骨髓间充质干细胞在节段性神经损伤局部微环境中的迁移和转归

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：面对周围神经损伤修复这一难题，大量研究已证实组织工程干细胞修复方法的可行性，但干细胞的修复作用机制尚不明确。

目的：探索骨髓间充质干细胞在损伤神经局部的迁移过程及对损伤神经的修复效果，并着重观察骨髓间充质干细胞在神经局部微环境中的分化及转归。

方法：选取8周龄雄性SD大鼠，使用液氮冰冻坐骨神经，制造节段性神经损伤模型。将36只成功造模的大鼠随机分成3组(n=12)，每组按添加细胞的方式不同具体分组如下：单纯冰冻损伤神经组，损伤神经内部注射细胞组，损伤神经周围添加细胞组。造模前及植入细胞后4，8，12周测量坐骨神经功能指数；植入细胞后12周，分别对小腿三头肌进行电生理学、湿重恢复率、收缩力恢复率检测以及Masson染色，损伤段神经组织进行免疫荧光染色，损伤远端神经进行甲苯胺蓝染色。

结果与结论：植入细胞后4，8，12周各组坐骨神经功能指数差异无显著性意义，但损伤神经内部注射细胞组和损伤神经周围添加细胞组均高于单纯损伤神经组，并且损伤神经内部注射细胞组略高于损伤神经周围添加细胞组；各组电生理检测结果显示，2个细胞治疗组复合肌肉动作电位的潜伏期和波幅差异无显著性意义，两组的潜伏期均值较单纯损伤神经组缩短、波幅均值较单纯损伤神经组显著升高(P < 0.05)；2个细胞治疗组肌纤维横截面积均高于单纯损伤神经组；免疫荧光染色结果显示，在植入细胞12周后，2个细胞治疗组均能观察到Nestin、S100、P0蛋白的表达。结果表明在节段性损伤的神经周围添加骨髓间充质干细胞不仅可以迁移到损伤神经内部参与神经修复，而且能够向许旺细胞和神经干细胞方向分化，达到与直接向神经内部注射干细胞类似的修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 神经节段损伤, 骨髓间充质干细胞, 修复, 转归, 红色荧光蛋白, 迁移

Abstract:

BACKGROUND: A large number of studies have confirmed that tissue-engineered stem cell therapy is feasible to repair peripheral nerve injury, but the repair mechanism is unclear.

OBJECTIVE: To observe the differentiation and homing of bone marrow mesechnymal stem cells under local nerve microenvironment by exploring the migration and effect of bone marrow mesenchymal stem cells in the repair of damaged nerve.

METHODS: Male SD rats, aged 8 weeks, were selected to establish segmental nerve injury models by freezing the sciatic nerve. Thirty-six model rats were randomized into three groups (n=12): frozen nerve injury group, cell injection into the nerve group, cell injection around the nerve group. Before modeling and at 4, 8, 12 weeks after cell implantation, the sciatic nerve function index was measured. Electrophysiological test, contractility recovery rate, wet weight recovery rate of the triceps surae were detected and Masson staining was performed; toluidine blue staining of the distal nerve injury and immunofluorescence staining of the damaged nerve were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: At 4, 8, 12 weeks after cell implantation, the sciatic nerve function index was ranked as follows: frozen nerve injury group < cell injection around the nerve group < cell injection into the nerve group, but no significant difference was found among the three groups. Electrophysiological results showed that there was no difference in the latency and amplitude of compound muscle action potential between two cell therapy groups, but compared with the frozen nerve injury group, the latency was shorter and the amplitude was higher in the two cell therapy groups (P < 0.05). Cross-sectional area of the muscle fibers was lower in the frozen nerve injury group compared with the other two groups. Immunofluorescence staining showed that Nestin, S100 and P0 proteins were all expressed in the two cell therapy groups 12 weeks after cell implantation. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells added into the surrounding tissues of segmental damaged nerve can migrate into the damaged nerve, and even differentiate into Schwann cells and neural stem cells, which has a similar effect to the cell injection into the damaged cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Sciatic Nerve, Trauma, Nervous System, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation

中图分类号:

R394.2

周雪峰，任志午，陆明，王玉，孙振，彭江. 骨髓间充质干细胞在节段性神经损伤局部微环境中的迁移和转归[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4465-4471.

Zhou Xue-feng, Ren Zhi-wu, Lu Ming, Wang Yu, Sun Zhen, Peng Jiang. Migration and homing of bone marrow mesenchymal stem cells in segmental nerve injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4465-4471.

图/表（结果） 4

2.1 一般情况术后实验大鼠的切口愈合情况可。术后2周开始陆续出现术肢活动时拖地、足部皮肤红肿、局部溃疡等失神经支配表现，随后足部皮肤红肿、局部溃疡症状逐渐消退。
2.2 坐骨神经指数植入细胞后4周各组坐骨神经指数逐渐恢复，3组坐骨神经指数差异不明显(P > 0.05)；植入细胞后8，12周，损伤神经内部注射细胞组、损伤神经周围添加细胞组坐骨神经指数均高于单纯神经损伤组，但组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。

2.3 免疫荧光染色结果细胞治疗组修复后神经冰冻切片Nestin、S100和P0免疫荧光染色结果见图2-4。分布于神经纤维间的红色代表红色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞，可以看出损伤神经内部注射细胞组标记的细胞数量明显多于损伤神经周围添加细胞组。
Nestin染色结果见图2，绿色代表Nestin表达，结果证实在移植12周神经组织有Nestin表达。S100染色结果见图3，绿色代表S100表达，结果证实在移植12周神经组织有S100表达。P0染色结果见图4，绿色代表P0表达，结果证实在移植12周神经组织已分泌P0蛋白。

2.4 电生理检测结果植入细胞后12周，各组复合肌肉动作电位的波幅见图5A：2个细胞治疗组间差异无显著性意义(P > 0.05)，且波幅较单纯神经损伤组显著性升高(P < 0.05)，各组的波幅较正常神经显著降低(P < 0.05)。组间复合肌肉动作电位的潜伏期见图5B：损伤神经内部注射细胞组、损伤神经周围添加细胞组的潜伏期均值较单纯神经损伤组缩短，但只有损伤神经周围添加细胞组与单纯神经损伤组差异有显著性意义(P < 0.05)，各组的潜伏期较正常神经显著延长(P < 0.05)。

2.5 小腿三头肌收缩力恢复率和湿重恢复率各组间小腿三头肌湿重恢复率和收缩力恢复率的变化趋势相似(图6，7)。损伤神经内部注射细胞组、损伤神经周围添加细胞组的湿重恢复率和收缩力恢复率差异均无显著性意义(P > 0.05)，且均高于单纯神经损伤组，但只有损伤神经周围添加细胞组与单纯神经损伤组比较差异有显著性意义 (P < 0.05)。

2.6 小腿三头肌Masson染色结果显微镜下观察发现术侧肌纤维横截面染色后呈多边形或圆形(图8)。损伤神经周围添加细胞组截面积显著大于损伤神经内部注射细胞组和单纯神经损伤组，各实验组横截面积均显著小于正常肌纤维。

2.7 远端神经甲苯胺蓝染色结果植入细胞后12周损伤远端神经横切面半薄切片的甲苯胺蓝染色结果见图9，新生神经的纤维分布排列杂乱，髓鞘厚度不一，但细胞治疗组的分布明显较单纯损伤组有序。

参考文献

[1] Siemionow M, Brzezicki G. Chapter 8: Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009; 87:141-172.

[2] Millesi H. Techniques for nerve grafting. Hand Clin. 2000; 16(1): 73-91.

[3] Dornseifer U, Matiasek K, Fichter MA, et al. Surgical therapy of peripheral nerve lesions: current status and new perspectives. Zentralbl Neurochir. 2007;68(3):101-110.

[4] Roganovic Z, Ilic S, Savic M. Radial nerve repair using an autologous denatured muscle graft: comparison with outcomes of nerve graft repair. Acta Neurochir (Wien). 2007; 149(10):1033-1038.

[5] Xue C, Hu N, Gu Y, et al. Joint use of a chitosan/PLGA scaffold and MSCs to bridge an extra large gap in dog sciatic nerve. Neurorehabil Neural Repair. 2012;26(1):96-106.

[6] Frerichs O, Fansa H, Schicht C,et al. Reconstruction of peripheral nerves using acellular nerve grafts with implanted cultured Schwann cells. Microsurgery. 2002;22(7):311-315.

[7] .Lin H, Liu F, Zhang C, et al. Pluripotent hair follicle neural crest stem-cell-derived neurons and schwann cells functionally repair sciatic nerves in rats. Mol Neurobiol. 2009; 40(3):216-223.

[8] Zhang CS, Lv G.Repair of sciatic nerve defects using tissue engineered nerves.Neural Regen Res. 2013;8(21): 1985- 1994.

[9] Wang Y, Zhao Z, Ren Z, et al. Recellularized nerve allografts with differentiated mesenchymal stem cells promote peripheral nerve regeneration. Neurosci Lett. 2012;514(1): 96-101.

[10] Wang D, Liu XL, Zhu JK, et al. Repairing large radial nerve defects by acellular nerve allografts seeded with autologous bone marrow stromal cells in a monkey model. J Neurotrauma. 2010;27(10):1935-1943.

[11] Smit X, van Neck JW, Ebeli MJ, et al. Static footprint analysis: a time-saving functional evaluation of nerve repair in rats. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg. 2004;38(6):321- 325.

[12] 赵喆. 以天然神经细胞外基质为支架构建组织工程神经修复周围神经缺损[D].北京:军医进修学院,2011.

[13] Zhao Z, Wang Y, Peng J, et al. Repair of nerve defect with acellular nerve graft supplemented by bone marrow stromal cells in mice. Microsurgery. 2011;31(5):388-394.

[14] 沈宁江,朱家恺.小腿三头肌肌力评价坐骨神经运动功能恢复的实验研究[J].中华显微外科杂志,1994,17(4):266-268.

[15] 赵曙光,李辉,范慧敏. 低温冷冻神经损伤与再生研究[J]. 同济大学学报:医学版,2010,31(4):15-18.

[16] Fasano VA, Peirone SM, Zeme S, et al. Cryoanalgesia. Ultrastructural study on cryolytic lesion of sciatic nerve in rat and rabbit. Acta Neurochir Suppl (Wien). 1987;39:177-180.

[17] 孙江森,李彪,龚跃昆. 骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展[J]. 中国组织工程研究,2012,16(6):1107-1110.

[18] Chopp M, Li Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol. 2002;1(2):92-100.

[19] Zhang YR,Zhang H,Zhang GC,et al.Combining acellular nerve allografts with brain-derived neurotrophic factor transfected bone marrow mesenchymal stem cells restores sciatic nerve injury better than either intervention alone. Neural Regen Res. 2014;9(20): 1814-1819.

[20] Totey S, Totey S, Pal R, et al. Adult stem cells: a clinical update. J Stem Cells. 2009;4(2):105-121.

[21] Wang J, Ding F, Gu Y, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells promote cell proliferation and neurotrophic function of Schwann cells in vitro and in vivo. Brain Res. 2009;1262:7-15.

[22] Guérette D, Khan PA, Savard PE, et al. Molecular evolution of type VI intermediate filament proteins. BMC Evol Biol. 2007;7: 164.

[23] Cocchia D, Miani N. Immunocytochemical localization of the brain-specific S-100 protein in the pituitary gland of adult rat. J Neurocytol. 1980;9(6):771-782.

[24] Ghandour MS, Langley OK, Labourdette G, et al. Specific and artefactual cellular localizations of S 100 protein: an astrocyte marker in rat cerebellum. Dev Neurosci. 1981;4(1):66-78.

[25] 张殿英,姜保国,傅忠国,等. 周围神经损伤后S-100蛋白的分布和变化研究[J].中国矫形外科杂志,2002,9(4):348-350.

[26] Kim S, Jeon TJ, Oberai A, et al. Transmembrane glycine zippers: physiological and pathological roles in membrane proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(40):14278- 14283.

[27] Kochański A. Mutations in the Myelin Protein Zero result in a spectrum of Charcot-Marie-Tooth phenotypes. Acta Myol. 2004;23(1):6-9.

引言

材料方法

设计：多样本观察实验。

时间及地点：实验于2014年11月至2015年3月在解放军总医院骨科研究所完成。

材料：

实验动物：36只8周龄清洁级雄性健康SD大鼠，体质量220-250 g，由解放军总医院实验动物中心提供。实验过程及方案均经解放军总医院动物实验管理委员会审核和批准。

实验细胞：实验所用Ori Cell^TM表达红色荧光蛋白SD大鼠骨髓间质干细胞(RFP-BMSCs)，由赛业生物科技有限公司提供。

主要试剂：SD大鼠骨髓间质干细胞完全培养基(赛业生物科技有限公司)；小鼠抗Nestin抗体、小鼠抗S100抗体、小鼠抗P0抗体、Hoechst33258、OCT冰冻切片包埋剂(SIGMA公司，美国)；异硫氰酸荧光素结合的山羊抗鼠/兔抗体(北京中山金桥生物技术有限公司)；生物蛋白胶(广州倍绣生物技术有限公司)。

主要仪器：光学显微镜(Olympus公司，日本)；便携式肌电图仪(Medtronic Keypoint公司，丹麦)；图像分析系统Image Pro Plus(Media Cybernetics公司，美国)；冷冻切片机CM1850型、组织切片机Leitz1516型(Leica公司，德国)；肌张力换能器(成都泰盟科技有限公司)。

实验方法：

制备注射用表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞悬液：胰酶消化离心收集表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，使用无菌磷酸盐缓冲液悬浮细胞，进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至6.25×10¹⁰ L^-¹。

生物蛋白胶复合表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞：胰酶消化收集表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，生物蛋白胶A液悬浮细胞，并进行细胞计数，调整细胞浓度至6.25×10¹⁰ L^-¹。

动物损伤模型制备：SD大鼠以10%无菌水合氯醛腹腔注射麻醉(剂量为3 mL/kg)，常规备皮消毒铺巾，选取右侧股后上方切口分离肌肉暴露坐骨神经，自梨状肌下缘分离坐骨神经15 mm。使用显微镊提起坐骨神经，棉签蘸取液氮冰冻坐骨神经，冰冻时间30 s，间隔5 s，重复1次，成功造模。

实验动物分组及修复方法：将成功造模的36只SD大鼠随机分为3组，每组12只，按植入骨髓间充质干细胞的方法具体分组如下：单纯神经损伤组、损伤神经内部注射细胞组、损伤神经周围添加细胞组。

造模后按分组情况立即植入细胞，即损伤神经内部注射细胞组自损伤神经组织两端向内部注射8 µL含有表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞悬液；损伤神经周围添加细胞组在损伤神经组织周围分别喷涂8 µL上述配制含有表达红色荧光蛋白骨髓间充质干细胞的生物蛋白胶A液以及B液，使得两种液体反应凝结。术后逐层缝合肌肉、皮肤，分笼饲养。

主要观察指标：

一般情况：术后观察大鼠存活、切口愈合以及并发症发生情况。

坐骨神经功能指数：造模前及植入细胞后4，8，12周，测量坐骨神经功能指数^[11]，观察神经修复情况。使用小动物步态分析仪，大鼠缓慢匀速通过玻璃跑台，程序自动记录保存脚印，分别标记出足跟到足尖的最长距离PL；第2到4趾连线的最长距离TI；第1到5趾连线的最长距离TS。E代表实验侧(右侧足)、N代表正常侧(左侧足)，使用Bain公式计算坐骨神经功能指数(SFI)，SFI=109.5 (ETS-NTS)/ NTS-38.3(EPL-NPL)/NPL+13.3 (ETI-NTI)/NTI。SFI=0为正常，SFI=-100为完全损伤。

神经组织免疫荧光染色^[12]：植入细胞后12周(每组4只)，取各组损伤神经组织行冰冻组织切片及免疫荧光染色，观察移植细胞的迁移和转归情况。取神经12 mm及其两端各2 mm，以OCT包埋剂冰冻包埋，置于冰冻切片机行厚度为10 μm的连续纵切片，切片置于丙酮中固定5 min，PBS冲洗3次，每次5 min。在每组的冰冻切片中分别滴加小鼠抗Nestin抗体，小鼠抗S-100抗体，兔抗P0抗体，4 ℃孵育过夜。倾去一抗，PBS洗片5 min×3次，吸干。按照一抗动物来源，分别添加FITC结合的山羊抗鼠抗体或FITC结合的山羊抗兔抗体，避光，37 ℃孵育1 h。倾去二抗，避光，PBS 洗片5 min×3次。丙三醇封固，4 ℃避光保存。使用荧光显微镜进行观察，摄片。

电生理检测^[12]：在植入细胞后12周，实验动物进行组织取材之前，采用10%的水合氯醛3 mL/kg行腹腔注射麻醉，逐层暴露大鼠坐骨神经，神经损伤区域用橡皮膜与周围肌肉组织隔离以绝缘。将双极刺激电极置于损伤区域，记录电极放置于远端的腓肠肌肉上。使用Medtronic Keypoint便携式肌电图仪，刺激各组神经损伤区域，记录复合肌肉动作电位。以每组对侧肌肉和神经作为正常对照，分别记录各组实验动物的坐骨神经波幅和潜伏期以评价其功能学修复效果。

小腿三头肌收缩力恢复率及湿重恢复率测定^[13-14]：①小腿三头肌收缩力恢复率测定：肌电图检测结束后，将两侧小腿三头肌跟腱止点处切断并游离，使用3-0缝线将跟腱连接到肌张力换能器。调节肌肉和缝线的张力，当两侧小腿三头肌等长收缩时记录最大强直收缩力，按照公式计算术侧小腿三头肌收缩力恢复率。小腿三头肌收缩力恢复率=术侧小腿三头肌最大强直收缩力/健侧小腿三头肌最大强直收缩力×100%。②小腿三头肌湿重恢复率的测定：肌力测量结束后，自胫骨处切断腓肠肌附着点，切取患侧和对侧小腿三头肌，滤纸吸干肌肉表面血迹，电子天平上分别称质量，按照公式计算术侧小腿三头肌湿重恢复率。小腿三头肌湿重恢复率=术侧小腿三头肌湿重/健侧小腿三头肌湿重×100%。

小腿三头肌Masson染色^[12]：在患侧小腿三头肌测量湿重之后，体积分数为10%甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，取横切面，切片厚度10 μm，行Masson三色染色。将染色后的切片置于显微镜下拍照后，用Image pro plus 6.0图像分析软件，计算各组肌肉中肌纤维面积。

远端神经组织甲苯胺蓝染色^[11]：植入细胞后12周，取各组损伤神经组织的远端神经组织，进行半薄切片及甲苯胺蓝染色，将染色后的切片置于显微镜下拍照后，用Image pro plus 6.0图像分析软件，计数各组神经有髓神经纤维的数目、轴突直径及髓鞘厚度，观察评价轴突再通及髓鞘再生情况。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。实验数据以x(_)±s表示，组间采用单因素方差分析方法，LSD检验用于两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

使用大鼠坐骨神经节段性冰冻损伤模型^[15]，评价骨髓间充质干细胞在修复神经损伤过程中的迁移机制及修复效果。经过液氮处理后的大鼠坐骨神经不仅神经髓鞘发生崩解，而且内膜和基底膜以及神经外膜出现严重破坏，神经内部微结构发生紊乱，能够避免钳夹方式由于用力不均而造成的神经损伤程度不一的缺陷^[15]，所以选用冰冻方式制作神经节段性损伤模型，此方式更好的适用于神经损伤组织工程修复的实验研究^[16]。

红色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞与化学染料方法标记的细胞相比，植入体内增殖分裂数代后依然可以在荧光显微镜下观察到红色荧光，因此经过迁移后的骨髓间充质干细胞更易被确切的检测到^[17]。术后12周，显微镜观察发现，无论表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞添加到冰冻损伤神经内部还是周围，修复后的神经内部均可以见红色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞分布在神经纤维中间。据此，证实了添加在损伤神经组织周围的骨髓间充质干细胞具有迁移作用，可以进入神经组织的内部并促进损伤神经的修复。

动物实验和临床研究已经证明间充质干细胞对神经损伤后的功能恢复有促进作用^[18-19]，并且骨髓间充质干细胞为神经的再生提供各种细胞因子和生长因子^[20]，修复过程中骨髓间充质干细胞不仅通过这种神经营养功能直接作用到许旺细胞^[21]，而且可能向许旺细胞方向分化。骨髓间充质干细胞有向类神经细胞方向分化的能力^[22]，同时刺激和诱导轴突的生长^[23-24]，并且对维持髓鞘的正常结构和功能有重要作用^[25-27]。本实验在移植骨髓间充质干细胞12周后观察到Nestin、S100、P0的表达，提示骨髓间充质干细胞成功迁移进入损伤神经内部之后可以向许旺细胞方向分化，并且有参与形成髓鞘的能力，从而证实上述观点。

除了证实干细胞能够向神经组织内迁移并转归外，又通过观测形态学及功能学指标，比较在损伤神经内外添加骨髓间充质干细胞对神经损伤修复的作用。

损伤远端神经横切面的病理检测结果表明，治疗组在轴突和髓鞘恢复方面明显优于单纯损伤组，更为接近正常神经结构。小腿三头肌Masson染色得出结论与肌肉湿重恢复率检测结果相同^[11]。坐骨神经指数用于评价运动功能恢复程度，结果显示在损伤神经内外添加骨髓间充质干细胞，可以加快神经损伤后的运动功能恢复^[11]。电生理检测结果显示两种修复方式可以使复合肌肉动作电位的潜伏期缩短、波幅增大，从而证实添加骨髓间充质干细胞后加速坐骨神经的肌肉支配功能的恢复。评价神经损伤修复效果的另一主要指标小腿三头肌肌力恢复率^[14]，同样证实添加干细胞的修复效果^[13]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程