膝骨性关节炎软骨组织低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在骨性关节炎炎症环境下具有促进骨性关节炎发展的作用。

目的：观察膝骨性关节炎软骨组织中低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平并分析其临床意义。

方法：收集行膝关节置换的膝骨性关节炎患者32例，取其软骨组织样本作为骨性关节炎组。采用实时定量PCR和Western blot检测样本中低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA和蛋白水平；采用改良Mankin评分对骨性关节炎患者膝损伤程度进行评估，对低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA表达水平和改良Mankin评分做相关分析。选取10例同时期股骨颈骨折患者作为对照组。

结果与结论：骨性关节炎组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因及蛋白表达水平均显著高于对照组(P < 0.05)。年龄> 60岁的骨性关节炎患者低氧诱导因子1α的mRNA和蛋白水平，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因水平均显著高于≤60岁的骨性关节炎患者(P < 0.05)。继发性的骨性关节炎患者2种因子的基因和蛋白水平均显著高于原发性骨性关节炎患者(P < 0.05)。不同改良Mankin病理评分分级之间，低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因和蛋白水平差异均有显著性意义(P < 0.05)，程度越重，其表达水平越高。骨性关节炎组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA相对表达量与改良Mankin评分之间均存在正相关(r=0.83，P < 0.05；r=0.80，P < 0.05)。结果提示膝关节骨性关节炎软骨组织中低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平上调，且在多种病理参数分布上存在差异，其在膝骨性关节炎的致病机制中起了重要作用。

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 膝骨性关节炎, 低氧诱导因子1α, 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

Abstract:

BACKGROUND: Hypoxia-inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony stimulating factor can promote the development of osteoarthritis under inflammatory conditions.

OBJECTIVE: To explore the expression of hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in knee osteoarthritis cartilage tissue and to analyze its clinical significance.

METHODS: Thirty-two patients with knee osteoarthritis who underwent knee replacement were selected and cartilage tissues were obtained as knee osteoarthritis group. Another 10 patients with femoral neck fractures served as controls. mRNA and protein levels of hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the cartilage tissue were detected by real-time PCR and western blot, respectively. Modified Mankin score was used to assess knee damage in knee osteoarthritis patients. Relationship between mRNA levels of hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and modified Mankin scores were analyzed.

RESULTS AND CONCLUSION: Hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene and protein expressions were significantly higher in the knee osteoarthritis group than the control group, in knee osteoarthritis patients aged > 60 years than patients ≤ 60 years (P < 0.05), as well as higher in secondary knee osteoarthritis patients than primary osteoarthritis patients (P < 0.05). Hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor protein levels and gene levels had statistically significant differences between different pathological grades (P < 0.05); moreover, the severer osteoarthritis, the higher expression levels. Hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA expression of knee osteoarthritis patients were positively correlated with the modified Mankin scores (r=0.83, P < 0.05; r=0.80, P < 0.05). These findings indicate that hypoxia inducible factor 1α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expression levels are increased in the knee cartilage tissue of osteoarthritis patients, which display a distribution difference among a variety of pathological parameters and play an important role in the pathogenesis of knee osteoarthritis.

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Key words: Knee, Osteoarthritis, Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factorn

中图分类号:

R318

余扬，崔磊. 膝骨性关节炎软骨组织低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1683-1687.

Yu Yang, Cui Lei. Hypoxia-inducible factor 1 alpha and granulocyte-macrophage colony stimulating factor in knee osteoarthritis cartilage [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1683-1687.

图/表（结果） 2

2.1 两组患者基线资料分析 见表1。

2.2 两组软骨标本中低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平比较 两组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因及蛋白表达水平见表2和图1，可见骨性关节炎组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因及蛋白表达水平均显著高于对照组(P < 0.05)。

2.3 膝关节骨性关节炎不同病理参数与低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达 不同性别、侧别的骨性关节炎患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA和蛋白水平差异均无显著性意义(P > 0.05)。而年龄> 60岁的骨性关节炎患者其低氧诱导因子1α的mRNA和蛋白水平，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因水平显著高于≤ 60岁的骨性关节炎患者(P < 0.05)。继发性的骨性关节炎患者2种因子的基因和蛋白水平均显著高于原发性的骨性关节炎患者(P < 0.05)。病程> 5年的患者2种因子基因及蛋白水平均显著高于病程≤5年的患者(P < 0.05)。不同改良Mankin病理评分分级之间，低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因和蛋白水平差异均有显著性意义(P < 0.05)，程度越重，其表达水平越高。见表3。

2.4 骨性关节炎组低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA表达与改良Mankin评分相关性 经Pearson相关分析，骨性关节炎组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA相对表达量与改良Mankin评分之间均存在正相关(r=0.83，P < 0.05；r=0.80，P < 0.05)。以改良Mankin评分为因变量，低氧诱导因子1α mRNA相对表达量为自变量，行直线回归分析，结果显示两者的直线回归方程为：改良Mankin评分=0.09×低氧诱导因子1α+1.29，方程具有统计学意义(F=64.01，P=0.000，r²=0.681，r=0.83)，具有良好的依存关系。以改良Mankin评分为因变量，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA相对表达量为自变量，行直线回归分析，结果显示两者的直线回归方程为：改良Mankin评分=0.51×粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+1.12，方程具有显著性意义(F=52.25，P=0.000，r²=0.635，r=0.80)，具有良好的依存关系。

2.5 骨性关节炎组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达的相关性 经Pearson相关分析，骨性关节炎组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA相对表达量之间均存在正相关(r=0.79，P < 0.05)，其蛋白表达之间也存在正相关(r=0.72，P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2012年3月至2014年10月在新疆医科大学第一附属医院完成。

对象：选取2012年3月至2013年11月在新疆医科大学第一附属医院行膝关节置换的骨性关节炎患者32例，将其作为骨性关节炎组，取骨性关节炎组患者置换下的病变区软骨组织样本。另选取本院同时期10例因股骨颈骨折行人工髋关节置换的患者作为对照组，在其置换下的股骨头表面，取表面正常的软骨组织。两组患者均签署知情同意书，两组患者在年龄、性别方面差异无显著性意义。

膝骨关节炎诊断标准：①反复劳损或创伤史。②膝关节疼痛和发僵。③后期疼痛持续，关节活动明显受限，股四头肌萎缩。④膝关节屈伸活动时可扪及摩擦音。⑤膝关节正、侧位照片，显示髌骨、股骨髁、胫骨平台关节缘呈唇样骨质增生，胫骨髁间隆起变尖，关节间隙变窄。

纳入标准：①骨性关节炎并行膝关节置换者。②近6个月无服用抗炎药物、激素等。③签署知情同意书。

排除标准：①服用免疫抑制剂等。②以往有膝关节手术史。③年龄小于50岁者。④创伤性关节炎。

方法：

软骨标本处置：将骨性关节炎组患者置换取下的标本，在其关节软骨磨损最严重的区域凿取带软骨下骨的软骨块，大小为1 cm×1 cm×1 cm，置于40 g/L多聚甲醛中进行固定，然后采用EDTA脱钙液进行脱钙6周，最后经过常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋，5 μm连续切片后保存待用。另分离骨性关节炎组磨损最严重区域的软骨组织和对照组软骨组织进行基因表达及蛋白检测。

组织学染色及改良Mankin关节软骨病理评分^[4]：取切片标本，采用苏木精-伊红和番红O对切片进行染色，按照改良Mankin病理评分对关节软骨病理程度进行评分。该评分范围为0-14分，分值越大代表关节退变越严重。将其分为正常组(0-1分)、轻度退变组(2-5分)、中度退变组(6-9分)和重度退变组(10-14分)。

实时定量PCR检测mRNA水平：取软骨标本1 g，根据RNA提取说明书操作步骤逐步操作，提取软骨标本总RNA。PCR引物采用Primer 5.0引物设计软件设计并有上海吉凯生物公司合成。

反转录获得cDNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，42个循环。采用GAPDH作为内参。最后采用2^−ΔΔCt法来计算结果。

Western blot检测蛋白表达水平：根据Western blot试剂盒说明，取两组患者软骨组织标本，提取各组标本总蛋白，测定蛋白浓度。取各组总蛋白300 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳后转至PVDF膜上，然后采用5%脱脂奶粉封闭1 h。将一抗(1∶500)与膜进行浸泡孵育2 h，洗去后再用二抗(1∶2 000)孵育1 h。最后在ECL发光剂的作用下，暗室中观察显影，以GAPDH作为内参照。采用Quatity-One软件进行吸光度分析，测定条带吸光度值，取其与GAPDH条带吸光度的比值作为该蛋白的相对比表达量。

主要观察指标：①两组患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的mRNA及蛋白表达。②膝关节骨性关节炎不同病理参数的低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平。③骨性关节炎组患者2种因子的mRNA表达与改良Mankin评分的相关性。④骨性关节炎组患者2种因子表达的相关性。

统计学分析：数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，所有数据采用x(_)±s形式表示，两组比较采用t 检验，多组比较采用方差分析，检验水准为α=0.05。

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讨论

骨性关节炎被认为是慢性潜在不可逆性的关节损伤性疾病。它由众多发病因素，例如遗传倾向、退变、肥胖、外伤和全身其他疾病。这些多元化的病因在骨性关节炎的发病及发展过程中存在重叠或相互促进作用。目前的研究表明，在骨性关节炎的发展过程中，免疫系统的异常也是其发展的重要因素，众多炎症因子及炎症过程参与到骨性关节炎的发病中来^[5-8]。越来越多的研究指出细胞因子网络在其发病机制中占有重要的作用，骨性关节炎的进展程度不同，严重程度的不同也使得其细胞因子水平及网络发生不同程度的变化。细胞因子最重要的作用包括扰乱正常代谢和合成过程，尤其是需要承受高负荷的关节^[9-11]。虽然不能改变某些发病因素，例如遗传倾向，退变，外伤等，但可以改变疾病发展过程中的细胞因子网络，能够在一定程度上纠正这种被打破的平衡，延缓骨性关节炎的发展。本研究选取的低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子两种因子在骨性关节炎发展中的表达，旨在研究其在骨性关节炎发展中的作用及其病理因素联系。

HIF蛋白属于转录因子bHLH/PAS家族成员，它包括有两个亚基，即α和β。低氧诱导因子1α在所有细胞中均有不同程度的表达，它能够诱导许多组织低氧诱导基因的表达。研究表明，骨性关节炎患者关节软骨中的氧浓度显著低于健康者的关节软骨^[12-15]。骨性关节炎典型的病理特征为关节软骨骨赘形成和血管化。血管一旦侵入关节软骨可使得正常关节软骨细胞凋亡，血管化后的关节软骨可以发生钙化。研究表明，血管内皮生长因子是促进血管生成的重要因子，在低氧环境下表达增高。而血管内皮生长因子是低氧诱导因子1α的靶基因之一，低氧诱导因子1α能够促进血管内皮生长因子的表达^[16-17]。因此低氧诱导因子1α的高表达能够间接的促进关节软骨血管化，促进骨性关节炎的进展。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是一个由相对分子质量23 000的糖蛋白和四α螺旋束结构结合成的异二聚体结构。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子最初被认为是一种有效刺激粒细胞和巨噬细胞生长和分化的因子。之后的研究表明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子还能够刺激免疫细胞的成熟和增殖^[18]。骨性关节炎是一种慢性破坏性疾病，其特征则是关节的慢性炎症，关节软骨和软骨下骨的侵蚀。众多炎症细胞，例如巨噬细胞，中性粒细胞以及其释放的细胞因子在侵蚀过程中发挥作用^[19-20]。

实验结果显示骨性关节炎组患者的低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因及蛋白表达水平均显著高于对照组。这也说明膝骨性关节炎的软骨组织其炎症水平显著高于正常软骨组织。Pfander等^[21]通过免疫组织化学对骨性关节炎软骨进行染色发现，低氧诱导因子1α表达显著增高，且染色指数随着软骨破坏程度的增加而升高。也有研究表明，骨性关节炎关节软骨的破坏区域低氧诱导因子1α基因表达显著高于未破坏区域，并且低氧诱导因子1α的表达水平和破坏程度呈正相关^[22]。Nakao等^[23]的研究表明，骨性关节炎的发展过程中，有可能通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子刺激并诱导其他炎症因子和蛋白的表达，使得骨关节炎软骨破坏，骨赘形成，破骨细胞激活，侵蚀软骨下骨等。这些研究结果也和本研究结果相吻合，进一步揭示了低氧诱导因子1α参与骨性关节炎发展的病理过程^[24]。通过对骨性关节炎患者病理因素的分析发现，年龄> 60岁的骨性关节炎患者其低氧诱导因子1α的mRNA和蛋白水平，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因水平显著高于≤60岁的骨性关节炎患者。继发性的骨性关节炎患者低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因和蛋白水平均显著高于原发性的骨性关节炎患者。不同改良Mankin评分患者之间，低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因和蛋白水平均有统计学差异，并且评分越高的患者其表达水平越高，呈一定正相关。

综上所述，骨性关节炎患者关节软骨组织中低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子水平上调，这表明其与骨性关节炎患者关节软骨中的炎症反应及其激活有关，是导致关节软骨损伤的重要原因。并且低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平与改良Mankin评分之间存在显著正相关，揭示了其与骨性关节炎损伤严重程度的关系^[25]。在今后的研究中，将对低氧诱导因子1α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的调控网络做进一步的研究，为今后的骨性关节炎防治提供更多的实验和理论基础。

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