独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞细胞色素C及pro-Caspase-9、3的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究表明细胞凋亡是关节软骨细胞的中心性特征，对软骨破坏起着支配性的作用，是关节软骨退行性改变的病理因素之一。

目的：观察独活寄生汤含药血清对大鼠退变软骨细胞释放细胞色素C、proCaspase-9和proCaspase-3的影响，探讨独活寄生汤治疗骨性关节炎的可能分子生物学机制。

方法：建立体外退变软骨细胞模型，分别给予独活寄生汤含药血清或空白血清干预24，48 h，收集软骨细胞，Western Blot法检测干预后退变软骨细胞细胞色素C、proCaspase-9和proCaspase-3蛋白表达。

结果与结论：随着干预时间的延长，在胞浆中空白血清组和含药血清组细胞色素C蛋白释放均逐渐降低，含药血清组释放较空白血清组明显减少(P < 0.05)；线粒体中空白血清组和含药血清组细胞色素C蛋白外漏均逐渐降低，含药血清组外漏较空白血清组明显减少(P < 0.05)。空白血清组和含药血清组proCaspase-9、proCaspase-3蛋白量均逐渐升高，含药血清组升高更显著，且24 h组与48 h组之间差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示独活寄生汤可以通过减少细胞色素C的释放，减少Caspase-9、Caspase-3的前体裂解，推测能有效抑制软骨细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 独活寄生汤, 膝骨性关节炎, 细胞色素 c, proCaspase-9, proCaspase-3, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that apoptosis, a central feature of articular chondrocytes, plays a dominant role in cartilage damage, which is one of the pathological factors of articular cartilage degeneration.
OBJECTIVE: To observe the effects of meditcated serum containing Duhuojisheng Decoction on the expression of cytochrome C, proCaspase-9 and proCaspase-3 in rat degenerative chondrocytes in vitro and to investigate the possible molecular biological mechanism of Duhuojisheng Decoction in the treatment of knee osteoarthritis.
METHODS: A cultivation system of degenerative chondrocytes in vitro was established. After treatment with meditcated serum containing Duhuojisheng Decoction or blank serum for 24 and 48 hours, the protein expression of cytochrome C, proCaspase-9 and proCaspase-3 was measured by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: In the cytoplasm, the release of cytochrome C was reduced gradually in both groups in a time-dependent manner, and the release amount of cytochrome C was significantly lower in the medicated serum group than the blank serum group (P < 0.05). In mitochondria, cytochrome C leakage was gradually decreased in both groups, and it was decreased significantly in the medicated serum group compared with the blank serum group (P < 0.05). The protein expression of proCaspase-9 and proCaspase-3 was gradually increased in both groups, especially in the medicated serum group; the medicated serum containing Duhuojisheng Decoction could promote the protein expression of proCaspase-9 and proCaspase-3 in a time-dependent manner, and there was a significant difference at 24 and 48 hours (P < 0.01). These findings indicate that the medicated serum containing Duhuojisheng Decoction can inhibit the apoptosis of osteoarthritis chondrocytes through inhibiting the release of cytochrome C and the activation of Caspase-9 and Caspase-3.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Knee Joint, Drugs, Chinese Herbal, Cytochromes c

中图分类号:

R318

王武炼，林煜，张怡元，肖莉莉，冯尔宥. 独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞细胞色素C及pro-Caspase-9、3的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5269-5273.

Wang Wu-lian, Lin Yu, Zhang Yi-yuan, Xiao Li-li, Feng Er-you. Effects of medicated serum containing Duhuojisheng Decoction on the expression of cytochrome C, proCaspase-9 and proCaspase-3 in degenerative chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5269-5273.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：空白对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年10月2至014年4月在福建中医药大学中西医结合研究院和福建中医药大学实验动物中心完成。

材料：

独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞细胞色素C、pro-Caspase-9、pro-Caspase-3的影响实验主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清	GIBCO公司
DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶	Hyclone公司
Penicillin-Streptomycin，PBS细胞色素C、pro-Caspase-9、pro-Caspase-3、β-actin、抗兔、抗鼠二抗	美国Cell Signaling Technology公司
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE电泳液、上样缓冲液(5X)、Western转膜液、封闭液、PVDF膜、Western-抗稀释液、超敏ECL化学发光试剂盒	上海碧云天生物技术有限公司
二氧化碳培养箱	Thermo公司
荧光倒置相差显微镜	徕卡仪器公司
蛋白核酸分析仪	美国Beckman Coulter公司
化学发光成像系统ChemiDocXRS+	Bio-Rad公司

动物：健康2月龄清洁级SD大鼠30只用于制备含药血清，健康4周龄清洁级SD大鼠10只用于分离软骨细胞，雌雄不限，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXK(沪)2007-0011。医学实验动物环境设施为福建中医药大学实验动物中心鼠类实验动物环境设施，清洁级(合格证号：医动学23-016号)。

药物：独活寄生汤由独活9 g，桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、细辛、川芎、当归、芍药、干地黄、人参、茯苓、甘草各6 g组成，由福建省福州市第二医院药剂科提供。

实验方法：

独活寄生汤含药血清的制备：健康2月龄清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，随机分为独活寄生汤组(含药血清组，15只)和生理盐水对照组(空白血清组，15只)。根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算^[10]，含药血清组给予9.3 g/(kg•d)的独活寄生汤的量，空白血清组给予 10 mL/(kg•d)的生理盐水的量，参照前期研究^[11]，连续灌胃7 d，最后1 d连续2次灌胃，中间间隔2 h，采血前禁食 12 h，灌胃2 h后，腹主动脉采血、离心，吸取上层血清，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20 ℃冰箱保存备用。

退变软骨细胞模型的建立及干预：采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法从4周龄清洁级SD大鼠关节软骨中分离获得软骨细胞^[12]，培养至第3代软骨细胞；再予10 μg/L白细胞介素1β诱导，获得退变软骨细胞^[13-14]；给予空白血清和含药血清处理，干预24，48 h后，进行指标检测。

alamarBlue法筛选最佳干预浓度：取第3代软骨细胞以1×10⁶ L^-1细胞浓度接种至96孔板中，并加入含1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%的独活寄生汤含药血清或空白血清的培养基培养72 h，每个浓度设6个孔。在结束培养前4 h，每孔加入alamarBlue 20 μL，酶标仪测定各孔在570 nm和630 nm波长下的吸光度，并按以下公式计算结果：

alamarBlue还原率(%)=(样品570 nm吸光度-培养液空白570 nm吸光度)-(样品630 nm吸光度-培养液空白 630 nm吸光度)×R0；

R0=(10% alamar-Blue培养液570 nm吸光度-培养液空白570 nm吸光度)/(10% alamarBlue培养液630 nm吸光度-培养液空白630 nm吸光度)。

alamarBlue还原率越高，表明增殖细胞越多。根据还原率绘制出各组细胞的生长曲线，并筛选含药血清最佳浓度，用于干预。

Western Blot法检测血清干预后胞浆、线粒体中细胞色素C和胞浆中proCaspase-9、proCaspase-3 蛋白表达：血清干预结束后，提取软骨细胞中胞浆和线粒体蛋白^[15]。行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，按常规方法电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，细胞色素C、proCaspase-9、proCaspase-3单克隆抗体(1︰500)缓慢摇动，4 ℃过夜，洗涤后HRP标记二抗(1︰2 000)；β-actin作为内参照。根据ECL化学发光试剂盒说明书，取1.5 mL EP管，按A液︰B液=1︰1，充分混匀(避光，现配现用)。滴到膜的蛋白面，室温下放置1 min。凝胶成像仪下显影、拍照。运用凝胶图像分析软件，分析各目的蛋白相对表达量并计算其与内参的比值。

主要观察指标：大鼠退变软骨细胞增殖活性、细胞色素C、proCaspase-9和proCaspase-3表达。

统计学分析：实验数据采用SPSS 13.0版统计软件进行分析、处理，结果用x(_)±s表示。两组间比较采用t 检验；多组数据之间比较使用单因素方差分析；P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨性关节炎多见于中老年人，发病率随年龄增加而增加，在影响女性健康的疾病“排行榜”中列居第4位，而在影响男性健康的疾病中列居第8位^[16-17]。骨性关节炎属于“痿证”、“痹症”、“骨痹”范畴，基于骨性关节炎以关节软骨退变为核心、骨赘形成为特征的病理特点，作者认为骨性关节炎的病机为本虚标实、本痿标痹，治则为扶正祛邪、标本兼顾，扶正以补肾柔肝、强筋壮骨为主，祛邪以祛风除湿、行气活血为主。独活寄生汤(唐代•孙思邈《备急千金要方》)由独活9 g，桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、细辛、川芎、当归、芍药、干地黄、人参、茯苓、甘草各6 g组成。方中独活长于祛下焦风寒湿邪，蠲痹止痛，为君药。秦艽、防风祛风胜湿；肉桂温里祛寒，通利血脉；细辛祛寒止痛，均为臣药。桑寄生、牛膝、杜仲、芍药补益肝肾，强壮筋骨；当归、川芎、干地黄养血活血；人参、茯苓、甘草补气健脾，扶助正气，均为佐药。甘草调和诸药，为使药。诸药合用，祛邪扶正，标本兼顾，达到祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效^[18-19]，能针对骨性关节炎的病机起治疗作用^[20-21]。 “线粒体凋亡途径”是脊椎动物最常见的凋亡通路。白细胞介素1β诱导软骨细胞复制软骨细胞退变模型，是目前较为经典的退变软骨细胞造模方法^[22-23]。本研究在前期研究的基础上^[11]，选用白细胞介素1β做诱导剂，并参照相关文献^[24]，选取10 μg/L作为白细胞介素1β的诱导浓度，干预第3代软骨细胞。Bcl-2蛋白家族是调节线粒体凋亡途径的关键因子，包括以Bcl-2为代表的抗凋亡成员和以Bax为代表的促凋亡成员^[25-26]。在凋亡因子刺激下，活化的促凋亡

蛋白Bax可通过Bax蛋白移位、构象改变和寡聚化，插入线粒体外膜、增高线粒体外膜的通透性，释放细胞色素C(Cytochrome c，Cyt-C)等促凋亡因子，释放到胞浆的细胞色素C能与凋亡激活因子Apaf-1以及caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡复合体^[27-29]。caspase-9前体在凋亡复合体中被剪切形成有活性的caspase-9；活化的caspase-9可激活caspase-3、caspase-6和caspase-7等成员，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡的发生。本结果表明：独活寄生汤能减少线粒体细胞色素C的漏出，减少 Caspase-9、Caspase-3前体裂解，进而抑制细胞凋亡。因此作者认为独活寄生汤可能通过减少线粒体内细胞色素C的漏出，进而抑制Caspase依赖的细胞凋亡通路而发挥软骨细胞保护作用，起到治疗骨性关节炎的作用，但其确切作用机制还有待进一步深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程