不同方式诱导骨髓间充质干细胞的效果比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往大多采用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，但诱导效果不佳。

目的：对比分析骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞共培养诱导、转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨样细胞的效果。

方法：获取SD大鼠关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞，分别设置1∶2，1∶1，2∶1浓度组，以转化生长因子β1 诱导组为对照。经诱导培养20 d后MTT法检测细胞活力，阿利新蓝比色法检测氨基聚糖含量，Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白表达。

结果与结论：转化生长因子β1组的吸光度值显著小于软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组和软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组(P < 0.05)。转化生长因子β1组的氨基聚糖含量和Ⅱ型胶原蛋白表达显著低于软骨细胞和骨髓间充质干细胞(1∶2，1∶1，2∶1)组。软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组与软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组之间各指标比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明关节软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养，可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，且骨髓间充质干细胞对软骨细胞诱导存在饱和现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 诱导, 软骨细胞, 骨髓间充质干细胞, 关节, 共培养, 转化生长因子β1

Abstract:

BACKGROUND: Transformation growth factor beta 1 is mostly used to induce the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, but there is a poor induction efficacy.

OBJECTIVE: To explore the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with articular chondrocytes or induced by transforming growth factor beta 1.

METHODS: Articular chondrocytes and bone marrow mesenchymal stem cells from SD rats were harvested and divided into 1:2, 2:1, 1:1 concentration groups. Cells induced by transforming growth factor beta 1 acted as control group. After 20 days of induced culture, MTT was used to detect cell viability, alcian blue colorimetric assay was applied to measure glycosaminoglycan content, and western blot assay was employed to determine the expression of collagen type II.

RESULTS AND CONCLUSION: The absorbance value in the control group was significantly lower than that in the 1:1 and 2:1 groups (P < 0.05). Glycosaminoglycan content and protein expression of collagen type II were also lower in the control group than the 1:2, 1:1, 2:1 groups. But there was no difference between 1:1 and 2:1 groups (P > 0.05). The results show that bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with articular chondrocytes can be induced to differentiate into chondrocytes, and meanwhile, there is a saturation phenomenon during the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Chondrocytes, Coculture Techniques, Transforming Growth Factor beta1

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

运动不当或运动过度容易磨损软骨，不及时治疗还会引发关节炎、关节肿胀及关节畸形等^[1]。与人体的其他部位不同，软骨组织没有神经，一旦受伤或者磨损后，不会有疼痛的感觉，所以往往容易被忽视，但关节表面的小伤口如果没有得到及时治疗，将会随着关节的运动而越来越严重，不仅不会愈合，而且还会越变越大，到最后只有置换关节^[2-3]。现如今，对于各种原因导致的关节软骨缺损，可供选择的治疗方法有很多，但均存在一定的不足之处，无法获得理想的治疗效果。例如，实施关节清理术治疗虽然可以暂时缓解患者的疼痛症状，但无法对疾病的发展予以有效的阻止；实施关节融合治疗会对患者的关节功能产生严重的影响；而实施人工关节置换治疗，则会给患者带来较大的经济负担^[4]。组织工程技术的不断发展，为软骨缺损的修复重建带来了希望^[5]。研究表明骨髓间充质干细胞在一定诱导条件下可以分化成为软骨样细胞，进而修复软骨缺损^[6]。以往诱导培养液中大多含有转化生长因子β1等生长因子，但存在一定的不足之处，诱导后的细胞无法在生物体内顺利形成成熟的软骨细胞，导致修复效果不尽如人意^[7]。为此，积极寻找更为有效的诱导方法至关重要。本实验获取SD大鼠关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞，将二者以不同浓度进行共培养诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，并与转化生长因子β1诱导结果进行比较，以寻找更有效地促进骨髓间充质干细胞向软骨方向诱导分化的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：单一样本观察性实验。

时间及地点：实验于2015年3至6月在资阳市第一人民医院实验室完成。

材料：

实验动物：健康SD大鼠10只，4周龄，雌雄各半，由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)2014 0006。

实验方法：

骨髓间充质干细胞分离培养：分离SD大鼠股骨及胫骨干，获得4.0-5.0 mL骨髓，立即用等量PBS进行洗涤，离心后弃去上清液，重复操作2次，接种于50 mL培养瓶中，并置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养。连续培养3 d 后换液，去除悬浮细胞。待原代培养细胞生长达到瓶底面积80%-90%时，添加0.25%胰蛋白酶消化2.0-3.0 min，添加含血清的DMEM培养基终止消化，离心，弃去上清液，并按照1∶3比例进行传代。

骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
胎牛血清	上海川翔生物科技有限公司
注射用青霉素钠	石药集团中诺药业(石家庄)有限公司
注射用链霉素	广州白云山天心制药股份有限公司
阿利新蓝	北京索莱宝科技有限公司
转化生长因子β1	上海常斤生物科技有限公司
ALP标记羊抗小鼠二抗	上海哈灵生物科技有限公司
Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体	上海高创化学科技有限公司
0.25%胰蛋白酶	北京北方同正生物技术发展有限公司
MTT	上海川翔生物科技有限公司
标准硫酸软骨素	上海基屹生物科技有限公司
DMEM培养基	广州市安杰生物技术有限公司
普通培养板	上海韵涵生物科技有限公司
培养瓶	深圳市百恩维生物科技有限公司

关节软骨细胞分离培养：分离SD大鼠股骨及胫骨干，刮取关节软骨，用PBS反复冲洗削下的软骨片，去除非软骨组织。将剪碎后的软骨碎片置于培养皿中，以0.25%胰蛋白酶消化后加入Ⅱ型胶原酶，获得软骨细胞悬液，接种到培养瓶进行原代培养。在超净工作台中吸出培养瓶内的细胞培养液，PBS洗涤2遍，向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶消化液2 mL，轻晃培养瓶，使消化液均匀流过所有培养瓶底表面。当细胞胞体变圆、间隙变大及少量细胞游离后，吸去消化液，加入含体积分数为10%胎牛血清的关节软骨细胞培养液3 mL终止其消化。吸取细胞悬液并置入离心管离心后弃上清，加入常规关节软骨细胞培养液重悬，接种于新的培养瓶，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况及形态变化。

实验分组：设置不同比例软骨细胞和骨髓间充质干细胞组，分别为软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶2组、软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组、软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组，另设转化生长因子β1对照组。

MTT比色法检测细胞增殖能力：诱导20 d之后，MTT比色法检测各组吸光度值。MTT溶液的配制：MTT 250 mg+ PBS 50 mL混匀，并进行过滤除菌。先以空白孔调零，在波长490 nm处测定各孔吸光度值。实验重复3次，取平均值。

阿利新蓝比色法检测氨基聚糖含量：诱导20 d之后，利用阿利新蓝比色法检测各组细胞氨基聚糖含量。弃去各组培养液，PBS冲洗3次；每孔加入细胞裂解液100 μL，裂解、离心后提取上清液，加入PBS至1 mL；加入0.5 mL 5 mg/L胰蛋白酶作用24 h；加入0.5 mL 5 mg/L木瓜蛋白酶水解 24 h后备用。各孔取样品液1 mL加入试管中，再加入 1.4 g/L阿利新蓝染液1.5 mL，混匀，10 min后于480 nm波长处测定各组吸光度值。

Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白量表达：诱导20 d之后，利用Western Blot法检测各组Ⅱ型胶原蛋白表达。PBS漂洗各组诱导后细胞，裂解后收集细胞裂解物于EP管中。超声波粉碎细胞并离心，收集上清液，取5 μL测定蛋白浓度，并进行电泳和转膜，转膜完毕后，切去膜多余的部分，切角标记方向，加封闭液1 h后进行免疫印迹检测。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞和软骨细胞形态。②诱导20 d后细胞活力、氨基聚糖含量以及Ⅱ型胶原蛋白表达。

统计学分析：研究数据录入SPSS 19.0统计学软件，符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

传统方法进行软骨缺损修复存在一定的不足之处，细胞生物学技术的发展，则为临床软骨缺损修复提供了新思路^[8]。

干细胞是人体发育进化的最小单位，骨髓间充质干细胞即为一种重要的干细胞类型^[9-14]。间充质干细胞具有多向分化的能力，在一定的体外条件下可诱导分化为软骨细胞和神经细胞等^[15-25]。以往大多使用生长因子进行诱导，但经生长因子诱导得到的细胞无法获得理想的修复效果^[26-28]，即植入体内后，不具备分泌软骨基质能力以及抗摩擦和抗压能力，修复效果不佳^[29-31]。近年来，一些学者开始积极尝试采用软骨细胞混合培养方式对骨髓间充质干细胞进行诱导^[32-34]。本研究获取SD大鼠关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞，分别设置1︰1、1︰2、2︰1浓度组，并与转化生长因子β1诱导组进行比较，检测诱导20 d后细胞活力和氨基聚糖含量以及Ⅱ型胶原蛋白表达情况。氨基聚糖是一种长链多糖，由重复多个二糖单位构成^[35-37]。关节软骨含有大量的氨基聚糖，且主要为硫酸软骨素^[38-39]，属于酸性黏液物质。研究结果显示，诱导20 d后转化生长因子β1组的细胞活力吸光度值显著小于软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组和软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组(P < 0.05)。经阿利新蓝比色法检测，转化生长因子β1组的氨基聚糖含量显著低于软骨细胞和骨髓间充质干细胞(1∶2，1∶1，2∶1)组(P < 0.05)；但软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组与软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明与转化生长因子β1诱导比较，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养可以获得更好的诱导效果。但是，并非软骨细胞浓度越高，所产生的氨基聚糖越多。通过实验结果可以发现，当关节软骨细胞达到一定浓度之后，经诱导所产生的氨基聚糖量并不会随之出现显著增加的情况。研究还发现转化生长因子β1组的Ⅱ型胶原蛋白表达显著低于软骨细胞和骨髓间充质干细胞(1∶2，1∶1，2∶1)组(P < 0.05)；但软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组与软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明通过关节软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养可产生更好的诱导作用，使其向软骨细胞进行转化，且骨髓间充质干细胞对软骨细胞诱导存在饱和现象，与氨基聚糖含量检测情况一致。本研究受到实验样本数量以及观察时间等因素的影响，所得到的相关结果以及相应的结论可能存在一定的片面性和不准确。

综上所述，通过关节软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养，可对骨髓间充质干细胞产生较转化生长因子β更好的诱导作用，使其向软骨细胞进行转化，但骨髓间充质干细胞对软骨细胞诱导存在一定的饱和现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程