灯盏花素干预糖尿病模型大鼠睾丸组织增殖细胞核抗原和c-fos的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.023

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2917-2922.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.023

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灯盏花素干预糖尿病模型大鼠睾丸组织增殖细胞核抗原和c-fos的表达

龙玲莉1，郑淑慧1，李宇彬2

中山大学附属第一医院，1转化中心实验室，2生殖医学中心，广东省广州市 510080

收稿日期:2015-02-15 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 李宇彬，博士。中山大学附属第一医院，广东省广州市 510080
作者简介:龙玲莉，1986年生，女，硕士，主要从事生殖医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81100470)

Breviscapine effects on the expression of proliferating cell nuclear antigen and c-fos in the testis of diabetic rat models

Long Ling-li1, Zheng Shu-hui1, Li Yu-bin2

1Transfer Center Laboratory, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 2Center for Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2015-02-15 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Li Yu-bin, M.D., Center for Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Long Ling-li, Master, Transfer Center Laboratory, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81100470

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明灯盏花素可影响2型糖尿病大鼠的生殖能力，但其作用机制少有报道。
目的：探讨灯盏花素对2型糖尿病大鼠睾丸增殖细胞核抗原和原癌基因c-fos表达的影响作用。
方法：选取36只健康雄性大鼠随机分为对照组、模型组和灯盏花素组各12只。模型组和灯盏花素组采用链脲佐菌素连续腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，大鼠血糖监测达到16.7 mmol/L作为建模标准，对照组大鼠予以同等容积的柠檬酸缓冲液单次腹腔注射。灯盏花素组采用灯盏花素注射液10 mg/(kg•d)连续4周腹腔注射，其他2组在相同时间注入等量生理盐水。
结果与结论：干预4周后，血清睾酮检测、免疫组织化学染色和PCR检测结果显示，血清睾酮水平、增殖细胞核抗原、c-Fos蛋白及mRNA表达：对照组>灯盏花素组>模型组(P < 0.05)；血糖水平：对照组<灯盏花素组<模型组(P < 0.05)。结果证实，灯盏花素可以通过增强增殖细胞核抗原和c-fos的表达，保护2型糖尿病大鼠的生殖功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 动物模型, 基因病毒载体及相关因子模型, 灯盏花素, 2型糖尿病, 睾丸增殖细胞核抗原, 睾丸增殖细胞核抗原转录基因, c-Fos蛋白, 原癌基因, 大鼠, 睾酮, 链脲佐菌素, 生殖功能, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Breviscapine has been shown to impact the reproductive capacity in rats with type 2 diabetes mellitus, but few reports concerned its mechanism of action.
OBJECTIVE: To study the effects of breviscapine on proliferating cell nuclear antigen and proto-oncogene c-fos expression in testis of type 2 diabetes mellitus rats.
METHODS: Totally 36 healthy male rats were randomly divided into control group, model group and breviscapine group with 12 rats in each group. In the model group and breviscapine group, rat models of type 2 diabetes mellitus were established by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin. Blood glucose reaching16.7 mmol/L in rats was considered as the standard of model induction. In the control group, rats were given an equal volume of citrate buffer solution by single intraperitoneal injection. In the breviscapine group, rats were administered breviscapine 10 mg/(kg•d) for 4 consecutive weeks by intraperitoneal injection. Rats in the other two groups were injected with an equal volume of physiological saline at the same time point.
RESULTS AND CONCLUSION: After 4 weeks of intervention, serum testosterone testing, immunohistochemistry and PCR results showed that serum testosterone levels, proliferating cell nuclear antigen, c-Fos protein and mRNA expression: control group > breviscapine group > model group (P < 0.05); blood glucose concentration: the control group < breviscapine group < model group (P < 0.05). Results confirmed that breviscapine can protect the reproductive function in type 2 diabetes mellitus rats by enhancing the expression of proliferating cell nuclear
antigen and c-fos.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Diabetes Mellitus, Proto-Oncogenes, Testosterone

中图分类号:

R318

龙玲莉，郑淑慧，李宇彬. 灯盏花素干预糖尿病模型大鼠睾丸组织增殖细胞核抗原和c-fos的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2917-2922.

Long Ling-li, Zheng Shu-hui, Li Yu-bin. Breviscapine effects on the expression of proliferating cell nuclear antigen and c-fos in the testis of diabetic rat models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2917-2922.

图/表（结果） 4

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引言

糖尿病是临床高发疾病之一，该类患者存在长期高血糖特征，极易诱发眼、肾、心、生殖系统功能损伤。糖尿病患者体内的高血糖可导致糖基化终末产物大量产生，体内氧自由基作用是糖尿病相关并发症的重要机制。氧自由基损伤睾丸组织，可表现为过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶活性降低，脂质过氧化增强及血浆睾丸酮水平降低^[1]。糖尿病对雄性生殖系统功能损伤主要表现为对患者睾丸功能的改变，此过程涉及较多影响因素，其根本机制尚未明确，但糖尿病雄性存在明显的生精障碍，其性及生殖能力显著下降^[2]。糖尿病男性患者生殖能力衰退与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和原癌基因c-fos高表达有关。

增殖细胞核抗原是真核细胞内的酸性蛋白质，仅表达于细胞有丝分裂过程中，参与核酸复制和修复过程，而且对细胞周期的调控具有重要作用。增殖细胞核抗原还可作为DNA聚合酶的一种重要辅助因子，在DNA合成和复制中发挥重要作用，是DNA开始复制的所必需的因子^[3]。增殖细胞核抗原可作为细胞发生有丝分裂增殖的标志，可通过测量该蛋白浓度的高低反映细胞增殖与凋亡的程度，判断细胞增殖是否属于恶性增殖，作为生精细胞增殖的一个重要指标^[4]。

c-fos基因是原癌基因中重要的一种，被某些因素激活后，启动基因的遗传特征，发生转录生成mRNA，穿出细胞核在细胞质中翻译为c-Fos蛋白。c-Fos蛋白是细胞发生转录翻译过程中重要的转录因子，它与c-Jun蛋白结合形成异源二聚体，异源二聚体具有激活核酸发生转录。因此，异源二聚体又被称为激活蛋白1(activation protein-1，AP-1)。AP-1与核酸之间具有高亲和结合力，可调控目的基因转录，促进细胞发生有丝分裂、分化和细胞内信号传递^[5]。

睾丸组织，包括睾丸间质细胞和生精细胞均可表达c-Fos蛋白，它作为转录因子调控睾丸组织细胞的增殖和分化，促进生精细胞在过度时期的发育，促使精原细胞向精母细胞分化^[6]。除此之外，c-fos还可直接调节睾丸间质细胞分泌睾酮，调控体内睾酮水平，睾酮可维持生精功能，刺激生殖器官的生长发育和蛋白质合成(特别是肌肉和生殖器官的蛋白质合成)，同时睾酮还参与神经-内分泌-免疫网络的调节^[7]。

灯盏花素是一种中药提取制剂，具有扩张血管，抗血凝效用，是临床常用的脑血栓、冠心病、脑供血不足、高黏脂血症、心绞痛等治疗药物之一^[8]。灯盏花素在改善糖尿病患者血糖水平，降低患者肾脏损伤，提高患者生殖系统功能上具有显著效果，但其作用机制尚未明确。

因此，实验探讨了灯盏花素对2型糖尿病大鼠睾丸增殖细胞核抗原和原癌基因c-fos表达的影响。

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材料方法

设计：随机对照动物模型实验。

时间及地点：于2014年3至6月在中南大学神经病学实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级雄性SD大鼠36只，体质量200-250 g，平均(223.6±14.6) g，购自武汉大学医学院动物实验中心，动物合格证号：763291。

2型糖尿病模型大鼠构建相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
灯盏花素注射液	黑龙江迪龙制药有限公司
链脲佐菌素	美国Sigma公司
鼠抗增殖细胞核抗原多克隆抗体、兔抗c-fos多克隆抗体、S-P免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂	天津灏洋生物技术有限责任公司
ACCU-CHEK Integra血糖仪	德国罗氏诊断有限公司
光学显微镜	日本Olympus公司
台式高速冷冻离心机	美国赛默飞世尔公司

方法：

分组及构建2型糖尿病模型大鼠：将36只大鼠随机分为3组，对照组、模型组和灯盏花素组各12只。模型组和灯盏花素采用体积分数2%链脲佐菌素25 mg/kg连续腹腔注射3 d建立2型糖尿病模型大鼠，7 d后以大鼠血糖≥16.7 mmol/L作为建模成功标准，对照组组大鼠予以同等容积的柠檬酸缓冲液单次腹腔注射。灯盏花素组在建模成功后采用灯盏花素注射液10 mg/(kg•d)连续4周腹腔注射^[9]，其他2组注射等量生理盐水。

血清睾酮水平监测：造模成功后给予各组大鼠禁食 12 h，再给予大鼠腹腔注入4%水合氯醛麻醉，取眶后静脉丛5 mL血液，2 500 r/min离心，取血清，选用ELISA法检测各组大鼠血清睾酮水平，操作严格按说明书进行。

2型糖尿病模型大鼠睾丸增殖细胞核抗原、c-Fos蛋白及mRNA表达检测：麻醉采血后断头处死大鼠，取大鼠双侧睾丸，一侧氮液保存，一侧进行Bouins固定。选用SP免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原及c-Fos蛋白表达水平，Bouins固定后常规石蜡包埋，5 μm厚切片。加入增殖细胞核抗原一抗(1∶50)，c-fos一抗(1∶100)，4 ℃过夜。然后用PBS冲洗3次，每次10 min。加入生物素标记的 1∶100稀释的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次10 min。3-氨基-9-乙基咔唑显色试剂进行10 min的显色，自来水冲洗后，重复染色，封固。观察增殖细胞核抗原及c-Fos蛋白表达水平，DBA染色，苏木精复染，然后进行常规的脱水、透明和封固。以1∶100稀释的一抗为PBS的切片为阴性对照，细胞核和(或)细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性对照。每个标本取3张切片，采用光学显微镜对组织切片进行观察，DP-70进行图像定量分析，以棕黄色颗粒面积与观察视野面积的比值作为增殖细胞核抗原和c-Fos蛋白的相对量，取其平均值。

c-fos和增殖细胞核抗原的mRNA表达选用RT-PCR法检测。取液氮中保存的一侧睾丸，将其研磨成粉，根据试剂盒说明书提取RNA。取5 μL RNA，1%琼脂糖凝胶电泳，可见28 S，18 S和5 S处均有一条完整的条带，表示提取的RNA较为完整，采用紫外分光光度计检测结果表明提取的RNA条带未被污染。取3 μL RNA进行模板逆转以录成cDNA，并行PCR反应，产物电泳，并选用紫外透射反射分析仪摄像，输入软件分析，判读结果。各引物的基因序列见表1。

结果判定：增殖细胞核抗原和c-Fos蛋白免疫阳性产物位于细胞核，呈棕黄色颗粒，免疫阳性细胞主要为精原细胞、初级精母细胞，少数支持细胞核肌样细胞核中。定量分析采用MiVnt图像分析系统，每组随机选取5只大鼠的睾丸，每个标本随机选取3张切片去平均值，在10×20倍的显微镜下进行读片，以免疫阳性产物面积占视野面积的比例作为蛋白表达的相对水平。

主要观察指标：观察3组大鼠的血睾酮水平与血糖水平，睾丸组织增殖细胞核抗原，c-fos及mRNA表达差异。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间数据差异的检测采用单因素方差分析和LSD检验，检验水准α=0.05。

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讨论

3.1 糖尿病引起睾丸功能损伤的机制糖尿病患者常伴有睾丸功能障碍。患者血浆中游离睾酮水平明显降低，雌二醇水平却明显升高，且随着病情进展而加重，性激素紊乱也是后天可治愈性性功能障碍或生殖能力低下的主要原因之一^[10]。

糖尿病可导致男性睾丸功能损伤^[11]。生殖系统功能损伤是糖尿病常见合并症之一，其中男性患者多表现为睾丸功能损伤，分析其发病机制可能为：①氧化应激反应，高血糖导致患者出现一氧化氮合酶，损伤线粒体，增强细胞色素c的生成，并以此激活凋亡蛋白酶，诱使细胞凋亡^[12]。②一氧化氮及一氧化氮合酶作用，高表达的一氧化氮可诱使患者线粒体损伤，或直接作用于DNA损伤，诱使细胞凋亡。此外，诱导型一氧化氮合酶抑制剂可改善患者肾脏、视网膜以及动脉病变程度^[13-14]。③内分泌激素影响，动物实验显示，糖尿病大鼠促卵泡素、促黄体激素及T合成量显著低于正常大鼠，其中T对生精细胞凋亡具有极强抑制作用，并可通过对应基因进行调控^[15]。有研究显示，T可通过抑制Fas表达来抑制生精细胞凋亡，改善大鼠生精能力^[16]。④凋亡相关基因作用，有学者动物实验发现，自发性糖尿病大鼠随着生精细胞凋亡的增加，大鼠Bcl-2蛋白表达水平逐步下降，而Bax蛋白逐步高表达。

3.2 糖尿病与睾丸组织增殖细胞核抗原的表达关系糖尿病与睾丸组织增殖细胞核抗原的表达间存在负性关系，随着糖尿病病程延长，血糖升高，增殖细胞核抗原表达明显下降。增殖细胞核抗原是细胞增殖启动的重要参与物，临床常选用该指标反映细胞增殖功能。

增殖细胞核抗原可以见于精原细胞及精母细胞内，精子细胞内十分少见，其即可促精原细胞有丝分裂，又可促精母细胞减数分裂，最终加速精子生成量^[17]。

睾丸内细胞增殖可保证患者体内足够数量的生精细胞和体细胞，保证成年人正常的生精能力。

关于糖尿病对精子影响的研究报道显示，糖尿病大鼠的睾丸直径、曲细精管的平均直径和增殖细胞核抗原的表达明显下降，且病理组织学检查发现糖尿病大鼠睾丸组织切片中生精细胞破坏和大范围缺乏^[18]。据报道，糖尿病大鼠的睾丸质量明显降低^[19]。也有文献报道，与正常健康人相比，糖尿病患者体内血浆睾酮的浓度明显降低，且随着病程的延长和病情加重，睾丸质量下降更明显^[20]。

实验发现3组大鼠间的增殖细胞核抗原表达差异显著，对照组的增殖细胞核抗原、表达水平显著高于灯盏花素组和模型组，灯盏花素组的增殖细胞核抗原表达水平显著高于模型组，这表明糖尿病大鼠存在明显的增殖细胞核抗原低表达，分析与糖尿病患者体内激素、生长因子以及旁分泌因子变化有关。实验还发现3组大鼠的血睾酮与血糖水平差异显著，对照组的睾酮为(1.55±0.21) μg/L，显著高于灯盏花素组(1.38±0.32) μg/L和模型组(0.36±0.27) μg/L；对照组血糖为(10.43±2.09) mmol/L、灯盏花素组为(11.65± 2.53) mmol/L，显著低于模型组(26.78±4.73) mmol/L，且糖尿病大鼠睾丸质量显著低于其他两组，灯盏花素组次之，对照组最高，这表明糖尿病大鼠存在睾丸生殖细胞塌陷及弥漫缺失症状。

3.2 糖尿病与c-fos的关系 c-fos基因是原癌基因家族的一位成员，该基因被激活后可快速转录为mRNA，并进入细胞质内合成为c-Fos蛋白^[21]。c-fos基因激活后可调控促性腺激素和生长因子等分泌。c-Fos蛋白可见于睾丸组织内，包括睾丸间质细胞及生精细胞，该蛋白在促生殖细胞分化上具有显著效用，可加速生精细胞发育，诱使生精细胞向精母细胞过度^[22]。近年来有研究报道^[23]，促性腺激素可作用于间质细胞，促进睾酮激素的分泌^[24]，该过程常伴有c-fos原癌基因的过度表达。c-Fos蛋白可在基因表达过程中担任转录因子的功能，在人体内配子的有丝分裂及分化过程中发挥重要作用，促进生精细胞和精原细胞的发育成熟^[25-26]。

实验发现3组大鼠间的c-fos及mRNA表达差异显著，对照组的c-fos及mRNA表达水平显著高于灯盏花素组和模型组，灯盏花素组的c-fos及mRNA表达水平显著高于模型组，这表明低表达的c-fos及mRNA阻滞了生精细胞向精母细胞过度进程，大鼠生精细胞增殖能力下降，睾丸出现生精障碍，最终损失大鼠生殖能力。

灯盏花素是从天然植物灯盏花提取的黄酮类成分，主要成分为灯盏花甲素和灯盏花乙素，其中灯盏花乙素占有90%以上^[27]，其药理功效为扩张血管，改善血管微循环，提高机体耐氧能力，抗血栓上具有显著疗效^[28]。

近年来有关于灯盏花素药理机能的研究发现^[29]，灯盏花素含有还原性酚羟基，可产生氢原子，与体内的活性氧作用通过氧化还原反应清除羟氧自由基、过氧自由基和淬灭单线态氧，明显抑制体内的脂质过氧化作用，还可提高体内抗氧化酶系统的活性，间接发挥抗氧自由基功效^[30]。

灯盏花素可增强大鼠生殖系统血供，降低缺血、缺氧坏死带来的细胞内需整合信息缺失，改善增殖细胞核抗原、c-fos基因表达，增强大鼠生殖系统功能^[10^，^31-40]。

综上所述，2型糖尿病可引起患者生殖功能的下降，导致患者睾丸组织中的精原细胞向精母细胞的分化过程被抑制，生精细胞功能障碍，雄激素水平明显降低，精子生成能力下降，精子显著减少，生殖能力明显降低。灯盏花素可增强2型糖尿病大鼠增殖细胞核抗原、c-fos mRNA的表达水平，保护大鼠的生殖功能，削减糖尿病对睾丸的损害。

灯盏花素干预糖尿病模型大鼠睾丸组织增殖细胞核抗原和c-fos的表达

Breviscapine effects on the expression of proliferating cell nuclear antigen and c-fos in the testis of diabetic rat models

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[1]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[2]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[3]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[4]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[5]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[6]	徐晓明, 陈艳, 宋倩, 袁露, 顾加明, 张丽娟, 耿洁, 董坚. 人胎盘间充质干细胞凝胶促进SD大鼠放射性皮肤损伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3976-3980.
[7]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[8]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[9]	陈子扬, 蒲锐, 邓爽, 袁凌燕. 外泌体对运动介导胰岛素抵抗类疾病的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4089-4094.
[10]	徐伟龙, 左媛, 辛大奇, 贺晨阳, 赵鹏, 史鸣, 周博源, 刘雅婷, 赵岩. 急性钳夹型脊髓损伤模型大鼠造模方式的选择：一项网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3767-3772.
[11]	白胜超, 高扬, 王博, 李俊平, 王瑞元. 针刺干预大负荷运动损伤模型大鼠骨骼肌线粒体功能的动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3648-3653.
[12]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[13]	董丽萍, 罗怀青, 袁衡, 龙娟, 许少辉. 增龄对大鼠缺血后肢侧支血管生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3156-3161.
[14]	王朝格, 翁锡全, 林宝璇, 陈丽娜, 徐国琴. 低温运动干预肥胖大鼠的脂肪组织类型及功能改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3162-3167.
[15]	崔田田, 易岚, 欧阳厚淦, 吴慧婷, 欧阳彦楚, 陈楚. 热敏灸对盆腔炎症模型大鼠影响的三焦焦膜理论分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3168-3172.