三七透明质酸钠凝胶干预硬膜外瘢痕中α-平滑肌肌动蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.16.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：脊柱椎板减压后硬膜外瘢痕是导致继发性椎管狭窄的重要原因之一。研究证实局部应用三七凝胶能有效预防术后硬膜外瘢痕粘连的形成。
目的：进一步验证三七透明质酸钠凝胶在家兔硬膜外瘢痕组织中α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。
方法：大耳白品系家兔96只，随机方法分为4组，制作家兔椎板切除模型，分别在兔硬膜囊周围涂抹生理盐水、三七浓缩液、透明质酸钠、三七透明质酸钠凝胶各0.5 mL，用药后1，2，4，8周取材，采用免疫组织化学方法分析α-平滑肌肌动蛋白抗体的表达。
结果与结论：用药1，2周时，与生理盐水组比较，其他3组α-平滑肌肌动蛋白抗体表达明显降低(P < 0.01或P < 0.05)，三七透明质酸钠凝胶组与三七组、透明质酸钠组差异不显著(P > 0.05)；用药4，8周时，三七透明质酸钠凝胶组α-平滑肌肌动蛋白抗体表达明显低于其他3组(P < 0.01或P < 0.05)，三七组、透明质酸钠组与生理盐水组差异不显著(P > 0.05)。结果证实三七透明质酸钠凝胶抑制α-平滑肌肌动蛋白的表达，减轻瘢痕挛缩。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 三七透明质酸钠凝胶, 瘢痕, α-平滑肌肌动蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Epidural scar after laminectomy is one important reason for the secondary spinal stenosis, and local application of Sanqi sodium hyaluronate gel can prevent epidural scar adhesion after laminectomy.
OBJECTIVE: To study the effects of Sanqi sodium hyaluronate gel on α-smooth muscle actin expression in the process of rabbit’s epidural scar formation.
METHODS: In this study, there were ninety-six rabbits which were randomized into four groups and given 0.5 mL normal saline, 0.5 mL Sanqi concentrated solution, 0.5 mL sodium hyaluronate and 0.5 mL Sanqi sodium hyaluronate gel around the dura. At 1, 2, 4, 8 weeks after treatment, immunohistochemistry staining was employed for analysis of α-smooth muscle actin expression.
RESULTS AND CONCLUSION: At the end of weeks 1 and 2, the expression of α-smooth muscle actin antibody in the normal saline group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.01 or P < 0.05), but there were no significant differences among the Sanqi, sodium hyaluronate and Sanqi sodium hyaluronate gel groups (P > 0.05). At weeks 4 and 8, the expression of α-smooth muscle actin antibody in the Sanqi sodium hyaluronate gel group was significantly lower than that in the other three groups (P < 0.01 or P < 0.05), and there was no significant difference among the latter three groups (P > 0.05). These findings suggest that Sanqi sodium hyaluronate gel can inhibit the expression of α-smooth muscle actin, and thus ease scar contracture.

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Key words: Cicatrix, Actins, Muscle, Smooth, Hyaluronic Acid, Injections, Epidural

中图分类号:

R318

徐泉，潘钰，周卫，张兆杰，刘灿. 三七透明质酸钠凝胶干预硬膜外瘢痕中α-平滑肌肌动蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(16): 2518-2522.

Xu Quan, Pan Yu, Zhou Wei, Zhang Zhao-jie, Liu Can. Sanqi sodium hyaluronate gel inhibits alpha-smooth muscle actin expression in the epidural scar[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(16): 2518-2522.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析实验选用家兔96只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 不同时间家兔硬膜外组织α-平滑肌肌动蛋白阳性表达见表1。

1周：①三七透明质酸钠凝胶组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达明显低于生理盐水组(P < 0.01)，三七透明质酸钠凝胶组与三七组、透明质酸钠组差异不显著(P > 0.05)。②生理盐水组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达明显高于三七组、透明质酸钠组(P < 0.05)。

2周：①三七透明质酸钠凝胶组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达明显低于生理盐水组(P < 0.01)、三七组、透明质酸钠组(P < 0.05)。②生理盐水组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达明显高于三七组(P < 0.01)、透明质酸钠组(P < 0.05)。

4周：①三七透明质酸钠凝胶组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达明显低于生理盐水组(P < 0.01)、透明质酸钠组、三七组(P < 0.05)。②生理盐水组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达与透明质酸钠组、三七组差异不显著(P > 0.05)。

8周：①三七透明质酸钠凝胶组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达明显低于生理盐水组(P < 0.01)、透明质酸钠组、三七组(P < 0.05)。②生理盐水组α-平滑肌肌动蛋白阳性表达与透明质酸钠组、三七组差异不显著(P > 0.05)。

2.3 不同时间家兔硬膜外组织α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色术后1，2周，三七透明质酸钠凝胶组、三七组、透明质酸钠组α-平滑肌肌动蛋白表达明显低于生理盐水组(P < 0.01或P < 0.05)，三七透明质酸钠凝胶组与三七组、透明质酸钠组差异不显著(P > 0.05)，术后4，8周时，三七透明质酸钠凝胶组α-平滑肌肌动蛋白明显低于生理盐水组、三七组、透明质酸钠组(P < 0.01或P < 0.05)，三七组、透明质酸钠组与生理盐水组差异不显著(P > 0.05)。见图1。

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引言

目前脊柱外科常见的手术方式之一是椎板切除术，它能够解除椎管内神经根和硬膜囊的压迫，以治疗临床上一些脊柱疾病，其中有部分患者术后症状未能解除，或残存部分症状和体征，或症状曾一度缓解而后症状再次复发和加重者，临床上称腰椎手术失败综合征。国内外一些学者对椎板切除术后患者再次手术时发现，原手术部位均有瘢痕形成与硬脊膜粘连，压迫硬膜囊及神经根，认为椎板切除术后疗效欠佳的重要原因不仅是腰椎不稳，更重要的是硬脊膜外瘢痕形成。瘢痕的粘连收缩会牵拉硬膜和神经根，产生一系列症状如疼痛、麻木、肌无力等。

近年来逐渐认识到肌成纤维细胞与瘢痕挛缩关系密切^[1]。肌成纤维细胞的来源多数认为是在受局部刺激的作用下，由成纤维细胞转变而来，是成纤维细胞分化的一个特别阶段，兼有成纤维细胞和平滑肌细胞的形态学、药理学和生化特征^[2]，其结构上的特征性表现为细胞内富含微丝和大量的粗面内质网，微丝主要由肌动蛋白构成^[3]。肌成纤维细胞内的肌动蛋白有两种在形式，即单体(G)和聚合体(F)，肌动蛋白聚合是细胞产生运动的基础。肌成纤维细胞的收缩与肌动蛋白的总量无关，只与α-平滑肌肌动蛋白的含量及F/G的比值有关^[4]。实验证实，局部应用三七凝胶能有效预防术后硬膜外瘢痕粘连的形成。有研究认为硬膜外瘢痕的形成与成纤维细胞(FB)的凋亡失衡密切相关^[5]。此项研究主要是通过动物实验观察三七透明质酸钠凝胶对家兔硬膜外瘢痕中α-平滑肌肌动蛋白表达的影响，在瘢痕收缩方面进行三七透明质酸钠凝胶预防瘢痕粘连机制的探索。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2008年8月至2012年5月在中国中医科学院望京医院完成。

材料：

实验动物：大耳白品系家兔96只，一级，体质量 2.0-2.5 kg，6月龄，雌雄各半，北京市海淀兴旺动物养殖厂提供，生产批号：Scxk(京)2006-0006。

实验方法：

三七透明质酸钠凝胶配制：三七浓缩液质量浓度为 0.5 g/mL，透明质酸钠浓度为1.5%，三七透明质酸钠凝胶是在0.5 g/mL三七浓缩液中加入适量透明质酸钠，使透明质酸钠的质量浓度为0.015 g/mL。

实验分组：按完全随机法将96只动物分为生理盐水组、

三七透明质酸钠凝胶干预硬膜外瘢痕中α-平滑肌肌动蛋白的表达实验药物：
药物、试剂及仪器	来源
三七浓缩液、三七透明质酸钠凝胶	由中国中医科学院中药研究所实验室自制
三七饮片(批号：001002002)	北京市仟草中药饮片公司
透明质酸钠(注射级，批号：20051025)	曲阜市广龙生物制品厂
α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)一抗、DAB显色剂	武汉博士德生物工程有限公司
Olympus Bx51图像采集显微镜、Evolution QE图像采集软件	JAPAN

三七组、透明质酸钠组、三七透明质酸钠凝胶组，每组24只动物。

制作家兔椎板切除模型：按1 mL/kg剂量家兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，俯卧位固定，背部术区剔毛，无菌消毒后取背部正中切口，分离软组织，切除L₆左侧椎板及棘突，减压范围为5.0 mm×1.2 mm，剔除硬膜外脂肪暴露硬膜囊。清除切口内所有可见的碎骨片和失活组织，彻底止血并在硬膜囊周围涂抹生理盐水、三七浓缩液、透明质酸钠、三七透明质酸钠各0.5 mL，逐层缝合肌肉筋膜和皮肤，缝合皮肤前伤口表面点滴青霉素1 mL(16×10⁴ U/mL)。所有动物在术前、麻醉、术后的喂养、室温及其他管理条件完全一致。

取材及样本处理方法：分别于造模后1，2，4，8周耳缘静脉空气栓塞处死家兔，取L₅、L₆、L₇椎体，去除周围软组织后用生理盐水冲洗，入40 g/L多聚甲醛液中固定，盐酸甲酸脱钙液脱钙、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡中浸蜡与包埋，蜡块制成5 μm层厚切片，对1，2，4，8周的组织切片进行免疫组织化学染色。

检测α-平滑肌肌动蛋白抗体在成纤维细胞浆表达：免疫组织化学染色胞浆染成棕黄色，细胞核比较清晰，形态比较规则，轮廓比较清楚。在每个组织切片的椎板缺损区依次选取3个相邻的视野，应用图像采集软件摄片取图，IPP5.0图像分析系统进行阳性细胞累计吸光度(IA值)测定。

主要观察指标：α-平滑肌肌动蛋白抗体在成纤维细胞浆表达。

统计学分析：应用SPSS13.0统计软件分析，对各组相同时间段阳性细胞累计吸光度(IA值)定量资料进行比较，采用单因素方差分析，数据以x(_)±s表示，α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 硬膜外瘢痕组织中α-平滑肌肌动蛋白的表达伤口收缩是组织修复正常和必需的过程，但肉芽组织增生和收缩过度可导致瘢痕挛缩而造成不同程度的功能障碍^[6]。肌动蛋白、肌球蛋白及Ca²⁺形成一个细胞内的收缩系统，当外界因素持久存在时，收缩系统就会发生强烈而持久的收缩，并通过创伤部位细胞与细胞、细胞与基质以及基质之间相互编织形成的网状结构传遍整个创面，从而使整个创面的肉芽组织发生瘢痕挛缩^[7]。成纤维细胞到肌成纤维细胞，需要有α-平滑肌肌动蛋白的表达^[⁸^]。α-平滑肌肌动蛋白作为细胞骨架蛋白，是肌成纤维细胞收缩的典型标志^[⁹^]。创伤修复过程常伴随伤口收缩和瘢痕形成，肌成纤维细胞是引起伤口收缩的主要动力，α-平滑肌肌动蛋白通过跨膜复合物把肌成纤维细胞的收缩传导至整块组织，是瘢痕收缩的物质基础，决定着瘢痕的最终结局^[10]。α-平滑肌肌动蛋白数量的多少可直接反应肌成纤维细胞增殖的情况^[11]。它是肌成纤维细胞特征性蛋白，与其收缩功能存在密切关系^[12]。组织愈合过程中，肌成纤维细胞在创伤初期增殖，随着瘢痕组织的成熟逐渐溶解和消失，α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体的表达也明显降低。

3.2 三七透明质酸钠凝胶对α-平滑肌肌动蛋白的作用免疫组织化学是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。本实验免疫组织化学结果显示：术后1周、2周，三七透明质酸钠凝胶组、三七组、透明质酸钠组明显低于生理盐水组(P < 0.01或P < 0.05)，三七透明质酸钠凝胶组与三七组、透明质酸钠组差异不显著(P > 0.05)，说明此时三七透明质酸钠凝胶组、三七组、透明质酸钠组相对于生理盐水组均有一定的抑制α-平滑肌肌动蛋白的表达的作用，三七透明质酸钠凝胶组与单纯中药三七组、西药透明质酸钠组在1周、2周时能够抑制α-平滑肌肌动蛋白的表达，三者对α-平滑肌肌动蛋白的抑制作用差异不显著。术后4周、8周时，三七透明质酸钠凝胶组明显低于生理盐水组、三七组、透明质酸钠组(P < 0.01或P < 0.05)，三七组、透明质酸钠组与生理盐水组差异不显著(P > 0.05)，说明此时三七透明质酸钠凝胶组抑制α-平滑肌肌动蛋白的表达的作用显著，单纯中药三七组、西药透明质酸钠组在4周、8周时没有明显的抑制α-平滑肌肌动蛋白表达的作用。作者分析单纯中药三七组、西药透明质酸钠组仅在早期对局部瘢痕组织中α-平滑肌肌动蛋白表达的抑制作用较明显，其中晚期的效果不如三七透明质酸钠凝胶。

成纤维细胞激活转化成肌成纤维细胞，是组织纤维化的早期活动^[13]，表达α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体的肌成纤维细胞与伤口收缩和细胞外基质的产生相关，运用组织病理学对瘢痕组织内肌成纤维细胞分化的检测，能够评价瘢痕最终的结局^[14]。作者前期研究从病理形态学方面通过苏木精-伊红染色发现三七透明质酸钠凝胶能够减轻硬膜外瘢痕，MASSON染色表明三七透明质酸钠凝胶对家兔术后硬膜外瘢痕具有改善胶原纤维排列的作用，使胶原纤维的排列规整有序^[15]。

免疫组织化学的研究方法可以较为系统地观察家兔硬膜外瘢痕组织内的α-平滑肌肌动蛋白表达情况，结果显示三七透明质酸钠凝胶可以抑制α-平滑肌肌动蛋白的表达，进而抑制肌成纤维细胞增殖，起到防止瘢痕挛缩的作用。

有文献报道，转化生长因子β1的诱导作用与瘢痕组织中成纤维细胞有关^[16-18]，转化生长因子β1能诱导瘢痕成纤维细胞表达高水平的α-平滑肌肌动蛋白^[19-21]，使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并且使肌成纤维细胞的迁移速度减慢30%^[22]，增强了瘢痕组织的粘连程度^[23-25]。三七透明质酸钠凝胶对α-平滑肌肌动蛋白的作用环节，有待结合三七透明质酸钠凝胶对TGF-β1的作用机理做进一步研究，这对揭示三七透明质酸钠凝胶预防硬膜外瘢痕粘连的机制有重要的作用。

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