构建股骨骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2800-2806.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.003

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构建股骨骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达

柏小金1，徐林1，骆旭东2，刘福英2，黄文良1，郭元1，马立坤1，程小菊1，柏猛1

1遵义医学院第三附属医院骨科一病区，贵州省遵义市 563000；2深圳市南山医院，广东省深圳市 518000

出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 骆旭东，博士，主任医师，硕士生导师，深圳市南山医院，广东省深圳市 518000
作者简介:柏小金，男，1979年生，贵州省遵义市人，汉族，遵义医学院在读硕士，主治医师。
基金资助:
遵义市科技局资助项目[遵市科合社字(2011)19号]

Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and core binding factor alpha 1 in rat models of femoral fracture combined with cerebral trauma

Bo Xiao-jin1, Xu Lin1, Luo Xu-dong2, Liu Fu-ying2, Huang Wen-liang1, Guo Yuan1, Ma Li-kun1, Cheng Xiao-ju1, Bo Meng1

1The First Endemic Area, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital, Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Shenzhen Nanshan Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Luo Xu-dong, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Shenzhen Nanshan Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:Bo Xiao-jin, Studying for master’s degree, Attending physician, the First Endemic Area, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital, Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Zunyi Municipal Science and Technology Bureau Project, No. (2011)19

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨折及脑损伤后造成的低氧环境导致一系列相关因子的表达，包括低氧诱导因子1α和核心结合因子α1，二者在骨折愈合中具有重要的调控作用。但骨折合并脑损伤后骨折愈合加速是否与低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达相关还不十分清楚。
目的：构建脑损伤大鼠模型，对低氧诱导因子1α和核心结合因子α1在大鼠股骨骨折合并脑损伤及单纯股骨骨折模型的骨折愈合过程中表达的对比，评价脑损伤对骨折愈合的影响。
方法：将大鼠随机分为空白组、单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脑损伤组。造模后1，2，3，5周处死动物，通过股骨骨折断端X射线评分及骨痂组织进行苏木精-伊红染色评价模型大鼠不同时间点骨折愈合情况，通过免疫组织化学检测，评价3组低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达。
结果与结论：股骨骨折合并脑损伤组的骨折愈合情况优于单纯股骨骨折组。单纯股骨骨折和股骨骨折合并脑损伤两组的组内1，2，3，5周低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；同一时间段组间比较，单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脑损伤组均明显高于空白组，股骨骨折合并脑损伤组高于单纯股骨骨折组(P < 0.05)。结果证实，骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1表达更为突出，这可能是骨折合并脑损伤后骨折愈合加速的重要原因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 骨及关节损伤模型, 低氧诱导因子1α, 核心结合因子α1, 股骨, 骨折, 脑损伤, X射线；骨折愈合, 大鼠, 加速

Abstract:

BACKGROUND: The low oxygen environment after femoral fracture and cerebral trauma will induce series of related cytokines expression, including hypoxia-inducible factor 1α and core binding factor α1, which play key roles in regulating bone healing. However, whether the accelerated bone healing is correlated with the expression of hypoxia-inducible factor 1α and core binding factor α1 is still unknown.
OBJECTIVE: To construct rat models of brain injury, to compare the expression level of hypoxia-inducible factor 1α and core binding factor α1 in femoral fracture combined with cerebral trauma rats and simple femoral fracture rats, and to assess the influence of cerebral trauma on bone healing.
METHODS: Rats were randomly divided into blank group, simple femoral fracture group and femoral fracture combined with cerebral trauma group. At 1, 2, 3 and 5 weeks after modeling, rats were executed. Bone healing was evaluated using femoral fracture end X-ray score and hematoxylin and eosin staining at callus tissues. Besides, the expression levels of hypoxia-inducible factor 1α and core binding factor α1 of three groups were
determined with immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone healing in the femoral fracture combined with cerebral trauma group was better than that of simple femoral fracture group. There was significant difference in the expression level of hypoxia-inducible factor 1α and core binding factor α1 between the simple femoral fracture group and femoral fracture combined with cerebral trauma group (P < 0.05). At the same time, the level of simple femoral fracture group and femoral fracture combined with cerebral trauma group was significantly higher than that of blank group, and that in femoral fracture combined with cerebral trauma group was significantly higher than that of simple femoral fracture group (P < 0.05). Results verified that the expression levels of hypoxia-inducible factor 1α and core binding factor α1 of rats with femoral fracture combined with cerebral trauma were significantly high, which may be the major reason why the bone healing was accelerated after fracture combined with brain injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Femur, Fractures, Bone, Fracture Healing

中图分类号:

R318

柏小金，徐林，骆旭东，刘福英，黄文良，郭元，马立坤，程小菊，柏猛. 构建股骨骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2800-2806.

Bo Xiao-jin, Xu Lin, Luo Xu-dong, Liu Fu-ying, Huang Wen-liang, Guo Yuan, Ma Li-kun, Cheng Xiao-ju, Bo Meng. Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and core binding factor alpha 1 in rat models of femoral fracture combined with cerebral trauma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2800-2806.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠80只，因麻醉意外死亡3只，1只因感染死亡(因同笼老鼠啃食骨折患肢，导致皮肤和肌肉大面积缺损，给予每天碘伏消毒和青霉素皮下注射治疗后死亡)，无明显原因死亡1只，75只进入结果分析。

2.2 股骨骨折合并脑损伤模型大鼠脑组织形态脑损伤模型制作后24 h采用光学显微镜40倍物镜下观察股骨骨折合并脑损伤组脑组织细胞病理改变，与空白组正常脑组织对比，股骨骨折合并脑损伤组符合弥漫性中度脑损伤表现。见图2。

2.3 股骨骨折合并脑损伤模型大鼠影像学表现见图3。两组骨痂的X射线平片评分随时间的推移不断升高。造模后1周，两组标本骨折端骨痂较少，骨折线清晰，骨折端只有骨外膜包绕；造模后2周，骨痂增多，仍可见骨折线，但股骨骨折合并脑损伤组骨痂较单纯股骨骨折组明显增多，骨折线相对模糊；造模后3周，骨痂进一步增加，骨折线开始变得模糊；造模后5周，骨痂继续增多，两组样本骨折线更加模糊，甚至消失，股骨骨折合并脑损伤组骨折端髓腔部分再通。造模后1周时两组标本的X射线评分无显著差异，2，3，5周时差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 股骨骨折合并脑损伤模型大鼠骨痂指标变化各组大鼠骨痂苏木精-伊红染色结果见图4。结果显示，单纯股骨骨折组骨折愈合过程明显，造模后1周可见成纤维细胞长入，2周可见骨折断端有肉芽组织继续生长和纤维性骨痂、软骨性骨痂出现，3周可见少量骨小梁，5周可见较成熟骨小梁。股骨骨折合并脑损伤组骨骼愈合过程更加明显，造模后1周看可见肉芽组织生长连接，2周有软骨岛形成，出现大量软骨细胞，3周出现纤维骨痂和软骨骨痂，形成少量编织骨；造模后5周出现大量成熟骨小梁，编织骨继续增加，散落少量肥大软骨细胞。

各组免疫组织化学检测低氧诱导因子1α和核心结合因子α1表达情况见图4。

低氧诱导因子1α 各组各个时间段均有表达，单纯股骨骨折组低氧诱导因子1α表达呈递增趋势，高峰出现在造模后第2周，第5周时仍高于空白组；股骨骨折合并脑损伤组造模后一开始上升幅度较单纯股骨骨折组明显，2周达高峰，3周后逐渐下降，5周后仍高于空白组；空白组各时间段变化不大，表达不明显，差异无显著性意义(P > 0.05)。同一时间各组表达情况相比，单纯股骨骨折组、股骨骨折合并脑损伤组表达均明显高于空白组，股骨骨折合并脑损伤组明显高于单纯股骨骨折组(P < 0.05)；单纯股骨骨折组、股骨骨折合并脑损伤组内不同时间段数据间比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2；证明大鼠分别在骨折和骨折合并脑损伤后早期低氧诱导因子1α就有明显的表达，并有一定的规律。

核心结合因子α1各组各个时间段均有表达，单纯股骨骨折组核心结合因子α1表达呈递增趋势，高峰出现在造模后第2，5周时仍高于空白组；股骨骨折合并脑损伤组造模后开始上升幅度更大，2周达高峰，3周后逐渐下降，仍保持较高的表达，5周后仍明显高于空白组；空白组在各时间段表达不明显(P > 0.05)。同一时间各组表达情况相比，单纯股骨骨折组、股骨骨折合并脑损伤组表达均明显高于空白组，股骨骨折合并脑损伤组明显高于单纯股骨骨折组 (P < 0.05)；单纯股骨骨折组、股骨骨折合并脑损伤组不同时间段数据间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。大鼠分别在骨折和骨折合并脑损伤后早期核心结合因子α1就有明显的表达，并有一定的规律。骨折合并脑损伤时核心结合因子α1的表达更为明显，且表达的时间持续较长。

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引言

在骨科临床工作中，四肢骨折合并脑损伤的患者，特别是中度以上脑损伤的患者骨折愈合的速度明显快于单纯四肢骨折的患者，且骨痂生长也较多，甚至出现骨痂过度生长，异位骨化。骨折及脑损伤后造成的低氧环境导致一系列相关因子的表达，包括低氧诱导因子1α(hy-poxia inducible factor 1alpha，HIF-1α)和核心结合因子α1(core binding factor alpha1，Cbfα1)。低氧诱导因子1α和核心结合因子α1都具有促进骨折愈合的作用，目前已经证实低氧诱导因子1α与创伤性脑损伤、脑缺氧缺血性疾病、肿瘤等病理生理过程密切相关。低氧时，随着低氧诱导因子1α的表达逐渐增加，核心结合因子α1/RunX2的表达也逐渐增高。

低氧诱导因子1α可直接调节骨系细胞功能，也可通过诱导促进血管生成因子的表达，促进骨折愈合过程^[1]。低氧诱导因子1α能够调控多种基因共同表达，在骨折部位可诱导生理功能完整的新血管生成，为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证，促进骨愈合；最近研究发现，低氧诱导因子1α是调控低氧张力下骨髓间充质干细胞增殖、维持其干细胞特性的重要转录调控因子，对于促进骨折愈合、治疗骨折并发症具有重要意义。此外，低氧诱导因子1α在创伤性脑损伤、肿瘤等病理生理过程和脑缺氧缺血性疾病等中具有重要作用^[2]。骨折及脑损伤发生后，局部低氧，低氧诱导因子1α的表达逐渐增加，Cbfal/RunX2的表达也随之逐渐增高^[3]。

核心结合因子α1也称RunX2，属于Run基因家族的一员。核心结合因子α1被证实具有调控成骨细胞发育、分化和骨形成的功能，在成骨细胞动员，膜内成骨，软骨内成骨和牙齿形成过程中发挥重要作用^[4]。核心结合因子α1是成骨细胞发生和分化的特异性转录因子，能够诱导多潜能间充质细胞向成骨细胞表型分化，并激活骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白等成骨基因转录，在骨折愈合过程中发挥重要作用。核心结合因子α1过表达能在体外上调成纤维细胞中血管内皮生长因子的表达，而血管内皮生长因子是血管生成的调控因子，血管侵入是软骨内骨化的关键。

骨折及脑损伤后造成的低氧环境导致一系列相关因子的表达，包括低氧诱导因子1α和核心结合因子α1，二者在骨骼愈合中具有重要的调控作用。但骨折合并脑损伤后骨折愈合加速是否与低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达相关还不十分清楚。通过对低氧诱导因子1α和核心结合因子α1在大鼠股骨骨折合并脑损伤模型及单纯股骨骨折模型骨折愈合过程中表达的对比研究，评价脑损伤对骨折愈合的影响，为基因治疗骨折提供更多的理论依据。

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材料方法

设计：随机对照动物模型实验。

时间及地点：于2014年5至8月在遵义医学院中心实验室及遵义市第一人民医院医院病理科完成。

材料：

实验动物：雄性3月龄SD大鼠80只，体质量(270±20) g，购自解放军第三军医大学大坪医院动物实验中心，许可证号：SCXK(军)2012-0013。实验动物SD大鼠饲养于普通级动物室。大鼠标准饲料培养，自由进食，定期紫外线消毒。

大鼠骨折合并脑损伤造模实验相关仪器及试剂：
试剂及仪器	来源
数字放射成像机(DR)	carestream health公司，瑞典
生物显微镜	尼康，日本
OHBA SIKI打击器	Tokyo，日本
金属骨针(长150 mm，直径1.0 mm)	天津新中医疗器械公司
330-4A数显电热保温箱	上海阳光实验仪器有限公司
低氧诱导因子1α和核心结合因子α1抗体	北京博奥森生物技术有限公司
辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG	北京中杉金桥生物技术有限公司

方法：

分组：将80只大鼠随机分为空白组10只、单纯股骨骨折组35只、股骨骨折合并脑损伤组35只。

构建股骨骨折大鼠模型(图1)：体积分数10%水合氯醛 (3 mL/kg)腹腔注射后麻醉单纯股骨骨折组大鼠，常规消毒，作右侧大腿中段外侧纵行切口，钝性分离肌肉层至股骨干，经股骨大转子下1.0 cm处线锯锯断股骨中段，用直径 1.0 mm金属骨针髓腔中轴固定，缝合切口，消毒包扎^[5]。造模后摄X射线片证实股骨中段骨折并内固定模型建立成功。

构建股骨骨折合并脑损伤大鼠模型(图1)：股骨骨折合并脑损伤组在已行骨折模型制作的基础上立即进行脑损伤模型制作，采用改进的Marmarou自由落体装置撞击大鼠颅骨制作弥漫性中度脑损伤模型^[6]：颅顶部正中2 cm× 2 cm手术区域剪除毛发，无菌条件下剪开大鼠脑顶部头皮，分离骨膜，在前囟与后囟连线中点用502粘连剂固定钢垫，将大鼠固定在海绵垫上，使400 g的铁锤自1.75 m高度落下，撞击正下方的钢垫。致伤后取下钢垫，缝合创口。造模成功后，常规饲养，并观察各组动物情况。造模后24 h，从股骨骨折合并脑损伤组随机各取4只再次麻醉后，经升主动脉先快速灌注生理盐水150 mL及冰冷的 40 g/L多聚甲醛100 mL，再用40 g/L多聚甲醛200 mL在1 h内缓慢灌注。最后断头取脑损伤中心外5 mm处脑组织浸入 100 g/L多聚甲醛内4 ℃固定48 h，修成厚4 mm块，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察，脑细胞出现水肿，出血，甚至坏死，评价大鼠弥漫性中度脑损伤。

脑损伤模型指标评价：股骨骨折合并脑损伤组造模 24 h后，取4只大鼠，升主动脉灌注40 g/L多聚甲醛固定脑组织，取脑损伤周围脑组织，固定后行苏木精-伊红染色，以证实造模是否成功。

骨折X射线片检查：单纯股骨骨折组及股骨骨折合并脑损伤组2组分别于造模后1，2，3，5周各取4只，进行在体股骨全长X射线摄片检查，观察骨折两端的变化，采用Goldberg等^[7]的方法对骨折愈合进行评分：0分，影像学未愈合；1分部分愈合；2分，完全愈合。

骨痂指标检测 ^[8-12]：分别于造模后1，2，3，5周各组处死动物6只。在无菌操作下距离骨折断端大约0.5 cm处截取骨痂标本，迅速去除软组织，行组织苏木精-伊红染色、免疫组织化学检测骨痂标本置于体积分数10%的甲醛中固定12 h，固定完毕后置入质量浓度200 g/L EDTA溶液中脱钙处理，常规石蜡包埋，苏木精伊红染色切片，行光镜观察骨痂的形态结构变化，评价各组成骨效果。取4 µm石蜡切片2张，一张做阴性对照用，阴性对照以PBS取代一抗，余步骤相同，取已知阳性片做阳性对照。切片常规脱蜡至水。体积分数3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育15 min，消除内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤5 min×3次。滴加封闭用正常山羊血清工作液，37 ℃温箱孵育40 min，甩去，勿洗。滴加一抗低氧诱导因子1α和核心结合因子α1抗体，湿盒内4 ℃冰箱过夜。0.1 mmol/L PBS洗涤5 min×3次。滴加生物素标记二抗，37 ℃温箱孵育25 min。0.1 mmol/L PBS洗涤5 min×3次。滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(工作液)，37 ℃温箱孵育20 min。0.1 mmol/L PBS洗涤5 min× 3次。DAB显色液显色，镜下控制显色时间，自来水冲洗。苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、封固。免疫组织化学染色图像分析，采用HPIAS.1000病理图文分析系统，对各组切片中低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的着色灰度进行定量测量，有棕黄色颗粒者为阳性部位，每张切片中取10个高倍视野，计算其灰度的平均值。

主要观察指标：通过股骨骨折断端X射线评分及骨痂组织进行苏木精-伊红染色评价单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脑损伤组不同时间点骨折愈合情况，通过免疫组织化学检测，评价3组低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，计数资料采用百分率表示，所有资料采用SPSS 17.0软件进行数据处理，组间数据差异的比较采用t 检验和χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

低氧诱导因子1α和核心结合因子α1在骨骼愈合中具有重要的调控作用。脑损伤后骨折愈合加速现象的关注开始于20世纪60年代。研究证实骨折合并脑损伤大鼠的骨痂生长速度明显快于单纯骨折组大鼠^[13-18]。已有研究证实，脑挫裂伤后脑组织水肿，颅内压增高，脑组织缺血缺氧，从而导致低氧诱导因子1α的表达。低氧诱导因子1α在急性脑缺血区大鼠中的表达情况由Ostrowski等^[19]首次发现。随后，Gerber等^[20]证实血肿灶周围及血肿侧皮质表达，具有促进血管生成的作用，从而促进脑组织修复。低氧诱导因子1α升高的程度与对脑损伤的保护程度呈正相关^[21]。低氧情况导致低氧诱导因子1α的高表达，核心结合因子α1/RunX2也随之呈高表达态势，脑损伤后会出现核心结合因子α1表达上调^[22-23]。低氧诱导因子1α属于碱性螺旋环螺旋/PAS蛋白家族，存在于大部分哺乳动物与人体组织中^[24-25]。近年来研究发现，低氧诱导因子1α有利于恢复低氧环境中成骨细胞增殖活性，加快其增殖速率，增强成骨功能。低氧诱导因子1α与血管发生、成骨细胞、破骨细胞的调控紧密相关。在低氧条件下，低氧诱导因子1α具有诱导核心结合因子α1表达的作用，后者可激活与启动间充质细胞向成骨细胞系分化和调节成骨细胞的发育，是成骨细胞特异性转录子和成骨细胞分化的调节因子。因此，核心结合因子α1是成骨细胞调控网络的关键所在^[24]。

股骨骨折及股骨骨折合并脑损伤大鼠动物模型中低氧诱导因子1α及核心结合因子α1呈高表达。实验通过大鼠股骨骨折及股骨骨折合并脑损伤大鼠动物模型，在不同时间段摄X射线片，采用Goldberg等^[7]的方法对骨折愈合进行评分，苏木精-伊红染色对比骨折愈合情况，采用免疫组化方法检测骨折断端骨痂中低氧诱导因子1α及核心结合因子α1的表达。结果显示，骨折合并脑损伤组骨折愈合评分明显高于单纯骨折组，骨痂生长更为理想。空白组低氧诱导因子1α及核心结合因子α1在不同时间段骨痂中表达均不明显。单纯骨折组及骨折合并脑损伤组低氧诱导因子1α及核心结合因子α1的表达均在造模后早期即开始逐渐升高，骨折合并脑损伤组升高更为明显，两组均在2周时达高峰，3周后下降，5周后仍高于空白组。总体骨折合并脑损伤组表达更明显。因此，大鼠骨折合并脑损伤时脑损伤加速了骨折愈合，低氧诱导因子1α及核心结合因子α1高表达，不但是在血清中有较为明显的表达，在骨痂中也存在明显表达，骨折合并脑损伤组表达更为明显，表明骨折合并脑损伤后低氧诱导因子1α及核心结合因子α1的高表达是骨折愈合的主要原因之一。在骨痂形成早期，核心结合因子α1即开始集中表达，它是骨折愈合的启动调节因子之一，在骨折愈合过程中发挥重要作用。低氧诱导因子1α又可对其靶基因，如血管内皮生长因子、促红细胞生成素基因、内皮一氧化氮合成酶的转录进行调控^[26-30]。在骨折合并脑损伤时，低氧诱导因子1α及核心结合因子α1在骨痂中均有明显表达、两者相辅相成，互为因果，共同促进骨折愈合。戚金威等^[26]报道称，大鼠急性心肌梗死后高表达的低氧诱导因子1α与骨髓间充质干细胞动员、启动一系列心肌组织自我修复过程有因果关系。对两个因子的研究可望指导构建符合骨组织微环境并易于血管化的骨修复生物材料尤其是组织工程化材料，为临床上通过植入含有低氧诱导因子1α及核心结合因子α1生物材料，进而促进骨折愈合提供更为充分的理论依据。

综上，大鼠骨折合并脑损伤时骨折愈合加速，骨折合并脑损伤后骨痂中低氧诱导因子1α及核心结合因子α1的表达较单纯骨折更加明显，进而证明低氧诱导因子1α及核心结合因子α1的高表达可能是加速骨折愈合的原因之一。

构建股骨骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达

Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and core binding factor alpha 1 in rat models of femoral fracture combined with cerebral trauma

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