骨髓间充质干细胞参与肝星状细胞凋亡的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：控制肝星状细胞的激活和增殖是抗肝纤维化研究的重点，人类或鼠的骨髓间充质干细胞可通过旁分泌的肝细胞生长因子诱导肝星状细胞凋亡。
目的：探讨骨髓间充质干细胞在肝星状细胞凋亡中的参与机制。
方法：构建共培养体系，于半透膜上下层在细胞培养板上对肝星状细胞和骨髓间充质干细胞进行接种和培养，单纯肝星状细胞组设为空白对照组，共培养的肝星状细胞和骨髓间充质干细胞组为共培养组，以3 mg/L c-Met阻滞剂干预的肝星状细胞和骨髓间充质干细胞为c-Met阻滞剂组，以3 mg/L RhoA阻滞剂干预的肝星状细胞和骨髓间充质干细胞为RhoA阻滞剂组。
结果与结论：c-Met阻滞剂质量浓度为3.0 mg/L，RhoA阻滞剂浓度为30 μmol/L时比其他浓度的细胞抑制率大。共培养组、c-Met阻滞剂组和RhoA阻滞剂组细胞中RhoA mRNA和蛋白表达水平均显著低于空白对照组，且以RhoA阻滞剂组最为显著。各组肝细胞生长因子浓度均随着时间的延长出现逐渐下降的情况，肝细胞生长因子激活物浓度均随着时间的延长出现逐渐上升的情况，且c-Met阻滞剂组变化最为显著。随着时间的延长，各组肝星状细胞凋亡率均出现逐渐上升的情况，其中RhoA阻滞剂组凋亡率最高，c-Met阻滞剂组最低。表明骨髓间充质干细胞会参与到肝星状细胞的凋亡机制中，并通过对肝细胞生长因子的激活以及Rho通路的下调达到促进肝星状细胞凋亡的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 肝星状细胞, 骨髓间充质干细胞, 肝细胞生长因子, 肝细胞生长因子激活因子, 细胞凋亡, 机制

Abstract:

BACKGROUND: Control of hepatic stellate cell activation and proliferation is the focus of developing strategies against liver fibrosis. Human or murine bone marrow mesenchymal stem cells can induce apoptosis of hepatic stellate cells through paracrine of hepatocyte growth factors.
OBJECTIVE: To explore the mechanism by which bone marrow mesenchymal stem cells participate in apoptosis of rat hepatic stellate cells.
METHODS: Hepatic stellate cells and bone marrow mesenchymal stem cells were seeded and co-cultured in the upper and lower chambers in a co-culture system, serving as a co-culture group. In the blank control group, only hepatic stellate cells were involved. In the c-Met inhibitor group, hepatic stellate cells and bone marrow mesenchymal stem cells were treated with 3 mg/L C-Met inhibitor. In the RhoA inhibitor group, both kinds of cells were treated with 3 mg/L RhoA inhibitor.
RESULTS AND CONCLUSION: The concentration of c-Met inhibitor was 3.0 mg/L. RhoA inhibitor at 30 μmol/L exhibited a greater inhibitory effect than at other concentrations. RhoA mRNA and protein expression in the co-culture, c-Met inhibitor and in particular RhoA inhibitor groups was obviously greater than in the blank control group. Hepatocyte growth factor concentration in each group was gradually decreased with time, hepatocyte growth factor activator concentration in each group was gradually increased with time, and the changes were most obvious in the c-Met inhibitor group. Apoptosis rate of hepatic stellate cells in each group was gradually increased with time, and highest apoptosis rate appeared in the RhoA inhibitor group, and lowest apoptosis rate in the c-Met inhibitor group. These findings suggest that bone marrow mesenchymal stem cells participate in and promote the apoptosis of hepatic stellate cells by activating hepatocyte growth factors and downregulating Rho activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hepatocytes, Apoptosis, Proto-Oncogene Protein c-met, rho-Associated Kinases

中图分类号:

R394.2

刘大力. 骨髓间充质干细胞参与肝星状细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3639-3643.

Liu Da-li. The mechanism by which bone marrow mesenchymal stem cells participate in apoptosis of hepatic stellate cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3639-3643.

图/表（结果） 3

2.1 原代肝星状细胞和共培养的肝星状细胞的形态原代肝星状细胞呈贴壁生长、膜状呈星形或多边形伸展状态，胞内含大量颗粒。骨髓间充质干细胞呈贴壁生长，长条梭状胞体大，折光性好。肝星状细胞经免疫组织化学染色观察，肝星状细胞胞浆在48 h的培养之后可见棕黄色颗粒，细胞核呈淡蓝色，多数肝星状细胞中α-SMA呈阳性(图1)。
共培养 48 h，共培养组折光性下降，边缘逐渐模糊不清，且存在少量细胞脱落现象；c-Met阻滞剂组折光性下降；RhoA阻滞剂组肝星状细胞的星状突起出现回缩，细胞间隙明显增大，且存在较多脱落细胞(图2)。

2.2 细胞抑制率 MTT检测结果显示，c-Met阻滞剂浓度为3.0 mg/L，RhoA阻滞剂浓度为30 μmol/L的时候，较之其他浓度，细胞抑制率最大(P < 0.05；表1)。
2.3 RhoA mRNA的表达水平共培养组、c-Met阻滞剂组和RhoA阻滞剂组细胞中RhoA mRNA表达水平均显著低于空白对照组(P < 0.05)，且以RhoA阻滞剂组的表达水平下降情况最为显著(P < 0.05；表2)。

2.4 RhoA蛋白表达水平和肝细胞生长因子、肝细胞生长因子激活物浓度随着培养时间的延长，各组的RhoA蛋白表达水平均出现逐渐增加的情况，且较之空白对照组，各实验组的RhoA蛋白表达水平均出现显著下降的情况，并以RhoA阻滞剂组的表达水平下降情况最为显著(P < 0.05)。各组的肝细胞生长因子浓度均随着时间的延长出现逐渐下降的情况，肝细胞生长因子激活物浓度均随着时间的延长出现逐渐上升的情况，且c-Met阻滞剂组与其他实验组差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.5 细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，随着时间的延长，各组肝星状细胞凋亡率逐渐上升，其中RhoA阻滞剂组凋亡率最高，c-Met阻滞剂组最低(P < 0.05；表3)。

参考文献

[1] 姚志成,钟跃思,胡昆鹏,等.骨髓间质干细胞培养液上清对肝星状细胞增殖及纤维化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(23):4181-4184.

[2] 林有智,陆玉蕾,陈孝平,等.肝细胞生长因子在肝星状细胞调控卵圆细胞凋亡中的作用[J].腹部外科,2013,26(2):133-135.

[3] 孟云超,姜海行,张君红,等.肝细胞生长因子的激活诱导肝星状细胞凋亡[J].中华肝脏病杂志,2012,20(9):698-702.

[4] 孔德松,郑仕中,陆茵,等.肝内肌成纤维细胞的来源及其在肝纤维化中作用的研究[J].中国药理学通报,2011,27(3):297-300.

[5] 苏思标,姜海行,王东旭,等.骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞RhoA、P27的表达[J].世界华人消化杂志,2009,17(32):3283-3291.

[6] 陈国忠,姜海行,陆正峰,等.骨髓间充质干细胞共培养对肝星状细胞增殖、凋亡和RohA表达的调控[J].世界华人消化杂志,2010, 18(16):1643-1649.

[7] 王珊,张立婷,陈红.人骨髓间充质干细胞培养上清与肝星状细胞相关酶的分泌[J].中国组织工程研究,2012,16(45):8374-8379.

[8] 王东旭,姜海行,苏思标,等.体外共培养大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响:Cyclin D1与P27表达调控[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(10):1764-1768.

[9] 宁琳,姜海行,覃山羽,等.骨髓充质干细胞调控尿激酶型纤溶酶原激活物表达及其对大鼠肝星状细胞凋亡的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(19):3427-3432.

[10] 胡昆鹏,刘波,姚志成,等.骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养后凋亡相关基因的改变[J].中国组织工程研究,2014,18(28): 4444-4449.

[11] 张君红,姜海行,覃山羽,等.肝细胞生长因子在TRAIL促进原代肝星状细胞凋亡中的作用[J].中国老年学杂志,2013,33(23):5909-5911.

[12] Chan KM, Fu YH, Wu TJ, et al. Hepatic stellate cells promote the differentiation of embryonic stem cell-derived definitive endodermal cells into hepatic progenitor cells. Hepatol Res. 2013;43(6):648-657.

[13] 潘若浪.间充质干细胞抗肝脏纤维化作用及其机制的探索研究[D].杭州:浙江大学,2011.

[14] Chen S, Xu L, Lin N, et al. Activation of Notch1 signaling by marrow-derived mesenchymal stem cells through cell-cell contact inhibits proliferation of hepatic stellate cells. Life Sci. 2011;89(25-26):975-981.

[15] Deng X, Chen YX, Zhang X, et al. Hepatic stellate cells modulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. J Cell Physiol. 2008; 217(1): 138-144.

[16] 杨文,覃山羽,姜山羽,等.骨髓间充质干细胞体外调控肝星状细胞死亡受体5的表达[J].中国组织工程研究,2012,16(27):4947- 4952.

[17] Nishiofuku M, Yoshikawa M, Ouji Y, et al. Modulated differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells by coculture with hepatic stellate cells. J Biosci Bioeng. 2011;111(1):71-77.

[18] Tennakoon AH, Izawa T, Wijesundera KK, et al. Characterization of glial fibrillary acidic protein (GFAP)-expressing hepatic stellate cells and myofibroblasts in thioacetamide (TAA)-induced rat liver injury. Exp Toxicol Pathol. 2013;65(7-8):1159-1171.

[19] Suskind DL, Muench MO. Searching for common stem cells of the hepatic and hematopoietic systems in the human fetal liver: CD34+ cytokeratin 7/8+ cells express markers for stellate cells. J Hepatol. 2004;40(2):261-268.

[20] 罗茜,王斌,雷增杰,等.肝星状细胞具有向肝细胞样细胞分化的干细胞潜能[J].第三军医大学学报,2013,35(7):604-608.

[21] 常文举,宋陆军,徐兴远,等.小鼠肝星状细胞对肝脏干细胞增殖及代谢的影响[J].中华实验外科杂志,2014,31(5):988-990.

[22] 邓星.活化肝星状细胞促进干细胞定向分化和肝损伤修复[D].上海:第二军医大学,2008.

[23] 李明亮,姚志成,钟跃思,等.人脐带间质干细胞培养上清液可下调肝星状细胞转化生长因子β的表达[J].中国组织工程研究,2012, 16(10):1769-1772.

[24] 俞富祥,苏龙丰,季世强,等.脂肪间质干细胞抑制肝星状细胞增殖活化及肝脏纤维化[J].中华普通外科杂志,2011,26(12): 1027- 1030.

[25] Lin N, Tang Z, Deng M, et al. Hedgehog-mediated paracrine interaction between hepatic stellate cells and marrow-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2008;372(1):260-265.

[26] Zhang SC, Zheng YH, Yu PP, et al. Lentiviral vector-mediated down-regulation of IL-17A receptor in hepatic stellate cells results in decreased secretion of IL-6. World J Gastroenterol. 2012;18(28):3696-3704.

[27] 李里明.人脐带间质干细胞来源的exosomes对肝星状细胞活化的抑制研究[D].镇江:江苏大学,2014.

[28] 赵建学,商洪涛,郭海燕,等.骨髓间充质干细胞对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的治疗作用的实验研究[J].实用临床医药杂志,2011, 15(7):13-15,20.

[29] 陈黎明,徐若男,吕飒,等.脐带间充质干细胞对肝星状细胞活化、凋亡的调控作用研究[J].解放军医学杂志,2014,39(1):11-14.

[30] 姚志成,胡昆鹏,陈思,等.骨髓间质干细胞通过影响PI3K/Akt信号通路抑制肝星状细胞的增殖[J].中华实验外科杂志,2011,28(9): 1475-1477.

[31] 张君红,姜海行,孟云超,等.大鼠骨髓间充质干细胞旁分泌HGF上调肝星状细胞DR5及caspase-8的表达[J].基础医学与临床, 2012, 32(7):804-808.

[32] 何颖.间充质干细胞与肝星状细胞相互作用及其与抗肝纤维化[J].南昌大学学报(医学版),2011,51(4):89-92.

[33] 俞富祥,季世强,苏龙丰,等.脂肪间质干细胞对肝星状细胞活化、增殖、凋亡相关作用的研究[J].医学研究杂志,2012,41(3):79-82.

引言

材料方法

设计：体外细胞实验。
时间及地点：实验于2015年3至4月在四川大学华西临床医学院完成。
材料：
细胞：大鼠肝星状细胞和骨髓间充质干细胞由上海研域生物科技有限公司提供。

分析骨髓间充质干细胞在肝星状细胞凋亡的作用的主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
兔抗人RhoA单克隆抗体	长沙赢润生物技术有限公司
β-肌动蛋白	上海欣裕生物科技有限公司
肝细胞生长因子/肝细胞生长因子激活物酶联免疫吸附法检测试剂盒	北京方程生物科技有限公司
反转录试剂盒	杭州主诺生物技术有限公司
RhoA阻滞剂	广州泛思生物科技有限公司
Roche荧光定量试剂盒FastStart Universal SYBR	北京富众科技发展有限公司
Green Master(ROX)	宝生物工程(大连)有限公司
c-Met阻滞剂	上海高创化学科技有限公司
流式细胞仪	贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司
CO₂培养箱	天津钧星瑞科技有限公司
MTT液	北京中生瑞泰科技有限公司
酶标仪	北京东迅天地医疗仪器有限公司
荧光定量PCR仪	苏州科技城生物医学技术发展有限公司
兔抗鼠肌动蛋白α(α-SMA)抗体/ Anti-Actin α/alpha-SMA单克隆抗体	武汉博士德生物工程有限公司
细胞培养板	嘉兴龙川生物科技有限公司
半透膜	南京都英生物技术有限公司
二甲基亚砜	西安悦来医药科技有限公司
15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶	德国Serva公司
Trizol试剂	上海博耀生物科技有限公司
Annex/n-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒	北京创根胜泰科技有限公司

方法：
肝星状细胞和骨髓间充质干细胞处理：将肝星状细胞置于培养箱中进行传代培养，培养环境为体积分数5%CO2、37 ℃，获得活性良好、形态均一细胞。对兔抗鼠α-SMA单克隆抗体进行稀释，利用免疫细胞化学法对β-肌动蛋白的表达情况进行检测[15]。利用全骨髓细胞贴壁培养法对骨髓间充质干细胞进行培养和分离，分离股骨干，离心、收集细胞，置于培养箱中进行培养，培养环境为体积分数5%CO2、 37 ℃。培养24 h之后换液，收集对数期细胞。
细胞共培养和分组：构建共培养体系，于半透膜上下层在细胞培养板上分别按照1×105/孔的浓度对肝星状细胞和骨髓间充质干细胞进行接种和培养，并进行分组。其中，单纯肝星状细胞组设为空白对照组，共培养的肝星状细胞和骨髓间充质干细胞组为共培养组，以3 mg/L c-Met阻滞剂干预的肝星状细胞和骨髓间充质干细胞为c-Met阻滞剂组，以3 mg/L RhoA阻滞剂干预的肝星状细胞和骨髓间充质干细胞为RhoA阻滞剂组。
MTT法检测：利用不同浓度c-Met阻滞剂和RhoA阻滞剂对肝星状细胞进行干预，干预 6 h之后，再分别与骨髓间充质干细胞进行共培养，培养48 h之后将肝星状细胞接种在96孔板上并进行48 h的孵育，之后添加MTT液置于避光环境下反应4 h，反应结束加入二甲基亚砜。对各孔的吸光度进行检测，并计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。
Western blot检测：提取肝星状细胞总蛋白，利用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜后进行1 h的非特异性封闭，并添加稀释后的兔抗RhoA，置于4 ℃环境下。过夜之后添加荧光第二抗体进行杂交，1 h之后分析反应结果，以蛋白吸光度比值表示RhoA相对蛋白表达水平。
反转录PCR分析：对各组不同时段肝星状细胞进行收集和计数，每5×106个细胞添加1 mL Trizol，充分混匀后进行总RNA提取，并进行反转录，获得cDNA。对RhoA及 β-肌动蛋白基因引物序列进行设计，并予以扩增。利用荧光定量PCR仪进行检测，内参为β-肌动蛋白，对各组RhoA mRNA 相对表达水平进行计算。
酶联免疫吸附法检测：对标准品孔、空白孔以及待测样品孔进行设置，严格按照相应试剂盒的说明书进行操作，利用酶标仪对450 nm处吸光度值进行测量，对样品中肝细胞生长因子及肝细胞生长因子激活物浓度进行计算。
细胞凋亡率检测：对不同时段肝星状细胞进行收集和计数，严格按照Annex/n-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书进行操作，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
主要观察指标：①原代肝星状细胞和共培养的肝星状细胞形态。②细胞抑制率。③RhoA mRNA的表达水平。④RhoA蛋白表达水平和肝细胞生长因子、肝细胞生长因子激活物浓度。⑤细胞凋亡率。
统计学分析：对数据采用SPSS 16.0软件进行处理，其中不符合正态分布的数据予以秩和检验，符合正态分布的数据予以单因素方差分析，方差不齐时采用Games- Howell法，方差齐性检验采用S-N-K法。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段^[16-19]。肝纤维化对人体的危害极大，肝纤维化如得不到及时的治疗很容易恶化为肝硬化，甚至肝癌，危及生命^[20]。
肝星状细胞位于肝脏的洞样血管和肝细胞之间的细缝中，在肝纤维化的发生发展过程中，肝星状细胞的激活起着关键性的作用^[21]。在正常情况下，肝脏中的星状细胞处于静止期，并具有储存油脂的作用^[22-25]。一旦肝脏受到发炎等因素的伤害，会受到一些生长因子或是发炎细胞素的影响开始增生和制造胶原蛋白，此时进入活化状态^[26]。活化状态下，星状细胞内油滴散去，释放出储存的维生素A，并且开始制造许多细胞素，影响周边其他细胞，极易导致肝脏纤维化的出现^[27]。肝脏受到有害刺激后，静息的肝星状细胞被激活，转分化为成肌纤维细胞样细胞，进而分泌大量的炎症因子和促纤维化因子等导致细胞外基质的过量积累^[3，28]。与此同时，分泌的这些细胞因子还能够刺激肝星状细胞的增殖并抑制其凋亡，最终导致肝纤维化程度的加剧^[29]。因此，若能抑制肝星状细胞的生长，必将在一定程度上阻断肝纤维化的进程。人类或者鼠的骨髓间充质干细胞可以利用旁分泌的肝细胞生长因子对肝星状细胞产生影响，诱导其发生凋亡^[30]。肝细胞生长因子可以对转化生长因子的产生予以有效的抑制，并发挥出诱导作用，对间充质干细胞向肝细胞分化功能予以有效诱导，从而对肝纤维化进程予以阻止^[31]。肝细胞生长因子激活物是一种肝细胞生长因子蛋白酶，可以对其产生激活作用。且肝细胞生长因子在和其特异性受体c-Met发生结合之后，可以形成肝细胞生长因子/c-Met信号转导系统^[32]。c-Met特异性受体阻滞剂可以对肝细胞生长因子调节下的Akt活化产生阻止作用，并对多种子细胞产生诱导，导致其发生凋亡^[33]。本实验结果显示，随着时间的延长，各组肝星状细胞凋亡率均出现逐渐上升的情况，其中RhoA阻滞剂组凋亡率最高，c-Met阻滞剂组最低，且3个共培养组的RhoA mRNA表达水平均显著低于空白对照组，且以RhoA阻滞剂组的表达水平下降情况最为显著。随着时间的延长，各组的RhoA蛋白表达水平均出现逐渐增加的情况，且较之空白对照组，3个共培养组的RhoA蛋白表达水平均出现显著下降，并以RhoA阻滞剂组的表达水平下降情况最为显著。结果表明，间充质干细胞促进肝星状细胞凋亡的机制和RhoA之间存在十分密切的联系，可以通过对RhoA的下调发挥出促进细胞凋亡的作用来。本实验结果还显示，各组的肝细胞生长因子浓度均随着时间的延长出现逐渐下降的情况，肝细胞生长因子激活物浓度均随着时间的延长出现逐渐上升的情况，且c-Met阻滞剂组较之其他实验组存在显著差异。表明骨髓间充质干细胞可以通过对肝细胞生长因子的激活对Rho通路予以抑制，从而达到抑制肝星状细胞的目的。
综上所述，骨髓间充质干细胞会参与到肝星状细胞的凋亡机制中，并通过对肝细胞生长因子的激活以及Rho通路的下调达到促进肝星状细胞凋亡的目的。