内热针干预膝骨性关节炎兔软骨下骨Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3159

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (17): 2636-2642.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3159

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内热针干预膝骨性关节炎兔软骨下骨Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白的表达

朱仕强1，许建峰1，2，黑晓燕1，陈耘东1，田心保1，张金晨3，林瑞珠1，3

1宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学总医院，2中医骨伤科，3康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2020-07-31 修回日期:2020-08-07 接受日期:2020-09-15 出版日期:2021-06-18 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 林瑞珠，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，宁夏医科大学总医院康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:朱仕强，男，1993年生，湖北省十堰市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，初级治疗师，主要从事肌肉骨骼疾患康复研究。
基金资助:
国家自然科学地区基金(81860893)，项目负责人：林瑞珠

Effect of internal heat-type acupuncture needle therapy on the expression of type I collagen, matrix metalloproteinase-3 and osteopontin in the subchondral bone of rabbit knee osteoarthritis model

Zhu Shiqiang1, Xu Jianfeng1, 2, Hei Xiaoyan1, Chen Yundong1, Tian Xinbao1, Zhang Jinchen3, Lin Ruizhu1, 3

1Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Department of Traditional Chinese Medicine for Orthopedics, 3Department of Rehabilitation Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2020-07-31 Revised:2020-08-07 Accepted:2020-09-15 Online:2021-06-18 Published:2021-01-07
Contact: Lin Ruizhu, MD, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Department of Rehabilitation Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Zhu Shiqiang, Master candidate, Primary therapist, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Regional Project), No. 81860893 (to LRZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
内热针疗法：是在温针灸疗法的基础上结合现代工艺改良升级，兼具针刺效应和热效应的物理治疗方法。以人体软组织外科学为基础，在病变组织部位做密集型针刺，使内热针体的温度可以传导到病变部位和周围组织结构，从而缓解痉挛肌肉肌张力，减轻组织局部无菌性炎症，促进血管再生，改善微循环，促进肌肉修复，营养周围神经，以达到治疗疾病的目的。
软骨下骨：是位于关节软骨下方的骨组织，由软骨下皮质终板和松质骨层(内含骨小梁、血管、感觉神经及内皮细胞)组成，不仅能为覆盖其上的关节软骨提供营养支持和新陈代谢的微环境，而且具有吸收、减震等生物力学功能以维持正常关节的形态结构，在骨关节炎的发生、发展中发挥重要作用。

背景：内热针疗法是在温针灸疗法基础上，经过现代工艺改良升级的物理治疗方法，兼具针刺效应和热效应，在临床上治疗膝骨性关节炎疗效显著，但对其具体机作用制缺乏了解。
目的：探讨内热针作用于兔膝骨性关节炎，对软骨下骨中Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白表达的影响及其可能的作用机制。
方法：30只无特定病原体的新西兰兔采用随机数字表法，分为空白组、模型组和治疗组，每组各10只。模型组和治疗组采用经典Hulth方法选取兔左后肢膝关节进行兔膝骨性关节炎造模。治疗组选取兔左后肢膝关节进行内热针疗法干预，每周1次，每次20 min；空白组和模型组不给予任何治疗。干预4周进行实验兔左后膝关节取材，使用改良版Lequesne MG量表对各组实验兔干预前后进行行为学评价；采用甲苯胺蓝染色观察各组实验兔膝关节软骨下骨组织形态学变化；分别采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测3组软骨下骨中Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白的蛋白及mRNA表达。动物实验方案通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准(批准号：2018064)。
结果与结论：①与空白组相比，模型组和治疗组兔的行为学评分显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，治疗组兔的行为学评分显著降低(P < 0.05)，且干预前后差值更大(P < 0.05)；②与空白组相比，模型组软骨下骨的骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁数目明显降低(P < 0.05)，骨小梁弥散度明显升高(P < 0.05)；Ⅰ型胶原蛋白及其mRNA表达水平显著降低(P < 0.001)，基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白的蛋白及其mRNA表达水平显著升高(P < 0.001)；与模型组相比，治疗组软骨下骨的骨小梁面积百分数，骨小梁数目明显升高(P < 0.05)，骨小梁弥散度明显降低(P < 0.05)；Ⅰ型胶原蛋白及其mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白的蛋白及其mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)；③Ⅰ型胶原水平变化与骨小梁面积百分数、骨小梁数目呈正相关关系，与骨小梁弥散度呈负相关关系；骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白/基质金属蛋白酶3比值变化与骨小梁面积百分数、骨小梁数目呈负相关关系，与骨小梁弥散度呈正相关关系；④结果说明，内热针疗法可能通过上调Ⅰ型胶原表达和下调基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白表达，实现软骨下骨微结构修复。
https://orcid.org/0000-0001-6352-9313 (朱仕强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 内热针, 膝骨性关节炎, 软骨下骨, 骨代谢, 骨重塑

Abstract: BACKGROUND: Internal heat-type acupuncture needle therapy is an updated physical therapy method based on warm-needle moxibustion therapy with a dual effect of acupuncture and thermal therapy. It has significant clinical effect in the treatment of knee osteoarthritis, but there is no full understanding of its specific mechanism.
OBJECTIVE: To explore the effect of internal heat-type acupuncture needle on the expression of type I collagen, matrix metalloproteinases-3, and osteopontin in the subchondral bone of a rabbit knee osteoarthritis model as well as the possible mechanism of action.
METHODS: A total of 30 New Zealand rabbits (specific-pathogen-free level) were divided into a blank group, a model group and a treatment group by a random digital table, with 10 rabbits in each group. A model of knee osteoarthritis was made in the left hind leg of the rabbit by Hulth’s method. The treatment group was given internal heat-type acupuncture needle on the left hind limb knee joint, once a week, for 20 minutes once. The blank group and the model group received no intervention. Knee joint sampling was performed after behavioral evaluation using the modified Lequesne MG scale after 4 weeks of intervention. Toluidine blue staining was used to observe the morphological changes of subchondral bone tissue of rabbits in each group. Western blot and real-time quantitative PCR were used to detect the expressions of type I collagen, matrix metalloproteinases-3, and osteopontin protein and mRNA in the subchondral bone of the rabbits. The animal experiment protocol was approved by the Medical Research Ethics Review Committee of the General Hospital of Ningxia Medical University (approval No. 2018064).
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group, behavioral scores were significantly increased in the model group and treatment group (P < 0.05). Compared with the model group, behavioral scores were significantly decreased in the treatment group (P < 0.05), and the difference between the two groups was significantly enlarged after intervention (P < 0.05). Compared with the blank group, the percentage of subchondral bone trabecular area, trabecular thickness and trabecular number were significantly decreased in the model group (P < 0.05), while trabecular spacing was significantly increased (P < 0.05). Compared with the blank group, the protein and mRNA expression levels of type I collagen were significantly decreased in the model group (P < 0.001), while the protein and mRNA expression levels of matrix metalloproteinases-3 and osteopontin were significantly increased (P < 0.001). Compared with the model group, the percentage of trabecular area and trabecular number were significantly increased in the treatment group (P < 0.05), while trabecular spacing was significantly decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the protein and mRNA expression levels of type I collagen were significantly increased in the treatment group (P < 0.05), while the protein and mRNA expression levels of matrix metalloproteinases-3 and osteopontin were significantly decreased (P < 0.05). Moreover, the change of type I collagen level was positively correlated with the percentage of trabecular area and the trabecular number, but negatively correlated with trabecular spacing. The changes of osteopontin, matrix metalloproteinases-3 and their ratio were negatively correlated with the percentage of trabecular area and trabecular number, and positively correlated with trabecular spacing. To conclude, internal heat-type acupuncture needle may restore subchondral bone microstructure through up-regulating type I collagen expression and down-regulating matrix metalloproteinases-3 and osteopontin expression.

Key words: internal heat-type acupuncture needle, knee osteoarthritis, subchondral bone, bone metabolism, bone remodeling

中图分类号:

朱仕强, 许建峰, 黑晓燕, 陈耘东, 田心保, 张金晨, 林瑞珠. 内热针干预膝骨性关节炎兔软骨下骨Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2636-2642.

Zhu Shiqiang, Xu Jianfeng, Hei Xiaoyan, Chen Yundong, Tian Xinbao, Zhang Jinchen, Lin Ruizhu. Effect of internal heat-type acupuncture needle therapy on the expression of type I collagen, matrix metalloproteinase-3 and osteopontin in the subchondral bone of rabbit knee osteoarthritis model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(17): 2636-2642.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验所选用30只新西兰兔，随机分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 各组实验兔干预前后行为学Lequesne MG评分比较干预前与空白组相比，模型组和治疗组行为学评分变化差异有显著性意义(P < 0.05)；模型组和治疗组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，说明兔膝骨性关节炎造模较成功。干预后与模型组相比，治疗组行为学评分显著降低(P < 0.05)，且干预前后行为学评分变化差值更大(P < 0.05)。见表2。

2.3 各组骨组织形态观察和计量学结果比较在骨组织甲苯胺蓝染色中，软骨呈现深蓝色，软骨下骨为淡蓝色。通过甲苯胺蓝染色片可观察到，干预前与空白组相比，模型组软骨下骨存在骨小梁变细、断裂、连续性中断、排列疏松等改变；干预后与模型组相比，治疗组软骨下骨的骨小梁形态学明显改善。软骨下骨形态学计数比较：干预前与空白组相比，模型组软骨下骨骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁数目明显降低，骨小梁弥散度明显升高(P < 0.05)；干预后与模型组相比，治疗组软骨下骨骨小梁面积百分数、骨小梁数目明显升高，骨小梁弥散度明显降低(P < 0.05)，骨小梁厚度变化差异无显著性意义。见图1，表3。

2.4 各组Westem blot检测结果比较结果显示：干预前与空白组相比，模型组软骨下骨中Ⅰ型胶原蛋白表达明显降低(P < 0.001)，软骨下骨中基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白蛋白表达明显升高(P < 0.001)；干预后与模型比相比，治疗组软骨下骨中Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白的蛋白表达明显降低(P < 0.05)，差异均有显著性意义。见图2，3。

2.5 各组qRT-PCR检测结果比较干预前与空白组相比，模型组的软骨下骨中Ⅰ型胶原mRNA表达明显降低(P < 0.001)，基质金属蛋白酶3 mRNA、骨桥蛋白mRNA表达明显升高(P < 0.001)；干预后与模型比相比，治疗组的软骨下骨中Ⅰ型胶原mRNA表达明显升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3 mRNA、骨桥蛋白mRNA表达明显降低(P < 0.05)。见图4。

2.6 软骨下骨中代谢因子与骨形态学计数相关分析 Ⅰ型胶原含量变化与骨小梁面积百分数、骨小梁数目呈正相关关系(P < 0.05，P < 0.001)，与骨小梁弥散度呈负相关关系 (P < 0.05)；骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白/基质金属蛋白酶3比值变化与骨小梁面积百分数呈负相关关系(P < 0.001，P < 0.001，P < 0.05)，与骨小梁数目呈负相关关系(P < 0.001，P < 0.001，P < 0.05)，与骨小梁弥散度呈正相关关系(P < 0.05，P < 0.001，P < 0.001)。见表4。

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引言

膝骨性关节炎是软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨在力学和生物学因素共同作用下合成和降解代谢偶联失衡的结果，是最常见的关节退行性疾病之一[1]。研究发现，在膝骨性关节炎的进展初期，软骨下骨的骨代谢转换水平异常增高，可高达正常代谢水平的20倍[2]，骨重塑异常，软骨下骨结构和生物力学性能发生改变，在骨关节炎疾病的发生发展中起重要作用[3]。因此，从调控软骨下骨异常骨代谢和骨重塑方面来介导软骨下骨修复治疗膝骨性关节炎成为研究热点[4]。
骨修复是骨形成的过程，包括骨基质的形成和骨矿化两个阶段，进而维持骨质正常的结构和力学性能[5]。在骨基质的有机质中，Ⅰ型胶原蛋白含量最高，并且在骨组织钙矿化过程中发挥支架作用[6]。Ⅰ型胶原蛋白水平和结构的变化会影响骨骼的强度和韧性[7]。基质金属蛋白酶3，也称为基质溶素1，在骨重建过程中，它会降解骨细胞外基质中胶原和非胶原成分来启动骨重塑[8]。骨桥蛋白可在骨基质的吸收、形成和矿化过程中作为一种基质调节蛋白，在骨重塑过程中发挥重要作用[9]。同时，基质金属蛋白酶3与骨桥蛋白结合并激活前体基质金属蛋白酶3，形成骨桥蛋白-基质金属蛋白酶3复合物以执行各种功能，参与Ⅰ型胶原骨代谢过程，影响骨组织矿化，参与软骨下骨的代谢和重塑[10]。
近年来，研究发现，温针灸和电针可以调控Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3表达，达到治疗膝骨性关节炎目的[11-13]。内热针是一种将针刺疗法和热疗结合起来的物理治疗方法，兼具其他针刺疗法的优点和疗效，治疗深度可达骨膜，对膝骨性关节炎有很好的临床治疗效果[14]。但是，目前对内热针治疗膝骨性关节炎的具体机制缺乏了解。因此，为探究内热治疗膝骨性关节炎的作用和机制，此次研究预通过建立兔膝骨性关节炎模型，观察内热针对膝骨性关节炎兔的治疗效果并探究其与调控软骨下骨中Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3表达影响和骨修复机制的相关性，为膝骨性关节炎的临床治疗提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2019年9月至2020年6月在宁夏医科大学基础医学院厚生楼实验平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组 30只6月龄无特定病原体的SPF级新西兰兔，雌雄不限，体质量(2.5±0.5) kg，购自西安交通大学医学院动物实验中心。动物实验方案通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准(批准号：2018064)。实验动物单只分笼饲养，动物房温度设定为(23±3) ℃，保持相对湿度(60±5)%，水和食物充足供应。适应性饲养7 d后，采用随机数字表法，将实验兔分为空白组、模型组和治疗组各10只，后2组制备兔膝骨性关节炎模型。动物实验中所有程序严格遵守伦理道德标准。
1.3.2 主要试剂和仪器 Ⅰ型胶原抗兔多克隆抗体(abcam公司，美国)；基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白抗兔多克隆抗体(Epigentek公司，美国)；二抗山羊抗兔(abcam公司，美国)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(Sigma公司，美国)；甲苯胺蓝染色剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司，中国)；PBS、3%苯巴比妥钠溶液、40 g/L多聚甲醛液(银川市伟博鑫生物科技有限公司，中国)；内热针(外径为1.3 mm，针总长10 cm，针体长6.5 cm，针柄长3.5 cm，针柄直径2.2 mm)和内热针治疗仪(济宁佳科医疗科技有限公司，中国)；RM2235型石蜡切片机(Leica公司，德国)；BX51型显微镜(Olympus公司，日本)；凝胶成像系统 (ABI，美国)；QPCR仪器(Bio-Rad公司，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验模型建立实验膝骨性关节炎模型制作采用Hulth法[15]。模型组和治疗组实验兔，适应性喂养7 d后开始造模。手术麻醉选用3%苯巴比妥钠溶液(1 mL/kg)行耳缘静脉注射，待麻醉状态稳定，将实验兔仰卧后拉直左后肢膝关节并固定，逐步进行脱毛、备皮、消毒、铺巾等术前准备。以膝关节内侧入路切开皮肤和皮下各层，暴露关节腔，探查排除有无原发病灶情况下，离断前交叉韧带并摘除内侧半月板。抽屉实验检查阳性后清创缝合，敷贴包扎。
为避免手术感染连续7 d局部注射青霉素钠20万U/只，术后单笼饲养，自由活动。造模成功后次日进行行为学评价。术后1周，每天笼内驱赶活动30 min，于4周后可制备稳定兔膝骨性关节炎模型。

1.4.2 内热针治疗方法术后4周后进行治疗干预。固定好治疗组实验兔，进针部位选髌上正中点与肢体纵轴的垂直线两侧各定位1点，共计2点；膑下正中定1点；内外膝眼各1点，共计5点。温度设定为42 ℃，治疗时间20 min，每周1次。空白组和模型组实验兔不采取任何治疗干预。于干预4周后次日进行行为学评价并处死各组实验兔进行取材。

1.4.3 软骨下骨取材麻醉后，取10 mL注射器抽取5 mL空气从兔耳缘静脉迅速匀力注入处死各组实验兔，将实验兔固定于操作台。暴露左膝关节腔，咬骨钳截取胫骨干骺端，清除附着组织，PBS清洗干净后，一部分切成约0.5 cm³大小组织块，40 g/L多聚甲醛液固定2 d，10%EDTA脱钙液2周，常规脱水石蜡包埋、切片，制备石蜡切片，用于甲苯胺蓝染色。一部分于置于封存管内，-80 ℃冷藏，供后续实验使用。
1.4.4 行为学评价行为学观察：使用改良版Lequesne MG量表[16]，在造模结束后次日和末次内热针干预后次日评估干预前后各组实验兔行为学变化，包含局部按压患膝观察疼痛刺激反应程度(0分：无异常疼痛反应；1分：患肢出现收缩；2分：患肢收缩伴轻度全身反应；3分：患肢剧烈收缩伴全身颤抖挣扎)、驱赶观察步态(0分：患肢无跛行，蹬地有力；1分：轻度跛行，蹬地有力；2：患肢参与行走，跛行明显；3分：患肢不参与步行，不能蹬地)、关节活动范围(0分：> 90°；1分：45°-90°；2分：15°-<45°；3分：<15°)、关节肿胀情况(0分：无肿胀；1分：轻度肿胀；2分：明显肿胀)4个部分，合计分数越高病变越严重。
1.4.5 软骨下骨甲苯胺蓝染色和形态计量学分析脱钙石蜡切片常规至水后，入甲苯胺蓝染色液30 min，转入冰醋酸进行分化。流水下冲洗，清除残留染液，二甲苯透明，中性树脂封固。在光学显微镜40X下获取图片，使用Image-Pro plus 6.0软件进行软骨下骨形态学计数，每张图片取3个视野，计算其平均值。测定参数如下[17]：骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量 (Tb.N)、骨小梁弥散度(Tb.Sp)。
1.4.6 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测用全蛋白提取试剂盒提取经过去除软骨组织块的样本总蛋白，BCA法进行蛋白浓度测定。取20 μg的蛋白样本加入4 μL 5×SDS振荡混匀，100 ℃变性5 min。SDS-PAGE凝胶电泳，小心剥胶选用PVDF膜进行转膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白和GAPDH的一抗，4 ℃孵育过夜，再加入二抗孵育2 h。ECL发光液中的A液和B液按照1∶1比例配置，暗室内压片、曝光、显影、定影，凝胶成像仪采图。借助Quantity One 软件分析，再用Image-Pro plus 6.0软件分析相对灰度值。
1.4.7 qRT-PCR检测取-80 ℃保存的组织块用微动力磨钻清除软骨组织后液氮下研磨，Trizol方法从软骨下骨样本提取Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白全RNA，然后将mRNA反转录成cDNA并保存在-20 ℃，GAPDH被选为内参对照物。引物设计由上海生工代为设计以及合成，见表1。反应条件为：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循环40次。每个样本设 3 个复孔，根据各组 Ct 值计算2-ΔΔCt值。

1.5 主要观察指标 ①各组实验兔的行为学变化；②Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行骨组织形态学计量；③Western blot检测Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白在软骨下骨中蛋白表达水平；④qRT-PCR检测软骨下骨Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白的mRNA表达。

1.6 统计学分析数据资料采用SPSS 26.0软件进行分析，计量资料用x±s表示。实验数据在统计前先进行正态性和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析；对符合正态分布的数据进行Pearson直线相关分析。以P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.001为差异有非常显著性意义。

讨论

膝骨性关节炎是一种慢性退行性关节疾病，是老年人关节疼痛和残疾的主要原因，主要表现为关节软骨退化和软骨下骨异常重建。骨关节炎主要有两种类型：原发性膝骨性关节炎和继发性膝骨性关节炎，分别与衰老和创伤有关；其中软骨下骨起着至关重要的作用。无论软骨下骨改变是在软骨损伤之前还是在疾病发展过程中出现，软骨下骨目前被认为是膝骨性关节炎治疗的关键靶点。有学者通过腔内药物注射诱导法进行鼠膝关节腔内注射Ⅱ型胶原酶和手术诱导法切断鼠前交叉韧带模拟原发性膝骨性关节炎和继发性膝骨性关节炎模型，发现手术诱导法制备的继发性膝骨性关节炎模型软骨损伤继发于软骨下骨改变[18]。此次实验为了探究内热针介导软骨下骨治疗早期膝骨性关节炎的机制，希望所选用的膝骨性关节炎病理模型在膝骨性关节炎病理进展初期即出现软骨下骨改变，故实验采用手术诱导法中的Hulth法制备膝关节力学不稳的膝骨性关节炎模型。
在骨关节炎软骨下骨病理改变初期，骨吸收活跃，软骨下骨厚度降低，软骨下骨结构发生骨质疏松样改变且密度降低，结构和生物力学的改变进而刺激骨形成代偿性活跃。在异常骨吸收和骨形成的高转换率的背景下，软骨下骨骨量虽然增加，但是单位体积骨密度降低，造成新生骨组织矿化不完全[19]。因此，骨关节炎中软骨下骨结构和功能改变是以高转化率下的骨重塑异常为背景，所以有效控制软骨下骨代谢速度，可以调控异常骨重塑，使软骨下骨有充分的时间矿化，完成骨组织的结构和功能修复过程。
目前调控软骨下骨异常骨重塑以药物疗法为主，主要包括雌激素、降钙素、阿仑膦酸盐和双膦酸盐等，但通常伴有的不良反应、治疗周期长和经济成本过高限制了其应用；而内热针作为一种新的非药物疗法，是温针灸的改良升级版，兼具针刺和热疗作用，治疗范围深而广，温度恒定可控，不良反应率低，近期和远期效果显著，成本经济，在临床上得到广泛认可和推广，且在临床实验和基础实验显示内热针的疗效均优于温针灸。刘巧媚等[20]通过比较内热针和温针灸对膝关节髌下脂肪垫损伤的临床疗效，显示内热针组总有效率为92.5%，对照组的总有效率为75.0%，内热针治疗效果明显优于传统温针灸治疗。高谦等[21]通过传统银质针与内热针对大鼠骨骼肌作用的实验研究发现，内热针在深部组织加热上优于传统银质针。王刚等[22]通过探究不同针刺法对大鼠腓肠肌砸伤后微循环血流灌注的影响发现，内热针和温针灸均能恢复损伤部位微循环障碍，但内热针治疗组的微循环恢复平均值较温针灸组平均值高。杨志丽等[23]发现内热针和银质针均能提高损伤骨骼肌组织中超氧化物歧化酶活性和降低丙二醛含量，进而增强组织抗氧化能力，且内热针治疗效果优于银质针。张文玉等[24]发现内热针和传统银质针均能提高大鼠损伤骨骼肌和腓肠神经组织中血管内皮生长因子和内源性碱性成纤维细胞生长因子活性进而促进组织修复，其治疗效果优于小针刀组和射频组，而内热针治疗效果优于传统银质针的原因可能是内源热稳定性高。现代研究还发现，内热针可以降低肌张力，促进病变部位局部血流量增加，有利于组织营养供应和炎性、致痛物质排除，增强细胞活性，促进组织再生[25]。内热针疗法作为2014年国家中医药管理局通过的新技术推广项目，在治疗膝骨性关节炎方面有其独特优势，但是对其作用机制的认识还较缺乏。已有学者研究发现内热针疗法可以通过抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶3和9表达来抑制软骨细胞凋亡，达到改善膝骨性关节炎组织病理的目的[26]。所以此次实验在上述研究基础上进一步探讨采用内热针疗法介导软骨下骨治疗膝骨性关节炎的可能机制。此次研究中，治疗组干预过程中出现的不良反应有皮下血肿(1/10)、红肿(3/10)、出血(4/10)，不需要特殊处理可自行缓解。经过内热针治疗干预后，治疗组行为学评分显著降低，说明内热针对兔膝骨性关节炎治疗效果明显；且模型组在治疗干预前，骨小梁存在连续性中断和粗细不等的改变，在经过内热针治疗干预后，与模型组相比，治疗组的骨小梁相对骨面积，小梁数目和小梁弥散度有所改善，表明内热针在促进软骨下骨结构修复过程中有积极作用。
Ⅰ型胶原是骨重塑的主要原料，是骨组织合成与分解代谢的重要指标。在正常骨组织的有机物质中，Ⅰ型胶原含量约占90%以上，Ⅰ型胶原构成的网状结构在经钙盐矿化后能够提供强有力的支撑作用，其含量的改变影响骨的微结构与力学性能[27]。在骨关节炎中，与Ⅰ型胶原代谢相关的信号通路包括组织蛋白酶 K 信号通路、TGF-β/Sma和Smad信号通路、TGF-β/BMP信号通路、c-Jun 氨基末端激酶JNK信号通路、Wnt/β-Catenin信号通路等[28]。研究发现温针灸可能通过调控血清和组织中上述信号通路代谢因子的表达，达到改善膝骨性关节炎临床症状的目的[29-31]。该研究结果显示，模型组治疗干预前Ⅰ型胶原含量明显低于空白组，治疗组在经过内热针治疗干预后，Ⅰ型胶原含量与模型组相比明显升高，且Ⅰ型胶原含量变化与骨小梁面积百分数、骨小梁数目呈正相关关系，与骨小梁弥散度呈负相关关系。推测Ⅰ型胶原含量及结构的变化引起矿化作用减弱，骨小梁稀松，骨质疏松微观改变，微结构在关节负重状态下塌陷，最终导致膝骨性关节炎软骨下骨结构的改变。而治疗组在内热针的作用下，可能通过调控上述信号通路促进关节软骨下骨基质中Ⅰ型胶原的合成，进而影响软骨下骨微结构修复和重塑过程，未来需要进一步研究。
基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白属于炎性因子，参与软骨下骨重塑过程[32]。基质金属蛋白酶3属于金属蛋白酶家族，不仅参与胶原和非胶原成分降解过程，还能激活其他基质金属蛋白酶前体，从而影响骨吸收和骨形成，在膝骨性关节炎的发生和发展中发挥作用[33]。骨桥蛋白属于非胶原性骨基质糖蛋白，在人体广泛分布，在骨组织中可由成骨细胞及破骨细胞等分泌。骨桥蛋白在膝骨性关节炎患者软骨下骨中的表达与疾病的严重程度呈正相关，可为疾病的进展和预后做参考[34]。在骨关节炎病理过程中，骨桥蛋白既可以促进成骨细胞及破骨细胞黏附和骨质钙化，又可以增强破骨细胞活性，抑制骨基质矿化，同时骨桥蛋白可介导核因子kB抑制因子(IkB)信号转导途径上调基质金属蛋白酶3活性，促进其表达[35]。骨桥蛋白与基质金属蛋白酶3具有高度亲和性，骨桥蛋白通过整合素结合三肽与基质金属蛋白酶3形成SIBLINGMMPS复合体。在膝骨性关节炎软骨下骨重建过程中，骨桥蛋白-基质金属蛋白酶3复合体参与调控蛋白水解过程，既可以维持成骨细胞旺盛的代谢状态，促进骨形成，又可以激活破骨细胞，启动骨吸收，使骨转化率迅速升高，影响骨组织局部微环境，改变骨基质；但是骨转化率异常升高可造成新生骨组织矿化不全、骨组织结构和生物力学发生改变[36]。通过抑制膝骨性关节炎中骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白-基质金属蛋白酶3复合体的表达，可以有效降低异常骨转化速率，改善骨组织结构。研究显示，温针灸可以降低血清和关节滑液中骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3的水平，达到改善膝骨性关节炎临床症状目的[13，37]。此次研究中，模型组软骨下骨中骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白/基质金属蛋白酶3比值高于空白组，与其他学者研究结果相似[38-39]；而治疗组经过内热针干预后软骨下骨骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白-基质金属蛋白酶3复合体表达明显降低，且与骨小梁面积百分数、骨小梁数目呈负相关关系，与骨小梁弥散度呈正相关关系。推测内热针疗法可能通过降低软骨下骨骨桥蛋白、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白-基质金属蛋白酶3复合体的表达，进而降低异常骨代谢速度，促进软骨下骨重建，改善软骨下骨结构，未来将从骨代谢和骨重建指标角度进行进一步探索。
综上所述，内热针能有效改善软骨下骨微结构，可能通过上调Ⅰ型胶原表达和下调基质金属蛋白酶3、骨桥蛋白表达，介导异常骨代谢和骨重建实现软骨下骨修复，进而改善软骨下骨结构和功能，达到防治膝骨性关节炎的目的，由于软骨下骨异常骨代谢和骨重建是软骨下骨合成与分解代谢耦联失衡的结果，未来将从合成与分解代谢两方面指标观察代谢平衡，进行进一步研究和论证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

内热针干预膝骨性关节炎兔软骨下骨Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白的表达

Effect of internal heat-type acupuncture needle therapy on the expression of type I collagen, matrix metalloproteinase-3 and osteopontin in the subchondral bone of rabbit knee osteoarthritis model

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