人和动物的骨骼、牙齿包括有机成分和无机成分,有机成分主要是胶原纤维,无机成分主要是羟基磷灰石[19]。决定羟基磷灰石生物相容性和生物活性的重要因素之一是Ca/P比值。人体骨骼中的无机物羟基磷灰石结晶其Ca/P比值为1.51-1.67,故比值在此范围内的人工合成羟基磷灰石材料具有较好的生物活性。Ca/P比值还直接影响材料的稳定性:当Ca/P比值≤1.55时,羟基磷灰石结晶稳定性较差,易分解为磷酸三钙;当Ca/P比值在1.51-1.67之间,其稳定性最好,尤其是越接近1.67时强度最大;当Ca/P比值>1.67时,在烧结过程中易产生氧化钙,导致材料强度、致密度降低[20-22]。前期动物实验表明,羟基磷灰石是一种性能优良的人工生物材料,具有很好的生物相容性。羟基磷灰石的物理化学成分、晶体结构及理化性能与人正常骨的无机成分相似,植入人体后,可经过机体的新陈代谢置换出骨骼钙和磷,且羟基磷灰石上的羟基由氢键与机体组织完美键合,生物相容性极好,无免疫排斥现象[23-24]。本实验结果也表明,人脐静脉血管内皮细胞在纳米羟基磷灰石薄膜材料接触界面和材料上生长旺盛。
毒性实验主要包括急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性实验,另外,还有特殊毒性实验,如免疫毒性实验、致畸、致癌实验、遗传毒性实验、神经毒性实验。日常工作中,常选用不同种系的实验动物(小鼠、大鼠、狗、家兔、猴等动物),采用静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、经口、吸入或涂布皮肤等途径进行染毒,定期检测各项指标,获得可靠的毒性资料。本实验通过细胞毒性实验,利用体外细胞培养的方法来评价生物材料、医用装置或其浸提液可滤出成分中潜在的细胞毒性,以此评价材料与细胞的生物相容性。1948年,Rosen 等首次应用小鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物,以细胞毒性实验来评价材料细胞相容性。目前,医用生物材料、医用设置是近年发展起来的新兴的领域,已有大量产品被广泛应用于牙科、骨科、整形外科、心血管外科及其他各科临床。由于各种医用装置材料植入体内后都将与组织和细胞直接接触,因此医用装置及材料不仅要有临床所需要的良好理化性能,还必须具备良好的生物相容性。
医用装置的生物学评价等系列国际标准目前已颁布,中国已开始研究生物材料和医用装置的生物学评价方法,使国内评价医用生物材料及医用装置的生物学评价与标准等同,从而保证中国医用生物材料和医疗器械研究、生产质量和临床使用的安全性,促进医用生物材料研究的发展和水平的提高。根据以上国内外评价的标准,细胞毒性实验以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等优点均被列为首选实验项目,作为评价材料毒性的重要指标[25-28]。
本实验选择了最常用且与材料应用条件类似的浸提介质及浸提温度和时间,对纳米羟基磷灰石薄膜材料进行细胞毒性研究。其指导原则中规定了标准毒性实验方法,包括设计方案、染毒途径、剂量分组、动物品种、数量、观察内容等要求。它可推动毒性试验方法的统一和规范化,获得符合管理部门所需毒性资料。
本实验量化细胞毒性采取的评价方法是CCK-8法,运用CCK-8法替代传统的MTT法检测人脐静脉血管内皮细胞在纳米羟基磷灰石薄膜材料接触界面和材料上的增殖。CCK-8试剂内含有四唑单钠盐,在1-甲氧基5-甲基吩嗪硫酸二甲酯电子载体的作用下,四唑单钠盐可被人脐静脉血管内皮细胞中的乳酸脱氢酶还原为水溶性高的黄色甲臜染料,甲臜生成量与人脐静脉血管内皮细胞活细胞数呈正比,通过酶标仪测定(A值)来测量甲臜生成量,可以准确反映培养人脐静脉血管内皮细胞的增殖和活性情况[29-30]。CKK-8法较MTT法实验步骤简化,敏感性增强,可直接进行比色,不添加DMSO,避免了MTT法中DMSO对细胞增殖和活性的影响。
本实验利用体外培养人脐静脉血管内皮细胞的方法来评价生物材料、医用装置及浸提液可滤出成分中潜在的细胞毒性,并评价人脐静脉血管内皮细胞与材料的生物相容性。根据ISO10993-5 (1992)制定的细胞毒性实验的评价标准和要求-《医疗器械生物学评价细胞毒性试验体外法》之标准,选择较为常用的且与材料纳米羟基磷灰石薄膜应用条件类似的浸提介质、浸提温度和细胞培养时间,对纳米羟基磷灰石薄膜材料进行人脐静脉血管内皮细胞毒性研究,结果表明,与阴性对照组比较,阳性对照组显著抑制了细胞活力,而纳米羟基磷灰石薄膜材料对人脐静脉血管内皮细胞生长活性无显著性影响。
综上,本实验通过细胞毒性实验与评价证实,纳米羟基磷灰石薄膜材料对人脐静脉血管内皮细胞生长抑制反应级别为0至1级,毒性作用不明显,不影响人脐静脉血管内皮细胞的增殖。