8-溴-7-甲氧基白杨素和索拉非尼对肝癌干细胞样细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：拟尝试结合8-溴-7-甲氧基白杨素和索拉非尼的优点扬长避短，弥补肝细胞癌肿瘤干细胞对索拉非尼的耐药，综合提高肝细胞癌的治疗效果。
目的：观察8-溴-7-甲氧基白杨素和索拉非尼单用及二者联用对体外培养的SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的影响，并分析其作用机制。
方法：8-溴-7-甲氧基白杨素、索拉非尼单用作为对照组，二者合用作为实验组，分别作用于SMMC-7721细胞系球形细胞24 h，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot分析NF-κB(p65)蛋白表达水平。
结果与结论：与8-溴-7-甲氧基白杨素单用和不同浓度索拉非尼单用对照组比较，8-溴-7-甲氧基白杨素与索拉非尼(2.5，5，10，50 μmol/L)二者合用实验组明显提高了SMMC-7721细胞系球形细胞的凋亡率，且明显下调了NF-κB(p65)蛋白的表达。结果表明8-溴-7-甲氧基白杨素可增强索拉非尼对肝癌干细胞样细胞凋亡的诱导作用，作用机制与NF-κB(p65)蛋白表达下调可能相关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 索拉非尼, 8-溴-7-甲氧基白杨素, 肝细胞癌, SMMC-7721细胞系, 细胞凋亡, NF-κB

Abstract:

BACKGROUND: We tried to combine 8-bromo-7-methoxychrysin and sorafenib in order to offset the tolerance of hepatocellular cancer stem cells to sorafenib, thereby comprehensively improving the therapeutic efficacy on hepatocellular carcinoma.
OBJECTIVE: To observe the effects of 8-bromo-7-methoxychrysin, sorafenib and their combination on apoptosis of liver cancer stem-like cells SMMC-7721, and to analyze their mechanisms.
METHODS: SMMC-7721 cells were treated with 8-bromo-7-methoxychrysin, sorafenib alone and their combination for 24 hours. Then, flow cytometry was used to detect cell apoptosis and western blot assay was used to determine nuclear factor-κB protein expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with 8-bromo-7-methoxychrysin group and sorafenib group, the apoptotic rates of SMMC-7721 cells were significantly enhanced after treatment with the combination of 8-bromo-7-methoxychrysin group and sorafenib (2.5, 5, 10, 50 μmol/L), and meanwhile, the protein expression of nuclear factor-κB was down-regulated significantly. These findings indicate that the combined therapy of 8-bromo-7-methoxychrysin group and sorafenib can enhance the apoptosis of SMMC-7721 cells, which may beassociated with down-regulation of nuclear factor-κB protein.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Carcinoma, Hepatocellular, Apoptosis, Cell Line, Tumor, NF-kappa B, Tissue Engineering

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计细胞水平对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年1月在内蒙古医科大学附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞人肝癌细胞系SMMC-7721购自中国科学院上海细胞生物研究所，所有实验细胞均选自对数生长期。

1.3.2 主要试剂和仪器细胞凋亡检测试剂盒A211-01 型(唯赞生物)；增强化学发光试剂盒(Amersham Biosciences)，C6型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养于含有体积分数为5%CO₂混合气体、95%饱和湿度的37 ℃恒温培养箱内，用含有体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养扩增人肝癌细胞系SMMC-7721。

1.4.2 条件培养基悬浮培养SMMC-7721细胞系干细胞，传代培养肿瘤球形细胞

条件培养基悬浮培养SMMC-7721 细胞系干细胞：①取对数生长期SMMC-7721细胞系细胞，经消化后成为单细胞悬液，离心5 min(800 r/min)，弃去上清，用PBS洗涤一两次，离心。②于超低黏附6孔细胞培养板中，用含有100 mg/L链霉素、100 U/mL青霉素G、0.4% BSA、2% B27、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子和4 mg/L胰岛素的DMEM/F12培养基悬浮培养实验细胞，每孔接种量5 000个。③每隔2 d向细胞培养板中加入1 mL上述新鲜干细胞条件培养基，直至第4天，细胞球体直径达到50 μm。

传代培养肿瘤球形成细胞：①将得到的直径达到 50 μm的肿瘤球形细胞收集起来，离心5 min(600 r/min)，弃去上清。②0.05% EDTA-胰蛋白酶消化3 min，待细胞呈单细胞悬液后，离心5 min(800 r/min)，弃去胰蛋白酶。③细胞计数完成后重新于干细胞条件培养基中悬浮培养。④接种至超低黏附6孔培养板中(每孔2 mL，5×10⁸ L^-¹)继续培养，加入相应药物。

1.4.3 细胞凋亡检测试剂盒检测药物处理后肿瘤球形细胞的凋亡 0.1%二甲基亚砜溶媒做为空白对照组，对照组单用BrMC或不同浓度索拉非尼处理SMMC-7721细胞系肿瘤球形细胞，分别为10 μmol/L BrMC组，2.5 μmol/L索拉非尼组，5 μmol/L 索拉非尼组，10 μmol/L索拉非尼组和50 μmol/L索拉非尼组。实验组二者联用处理SMMC- 7721细胞系肿瘤球形细胞，分别为10 μmol/L BrMC+ 2.5 μmol/L 索拉非尼组、10 μmol/L BrMC + 5 μmol/L索拉非尼组、10 μmol/L BrMC+10 μmol/L索拉非尼组和10 μmol/L BrMC+50 μmol/L索拉非尼组。药物分别加入培养基后继续培养24 h，细胞凋亡检测试剂盒处理各组干细胞样细胞，借助Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术分析。FL1通道检测FITC的绿色荧光，FL2通道检测PI的红色荧光；激发波长为488 nm。用Cell Quest等软件绘制散点图，横坐标设为FL1，纵坐标设为FL2。对照组和实验组每组样本至少采集并检测10⁴个细胞。

1.4.4 Western blot法分析NF-κB(p65)蛋白表达 ①用PBS冲洗处理的细胞，加入含有150 mmol/L NaCl、 50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、10%丙三醇、0.2 mmol/L EDTA、0.5 mg/L抑酶醛肽、0.2% NP-40、0.5 mmol/L NaF、1 mol/L β-Me、1 mg/L抑肽酶、0.5 mmol/L 4-NPP、0.1 mmol/L Na₃VO₄及蛋白酶抑制剂的裂解酶缓冲液1 mL，孵育30 min后刮取收集细胞。经13 200×g，4 ℃条件下离心细胞裂解液5 min，得到总细胞蛋白。②采用Bradford 试验(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定NF-κB(p65)蛋白质含量。电泳分离提取的总蛋白质(10% SDS-聚丙烯

酰胺凝胶电泳)，转移至PVDF膜。③在PBST中，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，一抗抗体选择鼠抗人NF-κB(p65)单克隆抗体孵育，轻微振动下4 ℃过夜。冲洗PVDF膜4次，加入过氧化物酶标记的二抗抗体孵育1 h。采用增强化学发光试剂盒(Amersham Biosciences)检测二抗抗体上标记物的信号。

1.5 主要观察指标 ①人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肿瘤球生长情况。②不同药物处理后肿瘤球形细胞的凋亡率。③不同药物处理后肿瘤球形细胞的NF-κB(p65)蛋白表达。

讨论

目前临床治疗肝细胞癌的常用药物是索拉非尼。索拉非尼是作为晚期肝癌治疗的标准用药^[6]，其作用机制包括^[7-9]：①靶向作用于Ras/Raf/MAPK通路上的Raf激酶，使磷酸化水平下降，抗凋亡蛋白的表达随即减少，直接抑制肿瘤细胞增殖，从而诱导癌细胞凋亡。②抑制VEGFR-2、VEFRG-3 等受体活性从而抑制肿瘤血管生成，间接抑制肿瘤细胞增殖。临床可见原发性肝癌干细胞对索拉非尼存在耐药现象，这一现象影响了药物对肝癌的疗效。

8-溴-7-甲氧基白杨素(8-bromo-7-methoxychrysin，BrMC)是白杨素(chrysin)的一种衍生物。白杨素即5，7-二羟基黄酮，是一种黄酮类化合物，具有广泛生物活性。研究表明，在体外白杨素可发挥抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用，然而在体内却没有达到这样的效应，可能的原因是白杨素在体内经过广泛代谢，代谢物排入小肠水解或者直接随粪便排出，无法达到有效的药物浓度，口服生物利用度较低，故无法取得同体外一样良好的效果。定向化学修饰白杨素的空间结构^[10]，使其物理、化学发生变化，也有望改变其生物活性，从而提高其口服生物利用度。研究表明，在黄酮的芳环上引入电负性最强的元素之一溴，可明显增加其口服生物利用度。此次研究所用的BrMC就是在白杨素的母核第7位上加上甲氧基，8位上引入溴。在体内BrMC可通过产生活性氧和活化JNK途径，诱导肝癌细胞凋亡，发挥与白杨素相似的抗肿瘤作用^[11-12]。

肿瘤干细胞具有失巢性凋亡抗性的特点，基于这一性质，干细胞条件培养基悬浮培养法可以对肿瘤干细胞有效进行富集和分选，原理如下：在无血清的条件下，向培养基中添加成分完全明确的生长因子，这些成长因子既可以代替血清满足细胞生长需要，又不会出现血清的诱导分化问题^[13]。此次研究中，SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞能够被干细胞条件培养基悬浮培养法收集，这也说明肝细胞癌肿瘤细胞呈非黏附性克隆球生长。本研究通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果显示BrMC可提高SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡率，这与Hamstra^[14]结论一致，不同浓度的索拉非尼均可提高SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡率，且索拉非尼浓度越高，诱导SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞作用越明显，这一发现也与Zhou等^[15]的观点一致。相比于各单用药物的对照组，BrMC与索拉非尼二者联用实验组诱导SMMC-7721细胞系球形细胞凋亡率升高更明显，甚至大于相应各单用药物对照组升高的凋亡率之和，这些结果提示BrMC对索拉非尼诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡有明显的增强作用。

作为一种广泛存在于哺乳动物中的转录因子，NF-κB通过特异性结合B淋巴细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子 κB序列，大幅度刺激相应基因的转录，从而介导多种肿瘤的发生、发展、转移以及抗凋亡效应^[16-18]。近年来关于NF-κB的研究热点多与肿瘤的发生、发展、转移以及化疗耐药有关。报道显示，在多种耐药的肿瘤细胞系中均可见NF-κB存在着异常的表达^[19-20]。有动物模型研究显示，索拉非尼和相关的抗血管生成物质在初始阶段发挥抗肿瘤作用之后，反而导致肿瘤发展和转移发生的增加，这在一些成胶质细胞瘤、乳腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤的小鼠模型均可以出现^[21-23]。Baxter等^[24]研究表示，其发生机制可能是由于索拉非尼等药物的抗血管生成的治疗作用导致肿瘤组织局部缺氧，从而诱导选择高度耐药肿瘤干细胞以适应氧气和营养物质耗竭的环境。与人肝细胞癌SMMC-7721细胞系细胞相比，SMMC-7721细胞系球形细胞高表达NF-κB(p65)蛋白，这一研究结果与Jariwala等^[25]相同。此外，从结果中还可以看出，BrMC与索拉非尼合用，SMMC-7721细胞系球形细胞NF-κB(p65)蛋白表达明显下调。结合上述BrMC对索拉非尼诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡有明显的增强作用，可发现二者有潜在联系，即BrMC对索拉非尼诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的增强作用可能与二者联用协同下调肝癌干细胞样细胞NF-κB(p65)蛋白表达有关。

综上，此次研究表明BrMC和索拉非尼均可诱导人肝细胞癌SMMC-7721球形细胞的凋亡，而两者联用由于协同效应会显示更强的诱导凋亡作用，其作用机制与协同性下调肝癌干细胞样细胞NF-κB(p65)蛋白表达有关，这一结果可为临床联用BrMC和索拉非尼治疗肝细胞癌提供实验依据，但其临床疗效尚需更多研究来证实。
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