人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞静脉移植治疗糖尿病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰腺或胰岛细胞移植以及干细胞移植治疗为根治糖尿病带来了希望，但是胰腺或胰岛移植会出现供者缺乏和免疫排异反应问题而限制了其在临床的发展，因此干细胞移植治疗成为目前研究的热点。

目的：观察人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对SD大鼠糖尿病的治疗效果。

方法：以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞。从36只雄性SD大鼠中随机取6只作为对照组，注射生理盐水，其余30只注射链脲霉素(按45 mg/kg)建立糖尿病模型后，随机等分为干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组和糖尿病组。造模后干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组大鼠通过尾静脉注入1 mL骨髓间充质干细胞(1.5×10¹⁰ L^-¹)和1 mL人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞(1.5×10¹⁰ L^-¹)。

结果与结论：注射链脲霉素24 h后，与对照组相比，糖尿病组大鼠空腹血糖明显增加，且高于正常值 (6.7 mmol/L)；移植后15 d，与糖尿病组相比，干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05)，体质量显著增加(P < 0.05)，人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组较干细胞组更为明显；移植后45 d，干细胞组、人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平与体质量接近对照组(P > 0.05)，人端粒酶反转录酶基因转染干细胞组优于干细胞组，而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，且体质量持续下降。上述结果提示人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞能有效治疗大鼠糖尿病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 糖尿病, 干细胞移植, hTERT基因, 空腹血糖, 胰岛细胞, 体质量

Abstract:

BACKGROUND: Pancreas or islet cell transplantation and stem cell transplantation bring hope to cure diabetes, but pancreas or islet transplantation appears to have a lack of donors as well as immune rejection problems, limiting their clinical development. Therefore, stem cell transplantation therapy has become the current hotspot.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effects of huaman telomerase reverse transcriptase (hTERT)-modified bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on diabetes mellitus in SD rats.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were transfected with PLXSN carrying hTERT. Thirty-six male SD rats were randomly divided into control group (n=6), stem cell group (n=10), hTERT transfection group (n=10), diabetes mellitus group (n=10). Except the control group, the rats were injected with stretozotocin
(45 mg/kg) to make diabetes mellitus models. After modeling, rats in the stem cell group and hTERT transfection group were respectively intravenously injected with 1 mL of bone marrow mesenchymal stem cells (1.5×1010/L) and 1 mL of hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cells (1.5×1010/L).
RESULTS AND CONCLUSION: At 24 hours after modeling, the fasting blood-glucose level was significantly increased in the diabetes mellitus group, which was higher than the normal value (6.7 mmol/L). At 15 days after cell transplantation, the fasting blood-glucose levels were signficiantly decreased in the stem cell group and hTERT transfection group as compared with the diabetes mellitus group (P < 0.05), but the body mass of rats was increased in these two group (P < 0.05), especially in the hTERT transfection group. At 45 days after cell transplantation, the fasting blood-glucose level and body mass in the stem cell group and hTERT transfection group were close to those in the control group (P > 0.05), and moreover, the hTERT group had better outcomes than the stem cell group. Meanwhile, in the diabetes mellitus group, the fasting blood-glucose level was still at a higher level, and the body mass decreased continously. These findings suggest that hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is effective for treatment of diabetes mellitus in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Diabetes Mellitus, Hyperglycemia

中图分类号:

R394.2

刘佳. 人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞静脉移植治疗糖尿病[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4549-4554.

Liu Jia. Telomerase reverse transcriptase genetic modification of bone marrow mesenchymal stem cells in diabetes treatment [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4549-4554.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态大鼠骨髓细胞培养72 h后可见少量细胞贴壁，第5天时贴壁细胞及集落数目明显增多(图1A)。10-14 d后骨髓间充质干细胞能铺满80%瓶底，以成纤维样细胞为主，苏木精-伊红染色可见核内有2-4个明显核仁(图1B)；传1，2，3代的细胞增殖活跃，传代第1天、第2天可见绝大多数细胞单层贴壁生长，胞体呈梭形、椭圆形、扁平形、三角形、不规则形，折光性强，长有两个或多个突起，有的突起相互连接，可见细胞核及核仁，当细胞融合时，呈平行或漩涡状生长(图1C)。
2.2 RT-PCR检测hTERT mRNA的表达经hTERT基因转染48 h后，hTERT基因转染组骨髓间充质干细胞hTERT基因表达量较正常细胞组显著升高(0.49±0.06，0.40±0.04)，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。2.3 Western blot检测hTERT蛋白的表达经hTERT基因转染48 h后，hTERT基因转染组骨髓间充质干细胞hTERT蛋白表达量较正常细胞组显著升高(1.58±0.14，0.99±0.08)，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 细胞生长曲线经hTERT基因转染沉默后，hTERT基因转染组细胞增殖能力较正常细胞组明显增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 流式细胞仪检测细胞周期 hTERT基因转染组S期细胞明显多于正常细胞组，G₁期细胞明显少于正常细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)，M期细胞无明显变化，见表1。

2.6 实验动物数量分析参加实验36只SD大鼠，其中6只大鼠为对照组，30只大鼠进行造模，均一次建模成功，全部进入结果分析。
2.7 骨髓间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空腹血糖水平的影响大鼠注射链脲霉素24 h后，与对照组相比，糖尿病组大鼠空腹血糖明显增加(P < 0.05)，且高于正常值(6.7 mmol/L)；给药后30 d，糖尿病组大鼠空腹血糖仍维持在较高水平，且高于对照组(P < 0.05，表2)。
移植骨髓间充质干细胞后糖尿病大鼠空腹血糖逐渐下降。移植后15 d，与糖尿病组相比，干细胞组、hTERT基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05)，hTERT基因转染干细胞组较干细胞组下降更为显著；移植后45 d，干细胞组大鼠空腹血糖水平接近正常值，与对照组接近(P > 0.05)，hTERT基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平降至正常值。糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，无明显变化(表2)。

2.8 骨髓间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体质量的影响骨髓间充质干细胞移植后大鼠体质量逐渐增加。移植后15 d，与糖尿病组相比，干细胞组、hTERT基因转染干细胞组大鼠体质量显著增加(P < 0.05)，hTERT基因转染干细胞组较干细胞组更为明显；移植后45 d，hTERT基因转染干细胞组大鼠体质量与对照组接近(P > 0.05)，而糖尿病组大鼠体质量持续下降(表3)。

2.9 骨髓间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响与对照组相比，糖尿病组大鼠空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数明显增加(P < 0.05)，而与糖尿病组相比，干细胞组、hTERT基因转染干细胞组大鼠空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数显著下降(P < 0.05，表4)。

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引言

材料方法

讨论

骨髓间充质干细胞是目前干细胞移植研究的热点。骨髓间充质干细胞不断被发现具有多向分化能力，其分化潜能不仅仅局限于中胚层组织，而且还可以在特定的条件下跨胚层横向分化出内胚层和外胚层的组织细胞。研究表明，能够将外源性基因修饰骨髓间质干细胞，进而创建一种安全基因治疗的“细胞载体”，同时骨髓间充质干细胞能够克服移植排斥反应，从而真正实现自体移植，无伦理学争议^[21-23]。

hTERT是调控端粒酶活性的重要因素，其具有多重生物学效应和重要的临床价值，可以促进胚胎组织发育、分化及细胞的生长、增殖等生物学特性。hTERT是端粒酶的催化亚单位，在端粒酶的激活中发挥重要作用，正常组织中hTERT表达被抑制。研究表明，hTERT基因的siRNA表达载体能与靶基因进行有效结合，且能减低端粒酶活性，降解hTERT mRNA，使hTERT蛋白的表达下调，进而导致增殖速度减低，细胞生长抑制。由于hTERT基因的半衰期短、组织含量较低等原因，导致外源性hTERT通过局部或全身给予时都很难达到有效治疗的目的；而基因转入技术采用适合的载体将外源性hTERT基因转入体内，能够持续表达hTERT，使其可以发挥长期、高效的作用，以便达到理想的治疗效果。本实验结果显示转染hTERT基因后骨髓间充质干细胞hTERT基因和蛋白表达量较正常细胞组显著降低(P < 0.05)。

随着干细胞移植技术的不断发展，医学界开始探究干细胞移植治疗糖尿病的可能性^[24]。有研究表明，小鼠骨髓间充质干细胞可在体外经诱导分化为表达一系列胰岛β细胞的相关基因，β细胞在接受葡萄糖刺激后，出现胰岛素和C肽的表达，把这些集合体移植到糖尿病大鼠肾包膜内，空腹24 h血糖及腹腔糖耐量试验均得到改善。Hess等^[25]将骨髓间充质干细胞移植到糖尿病大鼠体内，结果观察到血糖下降，胰岛素分泌正常，骨髓来源的细胞主要分布在导管和胰岛，进一步研究表明，骨髓来源的干细胞移植诱导了胰腺的血管新生，诱发了胰岛β细胞自身的再生，促进了β细胞的修复，推测移植的骨髓干细胞主要起着促进和支持的功能；这些研究均表明，糖尿病患者可以利用自身骨髓间充质干细胞治疗，更可完全避免移植后带来的免疫排斥反应^[26]。

研究结果显示，大鼠注射链脲霉素24 h后，糖尿病组大鼠空腹血糖显著增高。移植后15 d，干细胞组、hTERT基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平较糖尿病组明显下降，体质量明显增加。移植后45 d时，干细胞组、hTERT基因转染干细胞组大鼠空腹血糖水平与体质量接近对照组水平，而糖尿病组大鼠空腹血糖却在较高水平，且体质量持续下降。这些结果表明hTERT基因转染的骨髓间充质干细胞可以有效改善大鼠糖尿病症状。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程