氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构和骨髓基质细胞分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨质疏松是一种好发于绝经后妇女的慢性骨代谢疾病，随着世界人口老龄化的增加，如何预防和治疗绝经后骨质疏松是目前困扰医疗界的一大难题。
目的：探讨氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构和骨髓基质细胞分化的影响。
方法：将30只3月龄雌性健康未孕SD大鼠去卵巢，因2只大鼠由于感染死亡，将剩下28只大鼠随机分为去卵巢体内组(9只)、去卵巢体外组(10只)和氯化锂组(9只)。手术后第11周，氯化锂组按照体质量每周腹腔注射3次氯化锂，剂量为15 mg/kg，干预8周后，用micro-CT检测9只去卵巢体内组和9只氯化锂组大鼠左侧股骨的骨微结构。10只去卵巢体外组大鼠的双侧股骨和胫骨用于骨髓基质细胞的培养，接种24 h后加入氯化锂，分为0 mmol/L(对照组)、1 mmol/L组和5 mmol/L组，培养至第6天和第8天更换培养基并加入相应浓度氯化锂，培养第10天处理细胞，用Western blot检测其SP7、Runx2和PPARγ2蛋白的表达水平。
结果与结论：①体内结果表明，氯化锂组体积骨密度、骨体积分数和骨小梁数目显著高于去卵巢体内组，骨小梁间隙显著低于去卵巢体内组，而骨小梁厚度和结构模型指数无显著变化。②体外结果表明，1 mmol/L和5 mmol/L氯化锂组骨髓基质细胞Sp7和Runx2蛋白表达水平显著高于对照组，而PPARγ2蛋白表达水平显著低于对照组。③以上实验结果表明，氯化锂可能是通过促进去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞向成骨分化而改善去卵巢骨质疏松大鼠的骨微结构。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 氯化锂, 去卵巢骨质疏松大鼠, 骨髓基质细胞, Micro-CT, 成骨分化, 成脂分化, SP7, Runx-2, PPARγ2

Abstract:

BACKGROUND: Osteoporosis is a bone metabolic disease that affects women more than men. Prevention and treatment of osteoporosis is becoming a serious medical problem because of the aging of the population.
OBJECTIVE: To explore the effects of lithium chloride treatment on bone microarchitecture and bone marrow stromal cell differentiation of ovariectomized osteoporosis rats. METHODS: After ovariectomy, 28 of 30 healthy female Sprague-Dawley rats, 3 months old, were randomly divided into the following three groups: ovariectomized in vivo group (9 rats), ovariectomized in vitro group (10 rats), and lithium chloride group (9 rats). At the 11^th week postoperatively, rats in the lithium chloride were intragastrically injected with lithium chloride at a dose of 15 mg/kg, three times per week. After 8 weeks of treatment, the bone microarchitectures of the rat left femur in the ovariectomized in vivo group and lithium chloride group were detected by micro-CT. The bone marrow mesenchymal stem cells were freshly isolated from the bone marrow of the bilateral femurs and tibia of rats in the ovariectomized in vitro group. After 24 hours of inoculation, the cells were cultured in lithium chloride and divided into 0 mmol/L (control), 1 mmol/L and 5 mmol/L groups. At 6 and 8 days of culture, the medium was changed and lithium chloride with the corresponding concentrations was added. At 10 days of culture, western blot assay was adopted to detect protein expression of Runx-2, SP7 and PPARγ2.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the ovariectomized in vivo group, the volume density of trabecular bone, number of trabecular bone, and bone volume fraction in the lithium chloride group were significantly increased and the separation of trabecular bone was significantly decreased. However, no differences were seen in the thickness of trabecular bone and structure model index. (2) Lithium chloride at 1 and 5 mmol/L could increase the protein expression of Sp7 and Runx-2 in bone marrow stromal cells, but decrease the protein expression of PPARγ2. These results indicate that lithium chloride may improve the microarchitecture of the trabeculr bone in ovariectomized osteoporosis rats through stimulating the osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells.

Key words: Osteoporosis, Postmenopausal, Lithium Chloride, Glycogen Synthase Kinase 3, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭盖，卜淑敏，陈冠洁. 氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构和骨髓基质细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.005.

Guo Gai, Bu Shu-min, Chen Guan-jie . Lithium chloride effects on bone microarchitecture and bone marrow stromal cell differentiation of ovariectomized osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.005.

图/表（结果） 7

2.1 去卵巢骨质疏松大鼠模型的建立去卵巢大鼠骨质疏松造模成功一般需要8-10周。大鼠去卵巢后，如果去卵巢手术成功，其体质量在去卵巢后的2周内迅速增加，到8周时骨量会显著下降。去卵巢10周时，将大鼠麻醉后俯卧在双能X射线骨密度仪的测量台上进行骨密度检测以验证模型的建立。实验过程中有2只大鼠因手术感染先后死亡。
2.2 大鼠体质量的动态变化由图1可知，从实验开始(第0周)到第19周结束，去卵巢体内组大鼠与氯化锂组大鼠体质量差异均无显著性意义。

2.3 大鼠股骨Micro-CT结果
2.3.1 大鼠股骨骨微结构的变化 Micro-CT三维结构重建结果表明，与去卵巢体内组比较，氯化锂组大鼠体积骨密度、骨体积分数和骨小梁数目显著增加，骨小梁间隙显著降低，而骨小梁厚度和结构模型指数差异无显著性意义，见表1。

2.3.2 大鼠股骨Micro-CT矢状面扫描图由图2可知，与去卵巢组比较，氯化锂组大鼠股骨感兴趣区域骨小梁厚度变厚、间隙变小、数目增多。

2.3.3 大鼠股骨松质骨感兴趣区域三维结构重建图由图3可知，与去卵巢体内组大鼠比较，氯化锂组大鼠股骨松质骨区域得到部分修复。

2.4 氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞分化相关蛋白表达的影响
2.4.1 氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞Runx-2蛋白表达的影响由图4可知，与对照组比较，1 mmol/L氯化锂组和5 mmol/L氯化锂组Runx-2蛋白表达水平均显著增加。

2.4.2 氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞SP7蛋白表达的影响由图5可知，与对照组比较，1 mmol/L氯化锂组和5 mmol/L氯化锂组骨髓基质细胞SP7蛋白表达水平均显著增加。

2.4.3 氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞PPARγ2蛋白表达的影响由图6可知，与对照组比较，1 mmol/L氯化锂组PPARγ2蛋白表达水平差异无显著性意义，而5 mmol/L氯化锂组PPARγ2蛋白表达水平显著降低。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞培养实验、动物体内实验。
1.2 时间及地点于2014年9月至2015年6月在首都体育学院细胞分子生物学实验室完成。
1.3 实验动物和材料 30只3月龄雌性健康未孕SD大鼠，体质量(247.24±8.01) g，购买于北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(京)2014-0015，饲养于北京大学医学部实验动物科学部，实验过程严格遵守动物伦理学准则。

1.4 实验方法
1.4.1 去卵巢骨质疏松大鼠模型的建立健康3月龄雌性未经产清洁级SD大鼠30只，在通风无菌环境下自由采食与饮水，饲养1周后，以10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，经背部切口，摘除双侧卵巢。饲养10周后，将造模成功的28只去卵巢大鼠按体质量分层后随机分为去卵巢体内组(9只)、去卵巢体外组(10只)和氯化锂组(9只)。
1.4.2 大鼠体内氯化锂干预方案手术后第11周，氯化锂组大鼠按体质量腹腔注射氯化锂，注射剂量为15 mg/kg，
每周3次；去卵巢体内组大鼠按体质量腹腔注射同体积的生理盐水，每周3次；去卵巢体外组大鼠不做任何处理。干预8周后，于末次干预36-48 h内处死去卵巢体内组和氯化锂组大鼠，而去卵巢体外组大鼠用于后续骨髓基质细胞的体外培养。
1.4.3 股骨骨微结构检测用Micro-CT检测9只去卵巢体内组和9只氯化锂组大鼠左侧股骨的骨微结构。扫描时，设置电压为60 kV，电流为0.666 667 mA，4帧叠加(每个角度拍摄4张图片，在4张中选择最好的一张作为最后图像)，角度增益0.72°，曝光时间400 ms，分辨率为46 μm×46 μm× 46 μm，进行扫描。扫描得到Prj格式图像，将Prj导入软件medproject，处理后得到IMO格式图像，对IMO图像进行重建后，将IMO转化为Dicom格式图像。将Dicom图像的数据导入软件Mimics，设置分割阈值为16-162，转化后优化图像，得到三维STL图像。
1.4.4 大鼠骨髓基质细胞的体外培养和药物处理采用全骨髓贴壁法培养10只去卵巢体外组大鼠的骨髓基质细胞。断头放血处死大鼠后，立即浸泡于体积分数为75%乙醇中10 min，无菌条件下取双侧股骨和胫骨，仔细除去表面的软组织，咬骨钳咬除股骨和胫骨两端，露出骨髓腔，用预先吸入5 mL培养基的注射器冲洗骨髓腔，将冲洗液置于刻度离心管中，1 000 r/min离心6 min。小心弃上清，重复离心3次后每管重新加入含体积分数为10%牛血清的完全培养液4 mL，轻轻吹打成单细胞悬液，将细胞接种于60 mm培养皿中，放入体积分数为5%CO₂、37 ℃的CO₂培养箱内培养，第2天加入不同浓度的氯化锂，分别为0 mmol/L(对照组)、1 mmol/L和5 mmol/L^[8]，培养至第6天和第8天时更换含体积分数为10%牛血清的培养基并加入不同浓度氯化锂，培养至第10天(末次加入氯化锂后48 h)结束培养。
1.4.5 骨髓基质细胞蛋白的提取和Western blot检测培养结束后，用PBS清洗细胞2次，每次5 min。按比例加入适量蛋白裂解液(预先加入10 μL PMSF蛋白酶抑制剂)与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)(按照4∶1)混匀，用细胞铲将贴壁细胞铲入液体中，搅拌混匀后在4 ℃冰箱中作用30 min，4 ℃、13 000 r/min离心30 min，取上清沸水煮 5 min，待冷却后分装放入-80 ℃保存。
将提取的蛋白样品20 μL上样，以80 V电压，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离约2 h后，以80 V电压转移 2 h。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，将PVDF膜与一抗4 ℃过夜，次日TBST洗3×10 min，分别加碱磷酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗3×10 min，在BCIP/NBT显色液中显色至蓝色条带出现，放入水中终止显色，拍照，用Quantity One软件对各蛋白条带照片进行扫描，计算目的条带灰度值与β-actin灰度值之比，作为该蛋白表达的相对值。
1.5 主要观察指标 ①氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠体质量、股骨骨微结构的影响。②不同浓度氯化锂对体外培养的去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞Runx-2、SP7、PPARγ2蛋白表达水平的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析，结果以x±s表示，进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松是由多种因素引发的一种骨代谢性疾病，会造成骨组织骨量减少，使患者增加骨折的风险^[9-10]。绝经后骨质疏松是由于女性绝经后雌激素缺乏造成，同时还受到营养状况和生活习惯的影响，特征为骨吸收活动增强，其在绝经后女性人群中有较高的发病率，绝经后女性每年骨量的丢失可达到3%-5%，严重影响老年女性生活^[9-10]。目前用于治疗绝经后骨质疏松的首选方法是雌激素替代疗法^[11]，但是长期服用雌激素会给患者带来不良反应，迫使患者想要采取其他治疗方法，例如服用金雀异黄酮。金雀异黄酮是存在于大豆产物中的主要生理雌激素，已有的体内和体外实验表明，口服金雀异黄酮可以积极促进骨健康^[12]，而且金雀异黄酮不仅有治疗骨质疏松的效应，而且还有类似雌激素的效用，是一种潜在的治疗骨质疏松的良好药物疗法。因此，研究治疗骨质疏松的其他药物手段是可行且具有很大意义的。
Wnt信号通路是一条十分保守的信号传导通路，越来越多的研究表明，其在胚胎的发育、多种组织、器官、干细胞形成与分化以及人类多种疾病的发生过程中起作用^[13-14]。目前已知的Wnt信号通路有4条，分别为Wnt/钙离子通路、平面极细胞通路、调节纺锤体的方向和非对称细胞分裂的胞内通路、经典Wnt/β-catenin通路。经典Wnt/β-catenin信号通路一方面促进成骨细胞增殖与分化，另一方面抑制成骨细胞凋亡，促进骨形成^[15]，该通路也被研究成为促进骨形成机制的核心通路^[16]。
β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分，也是激活该信号通路的必要条件，它能够参与调节细胞的增殖、分化、生存与凋亡^[17-18]。GSK3β同样是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分，有研究表明GSK3β能够与β-catenin发生反应，使后者磷酸化降解，这个磷酸化过程主要发生在无Wnt信号通路的时候，有研究表明，在对骨代谢方面，当Wnt/β-catenin信号通路受抑制时，会伴随着骨量的降低^[19-21]。Wnt/β-catenin信号通路可以促进成骨细胞的增殖和分化，增加成骨作用，使骨量增加。同时可以降低脂肪细胞分化与形成，降低脂肪量^[22]。
氯化锂是Wnt/β-catenin信号通路中GSK3β的抑制剂^[23]，它可以通过对GSK3β的抑制，防止GSK3β与β-catenin进行反应，使得β-catenin能够集聚进入细胞核，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，已有研究表明β-catenin水平的提高可以刺激骨髓基质细胞的成骨分化，促进骨形成^[7，24]。
大鼠去卵巢之后由于雌激素缺乏，代偿性地引起脂肪生成增多，体质量随之迅速增加^[23]。本实验中，去卵巢骨质疏松大鼠经氯化锂干预8周后，体质量无显著变化。结果提示，氯化锂干预不能抑制去卵巢大鼠体质量的增加。
Micro-CT通过X射线扫描和三维结构重建，可以用于直接测量各种形态骨结构的厚度，能够准确描述骨结构的三维分布和形态特征，是理想化的研究骨形态学工具^[25]。本实验通过Micro-CT扫描和三维结构重建，检测了腹腔注射氯化锂8周对去卵巢骨质疏松大鼠股骨骨微结构的影响。结果表明，氯化锂干预能显著增加去卵巢骨质疏松大鼠股骨松质骨的体积骨密度、骨体积分数和骨小梁数目，降低骨小梁间隙，但对骨小梁厚度和结构模型指数没有影响。结果提示，8周氯化锂干预能改善去卵巢骨质疏松大鼠股骨松质骨的部分结构参数。
牛银波等^[26]对去卵巢大鼠给予氯化锂10周，发现氯化锂能够降低去卵巢骨质疏松大鼠的体质量，同时提高股骨骨密度。该研究的股骨骨密度结果与本实验相一致，但体质量结果与本实验有差异，造成差异的原因可能是由于实验方法不同，虽然都是氯化锂干预，但本实验注射剂量为15 mg/kg，每周3次，总共8周，而牛银波等实验氯化锂注射剂量为140 mg/(kg•d)，持续10周，可能由于氯化锂干预的剂量、频率与周期不同，最终导致体质量结果有差异。
骨髓基质细胞具有向成骨分化和成脂分化等多方向分化的能力，它是骨、脂肪等组织形成的重要前提条件，并且成骨细胞的大量形成需要成脂细胞的减少才能完成^[27]。Runx-2是转录因子Runxx家族成员之一，是骨细胞的特异转录因子，它可以通过调控骨髓基质细胞向成骨细胞分化，促进骨的形成，因此在骨组织的形成、骨代谢的调控和骨发育过程中有极其重要的作用^[28]。Nakashima等^[29]在小鼠体内发现SP7的缺失会直接引起骨形成能力完全丧失，SP7是一种对成骨细胞分化很重要的转录因子，成骨细胞的最终分化与成熟需要SP7的作用，它在临床上对于骨质疏松研究具有现实意义。PPARγ2是PPARγ的亚型之一，它是脂肪分化的主要调控因子，对骨髓基质细胞的分化方向起关键的调控作用。PPARs是影响脂肪细胞分化的重要家族，此家族能够使得脂肪细胞特异性基因表达^[30]。Khan等^[31]报道，PPARγ2的激活能够抑制成骨细胞分化。本实验中，1 mmol/L和5 mmol/L氯化锂能显著增加去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质细胞Runx-2和SP7蛋白的表达水平，降低其PPARγ2蛋白表达水平，提示1 mmol/L和5 mmol/L氯化锂均可促进去卵巢大鼠骨髓基质细胞向成骨分化，且能够抑制其向成脂分化。
综上所述，体内氯化锂干预能部分改善去卵巢骨质疏松大鼠股骨松质骨的骨微结构。体外氯化锂干预能显著促进去卵巢骨质疏松大鼠成骨相关分子Runx-2和SP7蛋白的表达水平，降低其成脂相关分子PPARγ2蛋白表达水平。因此，氯化锂可望成为一种防治绝经后骨质疏松的药物。