2.1  实验动物数量分析  实验选用新西兰大白兔32只，分为4组，实验过程无脱失，全体进入结果分析。

2.2  行为学观察  正常组一般情况良好，活泼好动，反应灵敏，皮毛油亮光泽，双目有神，肛周无污秽物。阳虚组及阳虚寒凝组在灌胃后出现精神萎靡，蜷缩喜卧，不喜活动，反应迟钝，皮毛枯槁无光泽，喜眯眼，无神，肛周偶有污秽；摄食、摄水量减少，体质量增长缓慢，甚至出现部分降低。

2.3  足部温度  红外热成像仪检测各组足部温度，结果表明，阳虚寒凝组与正常组、模型组对比差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4  兔血清甲状腺素T4含量  给药7 d时阳虚组、阳虚寒凝组分别与正常组、模型组对比，均P < 0.05，给药14 d时阳虚组、阳虚寒凝组分别与正常组、模型组对比，均P < 0.05；见表2。

2.5  膝关节苏木精-伊红结果  正常组镜下关节软骨结构大体正常，软骨细胞及基质轻度增生，胶原纤维排列整齐(图1A)；模型组软骨面有裂隙，软骨细胞及基质轻到中度增生，软骨细胞及基质减少，胶原纤维排列紊乱(图1B)；阳虚组软骨细胞及基质轻度增生，部分软骨辐射层查见血管组织(图1C)；阳虚寒凝组软骨面有轻微裂隙，软骨细胞及基质轻度增生，胶原纤维排列较整齐，部分软骨辐射层查见血管组织(图1D)。

2.6  膝关节Mankin评分  与正常组相比，模型组、阳虚组、阳虚寒凝组的Mankin评分均高(P < 0.05)；与模型组相比，阳虚组、阳虚寒凝组的Mankin评分虽无统计学意义，但有下降趋势；阳虚寒凝组的Mankin评分较阳虚组亦有下降趋势。结果见表3。

2.7  半月板苏木精-伊红染色结果  正常组：镜下见软骨细胞较小，成行排列于大量平行或交叉排列的纤维束之间，基质较少，呈弱嗜碱性(图2A)；模型组：软骨细胞及基质增多，软骨细胞体积增大，软骨陷窝清晰可见(图2B)；阳虚组：软骨细胞增多，基质增多(图2C)；阳虚寒凝组：软骨细胞和软骨基质增多，软骨体积增大，软骨陷窝清晰可见(图2D)。

2.8  滑膜苏木精-伊红染色结果  正常组：滑膜细胞排列整齐，由单层扁平或双层立方上皮构成(图3A)；模型组：滑膜组织少量慢性炎细胞浸润，胶原纤维增多，部分增粗伴玻璃样变性，部分滑膜组织呈绒毛-结节状增生(图3B)；阳虚组：滑膜组织少量慢性炎细胞浸润，部分组织胶原纤维增多(图3C)；阳虚寒凝组：滑膜组织少量慢性炎细胞浸润，胶原纤维增多，部分滑膜组织呈绒毛状增生(图3D)。

膝痹为现代医学的膝骨性关节炎，是一种以退行性病理改变为基础的疾患。中医理论认为素体阳虚复感风寒湿邪侵袭膝部而发为膝痹^[1]。课题组前期研究发现年龄、性别、家族史等是引起骨性关节炎的的致病因素，课题组前期的研究也表明：民族、性别、年龄、地理环境、遗传等因素与膝骨性关节炎的发病存在密切的关系^[2]。作者进一步研究发现北疆山区和牧区阳虚质人群膝骨性关节炎患病率较高，这与寒冷漫长的冬季及农牧民的防寒条件不理想存在一定的联系^[3-4]。因而寒冷刺激可能是膝骨性关节炎发病诱因之一，它破坏膝关节环境平衡，造成软骨细胞损   伤^[5]。课题组前期已成功用石膏铁丝固定法建立兔膝骨性关节炎模型制作膝痹模型^[6]，但膝痹证型的造模尚未涉及。赖鹏华等^[7]的研究表明：4 ℃的人工气候箱可以模拟出寒邪。刘欣等^[8]使用薄荷油诱导出大鼠类阳虚状态。故实验采用薄荷油灌胃联合低温气候箱尝试建立兔阳虚寒凝型膝痹模型，研究其膝关节的病理变化，进而为人类膝骨性关节炎的病理研究提供动物模型参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物观察。

1.2  时间及地点  实验于2018年11月至2019年1月在新疆医科大学完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  雄性新西兰大白兔32只，体质量(2.4±0.3)kg，购自新疆医科大学动物实验中心，生产许可证号为SYXK(新)2018-0003，自由摄食饮水，喂标准饲料(由新疆医科大学实验动物中心提供)；饲养温度：20-24 ℃，相对湿度：60%-70%。

1.3.2  实验药物与试剂  薄荷油(批号：S24778-500 mL，厂家：上海源叶生物科技有限公司)；甲状腺素(T4)试剂盒购自宝信生物有限公司；二甲苯、无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)，苏木精染液(福州迈新生物技术开发有限公司，货号CTS-1097)，伊红染液、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI-9613)。

1.3.3  实验仪器  红外线热成像仪(品牌：菲力尔，型号：ONE-PRO)，恒温箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DNP-9272)，恒温鼓风干燥箱(由上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG 型)，显微镜(Nikon生物显微镜，型号：E200)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组  新西兰大白兔适应性饲养5 d后，随机为4组，正常组、单纯模型组、阳虚组及阳虚寒凝组，每组8只。正常组常规饲养，不予处理，其余3组均予高分子绷带石膏制动法固定兔右膝关节，若观察到有肿胀或啃咬脱落，则予松解石膏或重新补打；阳虚寒凝组每日置于4 ℃的气候箱1.5 h；制动6周后，肿胀及脱落数量明显减少，膝痹造模基本稳定，此时叠加阳虚证型造模。每日操作前均用红外热成像仪检测其足部温度。

1.4.2  操作方法

(1)模型组：采用屈曲位高分子绷带结合塑料杆固定的方法^[9]，制作膝骨关机炎模型，8周后去除高分子绷带^[10]。具体步骤如下：取树脂高分子绷带长宽约6 cm×4 cm和  12 cm×3 cm的各2块，分别为abcd。将其置于90 ℃的水中使其变软，夹出绷带a在膝关节上1 cm至腹股沟处包绕一圈；绷带c在膝关节下1 cm处包饶胫骨一圈。待ac粘连牢固后，用绷带b将塑料杆的一头固定于绷带a的表面，另一头用绷带d与绷带c粘合。塑料杆与股骨的夹角约75°。

(2)阳虚组：制动6周后叠加以下操作。每日于北京时间11：00-12：00予以薄荷油灌胃连续2周。薄荷油剂量根据刘欣等^[8]的研究，经动物体表面积换算，选取剂量   0.65 mL/(kg·d)。灌胃选用8Fr一次性导尿管，每兔一管，灌胃时，先用木质开口器迫使其口张开，固定头部后，另一名操作者将导尿管紧贴兔上颚部缓缓向下送入，待到兔鼻翼煽动并呼吸音明显后，将导尿管的另一头浸入水中，若产生连续气泡，则提示管子进入肺中，需取出后更换导尿管重新灌胃，直到无气泡或无连续气泡产生，则提示管子进入胃中。连接装有薄荷油的注射器与导尿管，将薄荷油打入胃中，迅速拔出导尿管，观察兔子状态若无异常，则进行下一只。

(3)阳虚寒凝组：将兔统一放入大鼠盒中，每盒2只，内铺敷料。设置气候箱4 ℃，无照明，湿度50%。待气候箱达到设定值后，放入实验动物，1.5 h后取出。制动6周后叠加阳虚组操作。

1.4.3  标本检测

(1)大体观察：观察兔的整体状态，如精神活动、毛发情况等；每周测量体质量变化。

(2)足部温度变化：所有兔子每日操作前均用红外线热成像仪检测各组足部温度变化。

(3)ELISA检测血中促甲状腺素变化：灌胃操作7，14 d后，采集耳缘静脉血，离心后取上清液，标号，ELISA法检测血清中T4含量。

(4)制作病理切片：膝痹造模达到56 d后，麻醉后处死全部兔子，取膝关节软骨、半月板、滑膜制作病理切片观察。将组织切片置于65 ℃恒温箱中烘烤1.5-2 h后，用二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。经梯度乙醇、二甲苯脱水、透明，石蜡包埋切片，分别用苏木精-伊红染色。制作病理切片，其中膝关节按Mankin评分。

1.5  主要观察指标  ①兔行为学观察和体质量；②足部温度；③甲状腺素T4水平；④膝关节、半月板及滑膜苏木精-伊红染色结果；⑤膝关节Mankin评分。

1.6  统计学分析  使用SPSS 20.0软件分析统计结果。符合正态分布、方差齐的计量资料，两组间比较采用独立样本t 检验，组内比较采用配对t 检验。用x(_)±s表示；符合正态性但不符合方差齐性者，用t＇检验；若正态性和方差齐性均不符合者，则用秩和检验。计数资料采取卡方检验，用率表示；等级资料采取秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  薄荷油诱导甲减型阳虚模型

3.1.1  薄荷的相关药理作用  薄荷在中国有悠久的药食两用历史，薄荷其化学成分丰富，主要含有挥发油、黄酮类、蒽醌类、有机酸类、氨基酸、微量元素等^[12]，根据以往的报道，薄荷具有保肝利胆、兴奋人中枢神经以及抗炎镇痛、抗病毒、促进透皮吸收等作用^[11，13]，目前研究已明确薄荷油是薄荷发挥功效和产生毒性的主要物质基础。薄荷为一种辛凉解表药物^[14]，其性寒凉，其性辛、凉，芳香走窜，力能透筋骨，外达肌表，宣通脏腑，贯串经络; 多服久服，耗散真气，令人虚冷。

3.1.2  薄荷油诱导阳虚模型的认识  在阳虚的动物模型中，现在多采用中医症候模型或西医病理模型，西医病理模型多采用激素负反馈、药物毒副作用、手术损伤等手段来影响动物。在模拟临床阳虚病理状态中，运用氢化可的松诱导阳虚模型是目前较为公认的方法^[15-16]，但可的松一类的糖皮质激素因其强大的抗炎作用，能迅速抑制炎性反应，对关节炎症进行有效控制^[17-19]，因此应用激素造模，会对骨关节炎模型的结果产生影响^[20]。

中医理论认为造成阳虚的因素分为禀赋不足、饮食偏嗜、情劳过度3个方面。寒凉药易伤阳气，阳虚则寒，温热药易伤阴助火，内热由生。因此，可以利用饮食、药物的性味因素对动物进行干预造成类似阳虚状态动物模型^[21-22]，薄荷油具有味辛、性凉，给药体积小，长期给予大鼠灌服大剂量薄荷油，可使机体功能抑制，下丘脑-垂体-靶腺轴功能存在不同环节不同程度紊乱等特点^[23-24]，可以使动物造成寒的症状，与其他方法诱导的阳虚状态基本吻合^[25-26]，因此薄荷油在一定程度上可以诱导甲减性阳虚模型^[27]。

3.2  阳虚寒凝型骨关节炎的模型  该研究所制作的模型对关节进行渐进性破坏的主要因素是机械制动直接刺激兔膝关节，薄荷油诱导阳虚及气候箱寒冷环境破坏膝关节生理环境。

根据以往的报道，寒冷环境对骨关节的可能机制有：①正常软骨及滑膜细胞的平衡环境遭到破坏^[28]，细胞发生溶解、凋亡，代谢产物增加，从而导致炎性因子如白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α及趋化因子释放增加，造成关节疼痛、肿胀，大量基金金属蛋白酶随之产生，基金金属蛋白酶与其特异性组织抑制剂平衡失调，进而破坏软骨细胞及其基质；②冷刺激可减缓末梢血液循环，使软骨细胞缺氧，无氧呼吸增多，局部内环境pH值下降，加剧骨紊乱及骨增生^[29-31]。

在骨关节炎的建模方面，作者在石膏铁丝固定法建立兔膝痹模型法的基础上进行改良^[11]。 3.3  实验结果分析  作者通过体表面积给药计算，选取剂量为0.65 mL/(kg·d)的薄荷油对兔进行灌胃造模，在症候学上阳虚组、阳虚寒凝组两组均出现精神萎靡、反应迟钝、毛发枯槁无光泽等状态，符合阳虚症候标准；与正常组、模型组相比较，在7 d时，薄荷油诱导下阳虚组、阳虚寒凝组T4明显下降；给药14 d时，阳虚组、阳虚寒凝组较模型组明显降低，这与以往的研究结果较一致^[8]，但与7 d时相比较无统计学意义。红外成像方面，阳虚寒凝组与正常组、模型组对比均明显降低。足温下降考虑与久病多虚多瘀，血流缓慢导致局部皮肤温度降低有关，研究表明，在阳虚状态时，头面与四肢为其评价温度敏感区位^[32]，这与反映阳虚状态特点的结果较一致。膝痹组、阳虚组及阳虚寒凝组三组均有明显的骨关节炎病理改变， Mankin评分也符合骨关节炎表现。综上所述，以改良石膏固定法制动、薄荷油灌胃诱导甲减性阳虚状态结合气候箱制造低温环境所获得的复合模型较为符合阳虚型骨关节炎状态，在一定程度上模拟了疾病状态，可以为阳虚寒凝型骨关节炎模型建立提供一定的参考。

3.4  实验中影响因素分析

3.4.1  氧化应激反应与薄荷的抗氧化活性  氧化应激是体内氧化与抗氧化平衡被打破，导致吞噬细胞聚集，蛋白酶分泌增加，产生大量自由基。国内外研究的现状表明，氧化应激反应也可能直接导致软骨细胞损伤，参与骨性关节炎病情的变化，氧化应激可能诱导软骨细胞端粒不稳定和软骨细胞正常功能的下调，同时可能影响软骨细胞胶原代谢，最终骨性关节炎晚期患者自身抗氧化应激能力的进一步降低^[33-34]，形成恶性环形发展。

薄荷中含有的黄酮类物质、多酚类、迷迭香酸具有一定的抗氧化性，近几年一些学者已对薄荷挥发油提取物能有效清除 1，1-二苯基地-2-三硝基苯肼(DPPH)等自由基的相关报道^[35-36]，表明了薄荷油的抗氧化活性，这在一定浓度上消除自由基，保护生物膜结构和功能^[37]。

此次研究发现，阳虚组与阳虚寒凝组的组织形态学结果介于膝痹组与正常组之间，按照传统医学理论，当机体长时间服用寒凉药，或长期处于寒凉状态时，会导致阴阳平衡失调，出现类阳虚状态，从这种理论角度分析，阳虚状态会促进骨关节炎的进展，但阳虚组与阳虚寒凝组较膝痹组出现了一定的好转。这其中氧化应激反应与薄荷的抗氧化活性可能存在着一定的联系，此外也考虑可能与薄荷油的抗炎镇痛作用相关^[38-39]。

3.4.2  其他因素  在对阳虚组及阳虚寒凝组进行薄荷油灌胃中，操作造成的不适会产生挣扎，在一定程度上增加了活动度。

3.5  研究待完善之处  在造模剂量方面、造模前期动物对造模剂受纳较强，后期则有可能会产生一定的耐受性，动物体质量的增加在一方面也增加了耐受的风险，在这一动态变化下，应当考虑适当加量。造模时间方面，理论上寒胜必伤阳，寒邪势必演化成寒凝，久寒也必逐渐演化成虚证，阳虚寒凝组因造模时间、造模强度不足，寒证阶段有可能达不到。这些因素对造模有重要意义，这也为薄荷油叠加气候箱诱导兔阳虚寒凝型膝痹模型的后续研究提供了依据。

最后，在此次实验结果中薄荷油对阳虚组、阳虚寒凝组存在一定影响，虚证、寒证的深度和稳定性仍有进一步改进的余地，因此探寻薄荷油不同计量与模型状态的关系，以及进一步探索兔毛的减少及寒冷环境对寒凝证形成的影响。这些都是需要通过实验检验并回答，由此才能确定并优化出最佳的复合模型建模方案。要实现动物模型的规范化、可重复性，需要进一步在中医理论的指导下，运用现代化技术建立完善的造模方法和评价体系^[40]，由此才能确定并优化出最佳的复合模型建模方案。

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文题释义：

薄荷油：薄荷为一种辛凉解表药物，其性寒凉，芳香走窜，力能透筋骨，多服久服，令人虚冷。具有兴奋中枢神经以及抗炎镇痛、抗病毒等作用，而薄荷油是薄荷发挥功效和产生毒性的主要物质基础。有研究表明大剂量薄荷油在一定程度上能够诱导类阳虚状态。

阳虚寒凝型：阳气有温暖肢体及脏腑的作用。阳气不足，失去温煦推动，代谢活动下降，其表现为畏寒肢冷、面色苍白、大便溏薄、小便清长、脉沉微无力等。寒为阴邪，性凝滞而收缩，易伤阳气，寒凝则表现为痉挛疼痛、腰膝冷痛喜温。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

薄荷油具有味辛、性凉，给药体积小，长期给予大鼠灌服大剂量薄荷油，可使机体功能抑制，下丘脑-垂体-靶腺轴功能存在不同环节不同程度紊乱等特点，可以使动物造成寒的症状，与其他方法诱导的阳虚状态基本吻合，因此薄荷油在一定程度上可以诱导甲减性阳虚模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程