高分子结构，使其失去“分子伴侣”的作用^[18，24]。生理水平的氧自由基对生命是必需的，但大量的氧自由基可导致不可逆的细胞损伤及细胞死亡^[25]。已有实验证明，在动物非骨骼肌细胞中，氧自由基通过活化有丝分裂活化蛋白(MAP)激酶，尤其是活化蛋白激酶2/P38，引起肌动蛋白聚合调节器-HSP27的磷酸化，从而引起肌动蛋白骨架结构明显的改变^[26]，缺氧再给氧后能产生更多的氧自由基^[27]。在本实验中，作者推测缺氧再灌注后肝细胞内产生的大量氧自由基引起HSP27的磷酸化，从而使其失去分子伴侣作用，进而引起纤维形肌动蛋白微丝骨架结构的改变。
此外，丝切蛋白也是细胞骨架塑形的重要调节因素。丝切蛋白可绑定于肌动蛋白微丝或肌动蛋白单体，其主要功能是分解肌动蛋白微丝和增加肌动蛋白单体从肌动蛋白微丝的末端解离的速度，从而促进肌动蛋白微丝的循环^[28]。丝切蛋白的活性依赖于其N端Ser-3位点的磷酸化和去磷酸化^[29]。研究表明，氧化应激可促进内皮细胞丝切蛋白的磷酸化，抑制丝切蛋白的活性，因而可影响肌动蛋白的聚合^[30-31]。作者推测肝细胞缺氧再给氧后，氧化应激促进肝细胞内丝切蛋白的磷酸化，从而减弱其分解肌动蛋白微丝的作用，降低肌动蛋白单体从肌动蛋白微丝的末端解离的速度，影响肌动蛋白微丝的循环，进而引起纤维形肌动蛋白微丝骨架结构的改变。
综上，缺氧再给氧能够增强肝细胞内HSP27、丝切蛋白的磷酸化，影响HSP27、丝切蛋白的生物活性，从而影响纤维形肌动蛋白微丝的正确装配以及减弱纤维形肌动蛋白微丝的正常循环，进而改变纤维形肌动蛋白微丝骨架。细胞实验排除了血流动力学、激素、神经反射的影响，能够准确地反映HSP27、丝切蛋白蛋白在纤维形肌动蛋白微丝损伤中的作用，较好地反映纤维形肌动蛋白微丝损伤的有效机制，从而能够较好的解释体内实验缺血再灌注纤维形肌动蛋白微丝的损伤变化，进一步指导临床。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制

Molecular mechanism of hypoxia-reoxygenation injury to hepatocyte membrane F-actin microfilaments

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