肝门静脉海绵样变性模型大鼠组织抑制因子及基质金属蛋白酶表达
与周围血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内外尚无有效治疗肝门静脉海绵样变性的策略，且其病因的基础研究报道较为鲜见。
目的：拟建立大鼠门静脉海绵样变性模型，检测基质金属蛋白酶2，9，基质金属蛋白酶组织抑制剂1，2在大鼠门静脉及其周围组织的表达及周围血管新生中的作用。
方法：SD大鼠80只随机分为3组。以门静脉部分缩窄法复制门静脉海绵样变性的大鼠模型，以21 G钝针头操作。模型组和假手术组分别设术后2，4，6周3个时间点，对照组即不做任何处理的正常SD大鼠(造影后取材)。各组分别于处理后不同时间点行门静脉造影，免疫组织化学检测血管内皮细胞标记物CD31观察门静脉周围血管变化，并使用实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测大鼠门静脉及其周围组织的基质金属蛋白酶2，9，基质金属蛋白酶组织抑制剂1，2 mRNA的含量和蛋白的表达。
结果与结论：门静脉造影及血管内皮细胞标记物CD31免疫组织化学显示，模型组门静脉周围新生血管明显增多。RT-PCR与免疫组织化学结果分析显示：对照组和假手术组基质金属蛋白酶2 mRNA及蛋白表达均较同期模型组低(P < 0.01，P < 0.05)，基质金属蛋白酶9 mRNA及蛋白表达均较同期模型组低。模型组基质金属蛋白酶组织抑制剂1，2各个时间段的表达水平与对照组和假手术组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；模型组造模后第2周基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2比值明显高于对照组和假手术组同期(P < 0.05)。结果提示，构建的门静脉海绵样变性的模型大鼠死亡率低，成模率高，且比较稳定。基质金属蛋白酶2，9表达升高以及基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2的比值失衡，可能是大鼠门静脉海绵样变周围血管新生的分子机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 消化系统损伤模型, 肝门静脉海绵样变性, 基质金属蛋白酶, 基质金属蛋白酶组织型抑制剂, 血管新生

Abstract:

BACKGROUND: At present, there is no effective treatment strategy for cavernous transformation of portal vein and basic research about its etiology is rarely reported.
OBJECTIVE: To establish the models of cavernous transformation of portal vein, detect the expression of matrix metalloproteinase-2, -9 (MMP-2, MMP-9) and tissue inhibitors 1, 2 of metalloproteinase (TIMP-1, TIMP-2) in rat portal vein and peripheral tissue, and discuss the roles in the process of peripheral angiogenesis.
METHODS: Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups. The rat models of cavernous
transformation of portal vein were established with partial coarctation in portal vein by using 21 G blunt pinhead. Control group was normal rats without operation (samples were harvested after portal vein radiography). Model group and sham operation group were divided into three groups respectively according to different time points, namely 2, 4 and 6 weeks after operation. Rats of each group were randomly chosen at week 2, 4 and 6 after operation to observe the formation of collateral circulation of portal vein and its peripheral tissues by performing portal vein radiography. CD31 was detected by immunohistochemistry. The expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 mRNA and protein in portal vein and peripheral tissue were determined by RT-PCR and immunohistochemistry respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Peripheral angiogenesis of model group was increased obviously by portal vein radiography and immunohistochemistry. RT-PCR and immunohistochemistry results demonstrated that, compared with the control group and sham operation group, the expression of MMP-2 mRNA and protein in model group were significantly increased at weeks 2, 4, and 6 (P < 0.01, P < 0.05), while expression of MMP-9 mRNA and protein at week 2 in model group were significantly higher than that in the control group and sham operation group. Expression of TIMP-1 and TIMP-2 in model group showed no significant difference compared with control group and sham operation group at weeks 2, 4, and 6 (P > 0.05). Ratio of MMP-2/TIMP-2 of model group was significantly higher than that of control group and sham operation group (P < 0.05) at week 2. the rat models of cavernous transformation of portal vein have low mortality, high success rate and are stable. Upregulation of the expression of MMP-2, MMP-9 and the disbanlance of the ratio of MMP-2/TIMP-2 might contribute to the peripheral angiogenesis in rats with cavernous transformation of portal vein.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: Portal Vein, Matrix Metalloproteinase 2, Matrix Metalloproteinase 9

中图分类号:

R318

赵璐，刘磊，毛建雄，王建尧，徐金永，叶晓烁. 肝门静脉海绵样变性模型大鼠组织抑制因子及基质金属蛋白酶表达
与周围血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2884-2890.

Zhao Lu, Liu Lei, Mao Jian-xiong, Wang Jian-yao, Xu Jin-yong, Ye Xiao-shuo. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinase in rats with cavernous transformation of portal vein and their role in peripheral angiogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2884-2890.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物标本数量由于模型组造模后死亡6只与未符合标准的1只，模型组后2，4周各10份标本，模型组造模后6周为13份标本，共33份标本。假手术组无死亡，其2，4，6周各10份标本，共30份标本进入结果分数。

2.2 血管造影结果假手术组各组造影结果与对照组并无明显差异未予取图，以对照组为例与模型组进行比较。

正常对照组对比剂经肠系膜上静脉顺利进入门静脉及肝脏，显影清晰。

模型组造模后2周，可见肝门下方门静脉根部有一狭窄环；模型组造模后4，6周，肝脏各分叶显示欠佳，肝门区门静脉的轮廓渐进模糊，形成了类似海绵状血管瘤的血管团，且远端门静脉血可通过血管团进入肝脏。见图1。

2.3 免疫组织化学结果分析与对照组和假手术组相比，模型组标记新生血管内皮细胞的内皮细胞标记物CD31呈上升趋势，与血管造影一致。

模型组各个时间点门静脉及其周围组织中均有基质金

属蛋白酶2、9，基质金属蛋白酶组织抑制剂1、2蛋白表达，主要位于成纤维细胞，巨噬细胞包浆，以及少量毛细血管内皮细胞胞膜，在胞浆和细胞外间质可见棕黄色颗粒，见图2。对照组和假手术组蛋白表达均较低，见图3。各组间平均吸光度值比较见表2，3。

2.4 荧光定量PCR结果分析基质金属蛋白酶2，9在模型组造模后2周时的表达量明显高于同期假手术组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.01；P < 0.05)；第4，6周基质金属蛋白酶2，9的表达量所下降(图2)，但两组基质金属蛋白酶2 mRNA含量仍明显高于对照组和假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)，而模型组造模后4，6周基质金属蛋白酶9 mRNA含量与对照组和假手术组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。对照组和假手术组各时间段的基质金属蛋白酶2，9 mRNA含量差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

模型组各个时间段基质金属蛋白酶组织抑制剂1，2表达水平与对照组和假手术组相比差异均无显著性意义(P > 0.05)；对照组和假手术组各时间段的基质金属蛋白酶组织抑制剂1，2的mRNA含量差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2、基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1比值：模型组术后2周时基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2比值明显高于对照组和假手术组，差异有显著性意义(P <

0.01)；4，6周基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2比值与对照组和假手术组差异无显著性意义(P > 0.05)。

模型组基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1比值在各时间段与对照组和假手术组差异均无显著性意义(P > 0.05)。对照组和假手术组各时间段的基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2、基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1比值差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表5。

参考文献

[1] Gibson JR.Cavernous transformation of the portal vein.J Pathol Bact.1955;70:81-95.
[2] De Gaetano AM,Lafortune M,Patriquin H,et al.Cavernous transformation of the portal vein: patterns of intrahepatic and splanchnic collateral circulation of intrahepatic and splanchnic collateral circulation detected with Doppler sonography. AJR Am J Roentgenol.1995;165:1151-1155.
[3] Fernandez M, Mejias M, Angermayr B,et al. Inhibition of VEGF receptor-2 decreases the development of hyperdynamic splanchnic circulation and portal-systemic collateral vessels in portal hypertensive rats.Hepatol.2005;43 (1):98-103.
[4] 梁颖,蒋涛,王亚杰,等. 螺旋CT评价门静脉海绵样变性及其侧支循环的特点[J].中国医学影像技术,2008,24(7):1076-1079.
[5] Hijova E. Matrix metalloproteinases:their biological funcations and clinical implications.Bratisl Lek Listy.2005;106(3): 127-132.
[6] Chistiakov DA,Sobenin IA,Orekhov AN.Vascular extracellular matrix in atherosclerosis. Cardiol Rev.2013;21(6):270-288.
[7] 王建尧,刘磊,王斌,等.门静脉海绵样变性大鼠模型制作方法的探讨及体会[J].中国普外基础与临床杂志,2010,17(1):46-51.
[8] 毛建雄,刘磊,王斌,等.门静脉部分缩窄制作SD大鼠门静脉海绵样变性动物模型[J].中国优生与遗传杂志,2012,20(6):89-91.
[9] Fernandez M, Mejias M, Garcia-Pras E,et al. Reversal of portal hypertension and hyperdynamic splanchnic circulation by combined vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor blockade in rats. Hepatology. 2007;46(4):1208-1217.
[10] Mejias M, Garcia-Pras E, Tiani C,et al. The somatostatin analogue octreotide inhibits angiogenesis in the earliest, but not in advanced, stages of portal hypertension in rats. Cell Mol Med. 2008;12(5A):1690-1699.
[11] Fang J, Shing Y, Wiederschain D, et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogemc phenotype in anlulor model.Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(8):3884-3889.
[12] 王兆京,张丹丹,陈志伟,等.MMP-9与VEGF在成人肝血管瘤中的表达及其意义[J].东南大学学报,2014,33(1):66-70.
[13] Murphy G. Tissue inhibitors of metalloproteinases. Genome Biol.2011;12(11):233.
[14] Rosenberg GA , Estrada EY, Dencoff JE. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke.1998;29(10):2189-2195.
[15] van Hinsbergh VW, Engelse MA, Quax PH. Pericellular protcases in angiogenesis and vasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26(4):716-728.
[16] 刘海龙,吴黎明,许圆圆. 在体大鼠心肌缺血再灌注中MMP-2/9、TIMP-1 /2mRNA和蛋白表达及MMP-2/9酶活性的同步动态变化[J]. 中国分子心脏病学杂志,2009.9(6):332-337.
[17] Lu H, Cao X, Zhang H,et al. Imbalance between MMP-2, 9 and TIMP-1 promote the invasion and metastasis of renal cell carcinoma via SKP2 signaling pathways. Tumour Biol, 2014.2. [Epub ahead of print].
[18] Mohamed MM, EI-Ghonaimy EA, Nouh MA, et al. Cytokines secreted by macrophages isolated from tumor microenvironment of inflammatory breast cancer patients possess chemotactic properties. Int J Biochem Cell Biol. 2014; 46:138-147.
[19] Marzano AV, Cugno M, Trevisan V, et al. Inflammatory cells, cytokines and matrix metalloproteinases in amicrobial pustulosis of the folds and other neutrophilic dermatoses. Int J Immunopathol Pharmacol. 2011;24(2):451-460.
[20] Nagase H1, Woessner JF Jr. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem. 1999;274(31):21491-21494..
[21] Dimas G, Iliadis F, Grekas D. Matrix metalloproteinases, atherosclerosis, proteinuria and kidney disease: Linkage-based approaches. Hippokratia. 2013;17(4):292-297

引言

肝门静脉海绵样变性是一个相对罕见的疾病，因其形态类似海绵状血管瘤曾一度被人们称为“门静脉海绵状瘤”。1869年Balfour和Stewart^[1]首次报道了门静脉海绵状血管瘤作为导致脾肿大和腹水的门静脉血栓与门静脉曲张，随后Kobrich创造了“门静脉海绵状血管瘤”一词来描述门静脉海绵状奇特的外观和“门静脉海绵样变”这个词组，并认为该病可能是因门静脉栓塞导致的，继而引起人们对这一疾病的关注^[2]。目前对于小儿肝门静脉海绵样变性的发病原因尚未明确，其中最主要的3个因素是门静脉先天性的发育异常学说、脐静脉感染学说以及门静脉血栓的形成，临床表现也主要集中在门静脉高压的表现，如脾肿大、脾功能亢进、腹水以及侧支循环建立等。患者多出现上消化道出血、贫血、反复呕血、柏油样便，出血量大时容易出现失血性休克，严重危及患儿的生命，因此进一步加深对肝门静脉海绵样变性发生发展规律的认识，提出相应措施的理论依据很有必要。

近年研究表明作为肝前性门静脉高压的肝门静脉海绵样变性不仅形成侧支循环，同时存在血管的新生^[3-4]。新生血管形成的过程包括毛细血管内皮层下基底膜降解、内皮细胞迁移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成的一系列过程。其中，基底膜的降解是最为关键的一步。

目前基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)通过降解细胞外基质等作用在心血管、肿瘤等血管新生疾病领域已被公认^[5]。基质金属蛋白酶组织型抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase; Angiogenesis，TIMPs)作为其内源性抑制剂选择性的与基质金属蛋白酶形成复合物，抑制细胞外基质的降解，对维持血管周围基质的稳定性具有重要的影响。二者在体内的作用复杂多样，需要各个成员相互协调和抑制。

早在20世纪就有通过研制基质金属蛋白酶抑制剂治疗癌症、关节炎、角膜溃疡等血管新生的疾病。Chistiakov等^[6]认为降低基质金属蛋白酶降解活性，抑制细胞外基质的降解，是防治血管外基质损害的关键，现如今也有研究基质金属蛋白酶组织型抑制剂变异型可选择性的抑制特定的基质金属蛋白酶的替代疗法进行肿瘤组织靶向基因治疗。因此，基质金属蛋白酶及其组织抑制剂对血管新生作用毋庸置疑。

本实验从血管新生的角度作为新试点，在肝门静脉海绵样变性的形成过程中的不同时间点从基因水平对基质金属蛋白酶及其抑制剂进行检测，观察肝门静脉海绵样变性的发展规律，为肝门静脉海绵样变性的病因探索提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年11月至2014年6月在中国科学院深圳先进技术研究院完成。

材料：

大鼠肝门静脉海绵样变性过程中基质金属蛋白酶及其组织抑制因子的表达实验所用试剂：
试剂	来源
兔抗鼠CD31单克隆抗体，兔抗鼠基质金属蛋白酶2、9，基质金属蛋白酶组织抑制剂1、 2多克隆抗体	武汉博士德生物工程有限公司
DAB显色试剂盒	北京中山金桥公司
免疫组织化学SP试剂盒及RT-PCR引物	上海生工生物工程有限公司
LightCycler480 Software Setup	罗氏(Roche)

实验动物：SPF级出生50-60 d健康雄性SD大鼠80只，体质量(200±30) g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

实验方法：

大鼠门静脉海绵样变性模型的建立与分组：80只SD大鼠采用随机数字表法分为3组：正常对照组10只；假手术组30只，模型组40只。正常对照组于术前进行造影和取材，最终为10份标本；假手术组与模型组分别于术后的第2，4，6周每周随机抽取10只大鼠进行造影及取材。

参照本课题组成员报道的方法建立动物模型^[7-8]：体积分数10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉大鼠后固定四肢，腹部取正中切口，逐层开腹进入腹腔后，在肝十二指肠韧带内找出门静脉，用蚊钳对其进行分离，分离部位选择在从门静脉左右分支下方开始1 cm的范围，并用蚊钳带过3-0丝线备用。此时助手取21 G钝头针并行靠在游离后的门静脉上，用预先留置的3-0丝线将门静脉和钝头针一起结扎，结扎后抽出钝头针，门静脉的直径即为钝头针直径，逐层关腹，术后6周才可成模。

大鼠门静脉造影：对各组大鼠进行门静脉造影，观察各组不同时间段肝门部变化以及确定是否成模。对比剂选用60%碘普罗胺，预先与肝素混合，于肠系膜上静脉远端进针穿刺，缓慢推入对比剂，同时用Hilachi TU-6000数字胃肠机进行拍摄，观察对比剂是否进入门静脉及肝脏。

大鼠门静脉海绵样变性模型成模标准^[7-8]：第2周时以少量对比剂通过结扎形成的狭窄环进入肝脏为标准，伴或不伴有离肝性侧支循环开放；4周除离肝性侧支循环外，有向肝性的侧支循环，部分肝门部伴有少量血管影；6周以肝门部形成形成不规则的、团状的血管影，以及远端门静脉血通过血管团进入肝脏为标准列入。

标本的采集与处理：分别于手术后第2，4，6周造影结束后取SD大鼠门静脉及其周围组织100 mg，冷生理盐水冲洗后部分置于甲醛中用于苏木精-伊红染色染色及免疫组织化学检测；部分液氮中速冻置-80 ℃冰箱保存用于实时定量PCR技术检测。

免疫组织化学检测：①石蜡标本常规4 μm切片后，置于56 ℃实验烤箱过夜，脱蜡至水，置于体积分数3%的过氧化氢中室温孵育3 min，枸橼酸工作液高压锅喷气 2 min进行抗原修复后，滴加一抗，室温中反应4 h，PBS清洗3次后滴加二抗反应30 min，行免疫组织化学SP法染色，PBS清洗后DAB显色。苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封固，显微镜下观察显色结果。PBS代替一抗作为空白对照。②以细胞膜、细胞浆或细胞外基质出现棕黄色颗粒为阳性，应用图像分析采用软件Image-Pro 6.0软件，检测阳性细胞积分吸光度(IA)值及面积并计算(MA)值。

RT-PCR检测：①采用Trizol一步法从冷冻组织中提取总RNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测18 S、28 S两条带后，参照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒说明书，反转录合成cDNA，以GAPDH为内参，使用定量PCR试剂：ABI SybrGreen PCR Master Mix (2X)，在LightCycler480 Software Setup荧光定量PCR仪上进行荧光实时定量PCR扩增，扩增条件：95 ℃预变性3 min，然后95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共40个循环。引物序列及长度见(表1)。②结果由PCR反应曲线得到Ct值，采用2^-^ΔΔ^ct法计算相对定量结果。

表1 Real-time 定量PCR引物序列

Table 1 Primer sequence in real-time quantitative PCR

基因	F/R primer (5’to3’)	序列	产物长度
内参引物 GAPDH	F R	CAA GTT CAA CGG CAC AGT CAA CGC CAG TAG ACT CCA CGA CA	140 bp
基质金属蛋白酶2	F R	AAT GGT CGG GAA TAC AGC AG GGG ACA GAA GCC ATA TTT GC	108 bp
基质金属蛋白酶9	F R	TGA CAC CGC TCA CCT TCA C TGC CAG TAG ACC ATC CTT GC	116 bp
基质金属蛋白酶组织抑制剂1	F R	TGT TTC CCT GTT CAG CCA TC ATC GCT CTG GTA GCC CTT CT	101 bp
基质金属蛋白酶组织抑制剂2	F R	GCC CTA TGA TCC CAT GCT AC GCG CAA GAA CCA TCA CTT CT	130 bp

主要观察指标：①免疫组织化学检测血管内皮细胞标记CD31观察门静脉周围血管变化。②实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测大鼠门静脉及其周围组织的基质金属蛋白酶2、9基质金属蛋白酶组织抑制剂1、2 mRNA的含量和蛋白的表达。

统计学分析：实验数据均以x(_)±s表示，各组间比较用多样本均数比较的单因素方差分析，应用SPSS 19.0统计学软件进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

讨论

作为肝前性门静脉高压的肝门静脉海绵样变，血管再生是其一个病理特征，集中表现于门静脉侧枝血管的形成、内脏血管系统的高动力循环状态，以及门静脉周围血管即肝门静脉海绵样变性的形成，因此，控制血管再生成为治疗门静脉高压症的的靶点^[9-10]。

血管基底膜降解是血管再生初期活性化的首要阶段，且细胞外基质蛋白酶在血管基底膜的降解、细胞游走和浸润以及血管塑造的血管再生过程中尤为关键，而三类蛋白水解酶中，基质金属蛋白酶被认为是最重要的一类。

Fang等^[11]研究证实在大鼠血管再生及肿瘤生长的过程中基质金属蛋白酶2表达量增加，其人工合成的阻滞剂可抑制血管再生。王兆京等^[12]在研究成人肝血管瘤证实，基质金属蛋白酶9可促进肝血管瘤的持续增长，通过释放基质中蓄积的血管内皮生长因子促进血管再生。基质金属蛋白酶抑制剂为基质金属蛋白酶的特异性抑制因子^[13]。正常生理情况下大部分基质金属蛋白酶均以无活性的潜在酶原形式存在，各种病理性因素刺激打破基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂的平衡，促使基质金属蛋白酶的激活都可能会产生血管再生。

Rosenberg等^[14]研究表明，基质金属蛋白酶组织抑制剂1和基质金属蛋白酶组织抑制剂2分别选择性的抑制基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶2，且基质金属蛋白酶组织抑制剂2基因剔除的小鼠研究结果也进一步证明了，基质金属蛋白酶促血管生成的蛋白水解活性受基质金属蛋白酶组织抑制剂2的抑制^[15]。刘海龙等^[16]在建立大鼠心肌缺血再灌注模型的实验中证实基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂的比例失衡，激活的基质金属蛋白酶可降解血管壁基质胶原，促进血管再生，使心脏收缩功能障碍造成心肌损伤。Lu等^[17]在研究肾细胞癌时证实通过SKP2信号通路调节基质金属蛋白酶2，9与基质金属蛋白酶组织抑制剂1的平衡可能导致肿瘤血管生长，促进肿瘤侵袭和转移。因此，在一些疾病发展过程中基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂的比例失衡导致血管再生毋庸置疑。

本实验结果显示，在肝门静脉海绵样变性形成过程中模型组大鼠门静脉及其周围组织中基质金属蛋白酶2，9蛋白和基因的表达水平逐渐增高，造模后2周为高峰，与术前(对照组)和假手术组相比有显著差异，4，6周基质金属蛋白酶2表达仍然持续高于术前(对照组)和假手术组，而基质金属蛋白酶9的mRNA含量术后4，6周时降至正常水平。这提示基质金属蛋白酶2可能在肝门静脉海绵样变性的整个形成过程中发挥作用，而基质金属蛋白酶9可能仅在早期参与。

相关文献报道，基质金属蛋白酶可以介导炎性因子的活化^[18-19]，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β等，而炎性因子又可以促进基质金属蛋白酶的表达，猜测早期由于外界予以门静脉缩窄的刺激，导致局部压力骤然升高，机体在缺血缺氧及其炎症的条件下代偿性的使基质金属蛋白酶分泌增加，构成了恶性循环，因此判断第2周时基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的高峰状态是由早期炎症因子介导的。但由中性粒细胞表达的基质金属蛋白酶9与其他细胞类型不同，其衍生的基质金属蛋白酶9的前体不与基质金属蛋白酶组织抑制剂1结合，因此在肝门静脉海绵样变性成模早期基质金属蛋白酶9可能更容易被激活而促使血管的生成，由于实验本身设计检测大鼠成模时间最早为2周，而实际上基质金属蛋白酶9mRNA的高峰可能早于2周却并没有检测，所以导致基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶2高峰的差异。

实验中基质金属蛋白酶组织抑制剂1和基质金属蛋白酶组织抑制剂2在3组中的表达差异并无统计学意义。基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2比值仅在模型组造模后2周明显高于正常组和假手术组，而基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1比值在各组件并无明显变化。这些可能与标本的选择及标本量有关。

作者认为早期过度表达的基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9通过降解门静脉的周围组织即细胞外基质，破坏门静脉及其周围已存血管的基底膜，解除血管壁细胞外基质结构骨架束缚，来促进新生血管的生芽。而此时基质金属蛋白酶组织抑制剂1、基质金属蛋白酶组织抑制剂2表达相对较低不能有效的结合基质金属蛋白酶形成复合体发挥对血管新生的阻碍作用，二者比例明显失调。而后期从病理学角度考虑，门静脉海绵样变的血管新生和恶性肿瘤的血管再生本质不同，门静脉周围的毛细血管并不是不受限制的增长，所以作者分析在肝门静脉海绵样变性的形成后期，门静脉的压力以及血管新生趋于稳定，但新生毛细血管的的基底膜并不完整，细胞间的通透性增加，机体可能代偿性的分泌一些细胞外基质产物的产生，促进一定量的基质金属蛋白酶组织抑制剂的释放，从而来抑制了基质金属蛋白酶的活性。

因此，作者认为基质金属蛋白酶2，9可能参与肝门静脉海绵样变性血管生成的病理生理过程，基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2的比值失衡可能是肝门静脉海绵样变性形成的潜在因素。但由于基质金属蛋白酶的调节是一个相对复杂的过程，涉及到基因转录、蛋白翻译、基质金属蛋白酶活性的激活等多方面的问题^[20-21]，且有关门静脉海绵样变与基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂的相关性研究较为鲜见，其确切的病理发生机制也尚不清楚，因此，明确基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂在肝门静脉海绵样变性形成过程中的作用以及是否协同其他相关细胞因子，需要进一步的研究与探讨。