心肌干细胞移植心肌梗死区12周后的心电生理稳定性及室颤阈值改善效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.008

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1516-1522.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.008

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心肌干细胞移植心肌梗死区12周后的心电生理稳定性及室颤阈值改善效应

陈立朋¹，晏平²，郭天柱³，侯婧瑛³，郑韶欣³，周长青³，龙会宝³，钟婷婷³，王彤³

¹广东省中山市西区医院，广东省中山市 528400；²广州医科大学附属第一医院急诊科，广东省广州市 510120；³中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 王彤，博士，博士生导师，教授，主任医师，研究员，中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120
作者简介:陈立朋，男，1976年生，广东省梅州市人，汉族，2000年汕头大学医学院毕业，副主任医师，主要从事心肺复苏研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81270213)“ANGⅡ/AT1/SMAD/CX43通路在心肌干细胞提高心梗大鼠心电生理学稳定性和室颤阈值的作用机制研究”；国家自然科学基金(81070125)“抗凋亡与促血管生成miRNA-378干预MSCs治疗心梗后心衰的机制研究”；广东省科技计划项目(2010B031600032)“抗凋亡与促血管生成miRNA-378干预MSCs治疗心梗后心衰的机制研究”；高校基本科研业务费中山大学青年教师重点培育项目(13ykzd16) “PPAR-γ/TGF-β1/Smad/CX43通路在PPAR-γ干预MSCs治疗心梗后心衰的疗效及机制研究”

Long-term effects of cardiac stem cells transplantation to improve the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold after myocardial infarction

Chen Li-peng¹, Yan Ping², Guo Tian-zhu³, Hou Jing-ying³, Zheng Shao-xin³, Zhou Chang-qing³,Long Hui-bao³, Zhong Ting-ting³, Wang Tong³

¹Western Area Hospital, Zhongshan 528400, Guangdong Province, China; ²Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; ³Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Wang Tong, M.D., Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Researcher, Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Chen Li-peng, Associate chief physician, Western Area Hospital, Zhongshan 528400, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070125, 81270213; the Scientific and Technological Plan of Guangdong Province, No. 2010B031600032; the Fundamental Research Funds for Universities-Key Cultivation Project of Young Teachers in Sun Yat-sen University, No. 13ykzd16

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期研究证实心肌干细胞治疗心肌梗死后短中期(6周)能明显改善心电生理学稳定性和室颤阈值。

目的：观察心肌干细胞对心力衰竭大鼠室颤阈值和心电生理稳定性的长期影响。

方法：开胸结扎20只SD大鼠左前降支冠状动脉，2周后其中10只大鼠局部梗死心肌内注射PKH26荧光标记的由PBS悬浮的心肌干细胞，另10只大鼠局部梗死心肌内注射等量PBS。治疗12周后，再次开胸检测梗死区、梗死边缘区和非梗死区的心电生理特性和室颤阈值。实验结束后，摘取心脏行病理切片，检查PHK26标记的心肌干细胞是否在梗死区内生存并表达连接蛋白43及α-肌动蛋白。

结果与结论：与对照组相比，心肌干细胞移植12周后其梗死区、梗死边缘区和非梗死区的单极电图激动恢复时间、纠正的激动恢复时间差异无显著性意义(P > 0.05)；单极电图纠正的激动恢复时间离散度、电刺激所激发的恶性心律失常差异无显著性意义(P > 0.05)；室颤阈值方面，实验组梗死区和梗死边缘区与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，非梗死区与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。PHK26标记的心肌干细胞在梗死边缘区内被发现并表达连接蛋白43和α-肌动蛋白。以上结果提示心肌干细胞移植后12周其心电生理的稳定性和室颤阈值的改善效应已逐渐消失，但机制未明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 心肌干细胞, 心律失常, 心电生理学特性, 室颤阈值, 心肌梗死, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Our previous work has demonstrated that the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold were distinctly improved in rats with myocardial infarction 6 weeks after cardiac stem cells transplantation (short- to mid-term).

OBJECTIVE: To observe the long-term effects of cardiac stem cells transplantation on the ventricular fibrillation threshold and electrophysiological stability in rats with heart failure post myocardial infarction.

METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats with myocardial infarction were induced by the left anterior descending coronary artery ligation. Two weeks later, animals were randomized to receive the injection of cardiac stem cells labeled with PKH26 in PBS or PBS alone into the local infarct zone. Twelve weeks after the cardiac stem cells or PBS injection, the electrophysiological characteristics and ventricular fibrillation threshold were measured at the infarct zone, the infarct marginal zone and the non-infarct zone. Labeled cardiac stem cells were detected and the expression of connexin-43 and α-sarcomeric actin was examined in cryostat sections from each harvested heart.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the PBS group, no significant differences were revealed in the unipolar electrogram activation recovery time and the correct activation recovery time in the infarct zone, the infarct marginal zone and the non-infarct zone in the cardiac stem cells group at 12 weeks post the cell transplantation (P > 0.05). There were no remarkable differences in the correct activation recovery time dispersion and induced malignant ventricular arrhythmias between the two groups (P > 0.05). No obvious differences were discovered in the ventricular fibrillation threshold in the infarct zone and infarct marginal zone in the cardiac stem cells group in contrast to the PBS group (P > 0.05), though a statistical significance could be found in the non-infarct zone between the two groups (P < 0.05). Labeled cardiac stem cells were identified in the infarct marginal zone and expressed connexin-43 and α-sarcomeric actin. It suggested that the beneficial effects of cardiac stem cells in modulating the electrophysiological stability and improving the ventricular fibrillation threshold faded away 12 weeks after cell transplantation. However, the mechanisms involved remained unclear.

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Key words: Myocytes, Cardiac, Heart Failure, Cardiac Electrophysiology, Ventricular Fibrillation

中图分类号:

R394.2

陈立朋，晏平，郭天柱，侯婧瑛，郑韶欣，周长青，龙会宝，钟婷婷，王彤. 心肌干细胞移植心肌梗死区12周后的心电生理稳定性及室颤阈值改善效应[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1516-1522.

Chen Li-peng, Yan Ping, Guo Tian-zhu, Hou Jing-ying, Zheng Shao-xin, Zhou Chang-qing,Long Hui-bao, Zhong Ting-ting, Wang Tong. Long-term effects of cardiac stem cells transplantation to improve the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold after myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1516-1522.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析纳入20只大鼠，分成2组，每组10只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 单极电图纠正的激动恢复时间测定结果移植心肌干细胞治疗12周后，采集心外膜单极电图方面数据，结果显示：与对照组相比，实验组在梗死区、梗死边缘区和非梗死区的激动恢复时间以及经心率校正后的纠正激动恢复时间差异均无显著性意义(P > 0.05)，仅有下降趋势 (图1，2)。

2.3 单极电图纠正的激动恢复时间离散度测定结果实验组和对照组全心脏纠正的激动恢复时间离散度比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；与对照组相比，实验组纠正的激动恢复时间离散度仅有下降趋势(图3)。

2.4 恶性心律失常的诱发结果对照组在对梗死区、梗死边缘区、非梗死区总共50次的程序电刺激中诱发出22次恶性心律失常，实验组在对梗死区、梗死边缘区、非梗死区总共57次的程序电刺激中诱发出21次恶性心律失常，两组对比差异均无显著性意义(P > 0.05)；与对照组比较，实验组的恶性心律失常诱发率有下降趋势(图4)。

2.5 室颤阈值测定结果实验组与对照组在梗死区、梗死边缘区和非梗死区的室颤阈值对比，梗死区和梗死边缘区差异无显著性意义(P > 0.05)，与对照组比较，实验组在梗死区和梗死边缘区的室颤阈值仅有升高趋势；而在非梗死区，实验组的室颤阈值明显高于对照组(P < 0.05)，见图5。

2.6 组织免疫荧光检测结果经PKH26染色后，超过90%的心肌干细胞被染色。激光共聚焦显微镜检测，实验组大鼠心肌梗死边缘区可见红色PKH26标记的心肌干细胞、绿色荧光标记的缝隙连接蛋白43及α-肌动蛋白存在，且心肌干细胞分别与缝隙连接蛋白43及α-肌动蛋白定位重叠(图6)。

参考文献

[1]Labarthe DR, Dunbar SB. Global cardiovascular health promotion and disease prevention: 2011 and beyond. Circulation. 2012;125(21):2667-2676.
[2]Bolli R, Chugh AR, D'Amario D, et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 2011;378 (9806):1847-1857.
[3]Donndorf P, Strauer BE, Haverich A, et al. Stem cell therapy for the treatment of acute myocardial infarction and chronic ischemic heart disease.Curr Pharm Biotechnol. 2013;14(1): 12-19.
[4]Pavo N, Charwat S, Nyolczas N, et al. Cell therapy for human ischemic heart diseases: critical review and summary of the clinical experiences. J Mol Cell Cardiol. 2014;75:12-24.
[5]Taylor J. Boosting acute myocardial infarction treatment with stem cells. Eur Heart J. 2014;35(16):1015-1016.
[6]Menasché P. Stem cell therapy for heart failure: are arrhythmias a real safety concern. Circulation. 2009;119(20): 2735-2740.
[7]Lalit PA, Hei DJ, Raval AN, et al. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circ Res. 2014;114(8):1328- 1345.
[8]Marbán E, Cho HC, Cingolani E. Taking the cells out of cell therapy. J Am Coll Cardiol. 2012;60(17):1707-1708.
[9]Narita T, Shintani Y, Ikebe C, et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. Int J Cardiol. 2013;168(1):261-269.
[10]Li GR, Deng XL, Sun H, et al. Ion channels in mesenchymal stem cells from rat bone marrow. Stem Cells. 2006; 24(6): 1519-1528.
[11]Askar SF, Ramkisoensing AA, Atsma DE, et al. Engraftment patterns of human adult mesenchymal stem cells expose electrotonic and paracrine proarrhythmic mechanisms in myocardial cell cultures. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2013; 6(2):380-391.
[12]Hare JM, Fishman JE, Gerstenblith G, et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow–derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 2012;308(22):2369-2379.
[13]Liao SY, Liu Y, Siu CW, et al. Proarrhythmic risk of embryonic stem cell-derived cardiomyocyte transplantation in infarcted myocardium. Heart Rhythm. 2010;7(12):1852-1859.
[14]Chong JJ, Yang X, Don CW, et al. Human embryonic-stem- cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 2014;510(7504):273-277.
[15]van den Heuvel NH, van Veen TA, Lim B, et al. Lessons from the heart: mirroring electrophysiological characteristics during cardiac development to in vitro differentiation of stem cell derived cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 2014;67:12-25.
[16]Keung W, Boheler KR, Li RA. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 2014;5(1):17.
[17]Ye J, Yeghiazarians Y. Cardiac stem cell therapy: review of the native cardiac progenitor cells and future direction. J Cardiovasc Pharmacol. 2014;63(2):85-94.
[18]Hou J, Wang L, Jiang J, et al. Cardiac stem cells and their roles in myocardial infarction. Stem Cell Rev. 2013;9(3): 326-338.
[19]Wang T, Tang W, Sun S, et al. Improved outcomes of cardiopulmonary resuscitation in rats with myocardial infarction treated with allogenic bone marrow mesenchymal stem cells. Crit Care Med. 2009;37(3):833-839.
[20]Wang T, Sun S, Wan Z, et al. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells in a rat model of myocardial infarction. Resuscitation. 2012;83(11):1391-1396.
[21]王彤,郑韶欣,周长青,等.心肌干细胞移植可改进心力衰竭大鼠室颤阈值和电生理的稳定性[J].中国组织工程研究和临床康复, 2011,15(36): 6753-6756.
[22]Zheng S, Zhou C, Weng Y, et al. Improvements of cardiac electrophysiologic stability and ventricular fibrillation threshold in rats with myocardial infarction treated with cardiac stem cells. Crit Care Med. 2011;39(5):1082-1088.
[23]Xia Y, Kongstad O, Hertervig E, et al. Activation recovery time measurements in evaluation of global sequence and dispersion of ventricular repolarization. J Electrocardiol. 2005; 38(1):28-35.
[24]Western D, Hanson B, Taggart P. Measurement bias in activation-recovery intervals from unipolar electrograms. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2015;308(4):H331-H338.
[25]Wang H, Tang W, Ristagno G, et al. The potential mechanisms of reduced incidence of ventricular fibrillation as the presenting rhythm in sudden cardiac arrest. Crit Care Med. 2009;37(1):26-31.
[26]Hsiao LC, Carr C, Chang KC, et al. Stem cell-based therapy for ischemic heart disease. Cell Transplant. 2013;22(4): 663-675.
[27]Poon E, Kong CW, Li RA. Human pluripotent stem cell-based approaches for myocardial repair: from the electrophysiological perspective. Mol Pharm. 2011;8(5): 1495-1504.
[28]Garbern JC, Lee RT. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 2013; 12(6):689-698.
[29]Simpson DL, Mishra R, Sharma S, et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. 2012;126(11 Suppl 1):S46-53.
[30]Ellison GM, Vicinanza C, Smith AJ, et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 2013;154(4):827-842.
[31]El Haddad M, Houben R, Stroobandt R, et al. Novel algorithmic methods in mapping of atrial and ventricular tachycardia. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2014;7(3):463-472.
[32]Trevisi N, Silberbauer J, Radinovic A, et al. New diagnostic criteria for identifying left-sided ventricular ectopy using non-contact mapping and virtual unipolar electrogram analysis. Europace. 2015;17(1):108-116.
[33]Chugh AR, Beache GM, Loughran JH, et al. Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy: the SCIPIO trial: surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance. Circulation. 2012;126(11 Suppl 1):S54-64.
[34]Fontes MS, van Veen TA, de Bakker JM, et al. Functional consequences of abnormal Cx43 expression in the heart. Biochim Biophys Acta. 2012;1818(8):2020-2029.
[35]Wu W, Li Y, Lu Z, et al. Increased susceptibility to ischemia-induced ventricular tachyarrhythmias in depressed rats: Involvement of reduction of connexin 43. Exp Ther Med. 2012;3(2):192-194.
[36]Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD, et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(21): 12313-12318.
[37]Bolli R, Tang XL, Sanganalmath SK, et al. Intracoronary delivery of autologous cardiac stem cells improves cardiac function in a porcine model of chronic ischemic cardiomyopathy. Circulation. 2013;128(2):122-131.
[38]Amsalem Y, Mardor Y, Feinberg MS, et al. Iron-oxide labeling and outcome of transplanted mesenchymal stem cells in the infarcted myocardium. Circulation. 2007;116(11 Suppl): I38-45.
[39]Hong KU, Guo Y, Li QH, et al. c-kit+ Cardiac stem cells alleviate post-myocardial infarction left ventricular dysfunction despite poor engraftment and negligible retention in the recipient heart. PLoS One. 2014;9(5):e96725.
[40]Gullo C, de Almeida Zia VA, Vilela-Martin JF. Blockade of renin angiotensin system in heart failure post-myocardial infarction: what is the best therapy. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2014;9(1):28-37.
[41]von Lueder TG, Wang BH, Kompa AR, et al. Angiotensin receptor neprilysin inhibitor LCZ696 attenuates cardiac remodeling and dysfunction after myocardial infarction by reducing cardiac fibrosis and hypertrophy. Circ Heart Fail. 2015;8(1):71-78.

引言

心肌梗死导致死亡的原因主要是心力衰竭和恶性室性心律失常。目前采取药物、介入和器械等综合手段治疗心肌梗死的死亡率仍较高^[1]，需要寻找新的治疗方法。细胞治疗尤其是干细胞治疗被认为是十分有前景的治疗方法。现阶段用于治疗心血管疾病的干细胞种类有：骨髓间质干细胞、胚胎干细胞、成肌细胞、诱导多能干细胞和心肌干细胞等。大量动物实验及临床试验均已证实^[2-5]，干细胞移植治疗能明显改善心肌梗死后心功能。然而，细胞治疗心血管疾病在带来益处的同时，也带给人们很大的困惑和担忧。干细胞移植后的安全问题，尤其是致心律失常问题引起了学者们的关注^[6-7]。植入心肌的成肌细胞能保持兴奋性并对局部刺激产生动作电位，但不能与宿主心肌细胞形成有效电耦联，有明显致心律失常的危险^[8-9]；骨髓间充质干细胞与宿主心肌细胞在电生理上存在明显的差异，对恶性室性心律失常诱发率无明显改善作用^[10-12]；胚胎干细胞^[13-14]、诱导多能干细胞所分化而来的心肌均表现出不成熟的结构、电生理及代谢等特征^[15-16]，有致恶性心律失常危险性。而目前关于心肌干细胞移植治疗心肌梗死后心电生理方面的深入研究甚少。

心肌干细胞来源于心肌组织，体内外都能够分化为心肌细胞，分化后表现出类似成熟心室肌细胞电生理特性。因此，心肌干细胞被认为是移植治疗心肌梗死的最具治疗潜力的干细胞种类^[17-18]。课题组的前期研究对心肌干细胞移植治疗心肌梗死的疗效及潜在致心律失常的风险进行了初步的探索，发现短中期内心肌干细胞移植治疗不仅能明显改善大鼠心肌梗死后心功能，还能显著提高心肌梗死后心电生理学稳定性和室颤阈值，且优于骨髓间充质干细胞。本研究是上述实验的延续和深入，试图观察心肌干细胞移植治疗对心肌梗死后心电生理稳定性及室颤阈值的长期影响，以进一步评估其安全性和致心律失常的危险性，为临床推广心肌干细胞移植治疗心肌梗死提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年1月至2013年6月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

材料：

实验动物：出生后3 d的雄性SD大鼠10只；6月龄健康雄性SD大鼠20只，体质量(250±25) g，清洁级，均由中山大学动物实验中心提供，动物许可证号：0067926，动物实验设施许可证号：0050040。按随机数字表法分为2组，每组10只，心肌干细胞移植治疗组(实验组)，PBS处理组(对照组)。

实验方法：

大鼠心肌梗死模型的制备：SD大鼠在造模前晚禁食，但可自由进水。造模当天按45 mg/kg给予腹腔内注射喷妥巴比妥麻醉，将手术部位的毛剃干净，用14 G的穿刺针套管作为气管导管插入，用线固定于嘴部皮肤，防止脱出。调整呼吸机至工作状态，潮气量为6.5 mL/kg，呼吸频率为100次/min，FiO₂=0.21。从左侧第4肋间打开胸腔，暴露心脏。用镊子撕开心包膜，清楚暴露左前降支冠状动脉。用带5-0细尼龙丝线的小圆针缝扎左前降支冠状动脉。关胸前放入一细塑料软管，便于关胸后吸取气体和渗出的血液。左前降支冠状动脉缝扎成功的标记是肢体心电图ST段明显抬高，QRS波宽大畸形。关胸后继续机械通气并严密观察EKG和CO₂波形1 h，如有心室颤动发生，立即用手指胸外按压或使用2 J的电能量电击除颤，直到心电图转复为窦性心率为止。1 h后停止机械通气，拔除引流管，按160 mg/kg肌肉内注射抗生素头孢唑啉及止痛药Ketorolac 0.4 mg/kg。动物苏醒后拔除气管导管，放回笼内继续喂养。详见作者课题组以往报道^[19-20]。

心肌干细胞的的分离、培养、传代和标记：取出生后第3天的新生鼠，断颈后置于体积分数75%的乙醇内消毒约30 s，在无菌条件下取整个心脏置于直径为3.5 cm 培养皿中剪成大约1 mm³的小块状心肌组织，用不含钙磷的PBS冲洗心肌组织碎块至液体澄清。然后加入0.25%胰酶2 mL消化5 min后吸出消化液，加入0.1%Ⅱ型胶原酶2 mL(用不含钙KHB液配制：NaCl 110 mmol/L，KCl 2.6 mmol/L，MgSO₄ 1.2 mmol/L，KH₂PO₄ 1.2 mmol/L，NaHCO₃ 25 mmol/L，HEPES 25 mmol/L，Glucose 11 mmol/L)消化5 min，弃去消化液，上述交替消化过程重复3次后，向心肌组织碎块加入完全移植物培养液(IMDM 500 mL，体积分数10%胎牛血清50 mL，100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素5 mL， 200 mmol/L L-谷氨酰胺5 mL，2-巯基乙醇3.5 μL)洗2次后，用吸管小心将心肌组织碎块转移入25 cm²培养瓶中，尽量在瓶底均匀铺开(上述操作均在25 ℃室温下完成)，然后加入少量完全移植物培养液约1 mL，放入37 ℃体积分数5%CO₂恒温水浴培养箱中培养12 h后加入4 mL完全移植物培养液继续培养，称之为原代培养(P0，一个心脏所得到的组织碎块种植于一个培养瓶中)。每3 d换液1次，并在倒置显微镜下逐日观察细胞生长情况。10 d左右细胞增殖铺满培养瓶底，即可进行传代。吸取并弃去培养瓶中培养液，用PBS洗2次，加入0.05%胰酶-0.53 mmol/L EDTA(0.25%的胰酶按1∶4稀释)1 mL消化两三分钟，镜下可见细胞收缩变圆，立即加入10 mL移植物培养液终止反应，并反复用吸管吸取瓶底液体吹打培养瓶底壁，使附壁细胞脱落形成细胞悬液，将细胞悬液移至15 mL圆锥状离心管，1 000 r/min转速下离心5 min。弃去上清并重新加入完全移植物培养液 10 mL，按1∶2传代的比例分成两个培养瓶继续培养。传代后的细胞也是3 d换液1次。细胞接近90%融合时重复上述操作，反复传代扩增。所有用于动物实验的细胞均为第3代细胞。详见课题组以往报道^[21-22]。

心肌干细胞移植：动物模型制备成功2周后，动物重新麻醉。行气管插管。随后实验组及对照组动物进行第2次开胸手术并分别接受PKH26标记的5×10⁶心肌干细胞或等量的PBS从梗死心肌局部注射。放置引流软管、关胸、注射抗生素及止痛药均与模型制备阶段相同。

单极电图的记录：单极心外膜电图由放置在梗死区、梗死边缘区、非梗死区心外膜的电极和标准双极肢导联连续的记录。心电图也同时被体表皮下针电极所导引并记录。信号也被Biopac Systems所采集和储存。取窦性心律时段，测量单极电图激动恢复时间(activation recovery time, ART)，计算激动恢复时间离散度(ART dispersion, ARTd)。并且通过Bazett方程校正(ARTc=ART/square root from RR)得到校正激动恢复时间(ARTc)和激动恢复时间离散度(ARTcd)。激动恢复时间是单极电图QRS波斜率最少值与单极电图T波斜率最大值之间的时间间期，激动恢复时间离散度是同一只大鼠激动恢复时间最大值与最少值之差^[23-24]。

恶性心律失常的诱发：梗死区、梗死边缘区和非梗死区的程序电刺激包括S1S2、S1S2S3和Burst 刺激，由DF-6A程序电刺激器进行评估。S1S2：一个周期的长度为120 ms共8次基础刺激和1次额外刺激；S1S2S3：1个周期的长度为120 ms共8次基础刺激和2次额外刺激。Burst 刺激：在周期长度为1 s的时间内执行100/90/80/70/60/50 ms的程序刺激。在刺激的同时，ECG被1个频率为0.05- 500 Hz 的ECG多通道放大器记录并储存在计算机中(Biopac Systems，Goleta，美国)。同一只大鼠，在任何部位、任何程序刺激下，诱发出室性心动过速和/或心室颤动视为诱发恶性室性心律失常成功。

室颤阈值测定：使用美国危重病研究所研制的室颤诱发器^[25]，分别在梗死区、梗死边缘区和非梗死区给予频率为30 Hz，每次脉冲长度为10 ms总长为500 ms的电刺激，电流由1 mA开始逐渐增加，每次增加1 mA，在2次刺激之间给予2 min的间隔，直到两次均能诱发出室颤的最低电流为止。室颤阈值(ventricular fibrillation threshold，VFT)为能引起心室颤动的最小电流强度。

组织免疫荧光检测：实验结束后，取出心脏，常规石蜡包埋切片，在梗死边缘区切取5 μm厚的切片行组织免疫荧光染色，检测连接蛋白43和α-肌动蛋白表达。

主要观察指标：心肌干细胞移植治疗后12周，检测梗死区、梗死边缘区、非梗死区的单极电图、所诱发的恶性心律失常的次数及室颤阈值。在实验结束后，行组织免疫荧光法检测由心肌干细胞所分化而来的心肌细胞连接蛋白43及α-肌动蛋白的表达。

统计学分析：统计学处理由独立的与实验无关的统计人员实施。数据用x(_)±s表示，采用SPSS 10.0 for windows 软件处理，两独立配对样本的资料用Student’s 双尾t 检验。所诱发的恶性心律失常的次数采用Fisher 精确检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

大量研究证实多种类型细胞移植可以保护及修复心肌梗死后缺血及坏死的心肌组织，改善心功能，但也同时发现这些细胞治疗存在不同程度上的致瘤、致心律失常等风险^[26-28]。与其他干细胞相比，心肌干细胞来源心脏本身，具有较好的同质性，心肌干细胞具有向心肌组织细胞定向分化的潜能，能在一定的诱导条件及合适的体内生长微环境中，定向分化为心肌组织细胞系，具备潜在的心脏损伤修复能力，从根本上避免了其他种类干细胞因多向分化潜能而并发的致瘤风险^[18^，^29-30]。本研究对心肌干细胞移植治疗心肌梗死后的心电生理稳定性和室颤阈值方面进行了检测及评估。

心肌梗死后逐步形成一个高度异质性、可致心律失常的梗死边缘区，其内可形成自主去极化并致额外收缩活动的局部灶点，也可形成可抑制信号兴奋、传导的区域。在梗死区域内移植干细胞可使梗死边缘区内产生新的电生理异质性和电折返通路。心外膜单极电图记录的激动恢复时间、激动恢复时间离散度是评价心室传导、心室复极均一性的重要数据，恶性室性心律失常诱发率和室颤阈值是评价心脏电稳定性及心室易颤性的重要指标^[31-32]。课题组前期实验结果显示^[21-22]，实验组在梗死边缘区与对照组相比，激动恢复时间、激动恢复时间离散度、纠正的激动恢复时间和纠正的激动恢复时间离散度明显缩短，室颤阈值显著提高，表明了短中期内心肌干细胞治疗后能明显改善大鼠心肌梗死后的电生理学稳定性和室颤阈值。本次研究结果显示，心肌干细胞移植治疗心肌梗死12周后，与对照组相比，实验组梗死区、梗死边缘区和非梗死区的激动恢复时间、纠正的激动恢复时间、纠正的激动恢复时间离散度差异均无显著性意义(P > 0.05)，仅有下降趋势；在室颤阈值方面，实验组梗死区、梗死边缘区与对照组相比差异也无显著性意义(P > 0.05)，仅有升高趋势。研究提示了心肌干细胞未能长期保持有效改善心肌梗死电生理学稳定性和室颤阈值的治疗效果。此外，本研究也表明心肌干细胞移植治疗并不增加心肌梗死后心律失常的风险，与有关心肌干细胞治疗缺血性心肌病的临床试验研究(SCIPIO)结果相一致。SCIPIO临床试验发现^[2^，^33]，接受心肌干细胞移植治疗的心肌缺血患者其心功能明显改善，并且心肌干细胞改善心功能的效果至少能持续1年，在整个治疗及随访过程中均未发现明显的不良反应，包括恶性心律失常事件。可见，长期移植心肌干细胞治疗心肌梗死是安全的，无明显致心律失常作用。

缝隙连接是维持细胞间正常电偶联、心脏正常电活动以及协调舒缩的前提。缝隙连接蛋白43是心室肌细胞间缝隙连接通道最主要的组成蛋白。缝隙连接蛋白43与心肌梗死后心力衰竭及心律失常的发生发展密切相关^[34-35]。已有研究证实^[36-37]，心肌干细胞分化的心肌细胞具有成熟的电生理特性，可表达大量缝隙连接蛋白，与原有心肌细胞形成有效的耦联连接，重新组成一个功能性整体，是心肌干细胞移植治疗改善心肌梗死后心电生理稳定性和室颤阈值的重要机制。本研究组织免疫荧光结果也可见心肌干细胞存活，且可分化表达缝隙连接蛋白43及α-肌动蛋白。短中期内心肌干细胞移植治疗能够明显改善心电生理稳定性和室颤阈值，但长期的作用效果并不令人满意。作者分析其可能的原因和机制可能包括：①研究所用的样本量可能不够大，未能发现心肌干细胞干预治疗的差异影响。②心肌干细胞可能与其他干细胞类型一样^[38-39]，不能在心肌梗死组织缺血、缺氧的微环境中长期大量存活及有效分化为成熟心肌细胞并大量表达缝隙连接蛋白43，不能长期维持分泌足够的旁分泌因子以促进改善心肌梗死血运重建，以改善心肌梗死后心室重构。③心肌梗死后RAAS持续激活^[40]、瘢痕组织形成等所致心功能持续恶化^[41]，抵消了心肌干细胞移植治疗所带来的正面效应。

综述所述，长期心肌干细胞移植治疗心肌梗死是安全的，无明显致心律失常危险性；本研究提示心肌干细胞治疗未能长期有效改进心肌梗死后心力衰竭心脏室颤阈值和电生理稳定性，其机制有待更多及更大规模研究进一步探索。

心肌干细胞移植心肌梗死区12周后的心电生理稳定性及室颤阈值改善效应

Long-term effects of cardiac stem cells transplantation to improve the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold after myocardial infarction

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[1]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[2]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[3]	刘立华, 孙伟, 王云亭, 高福强, 程立明, 李子荣, 王江宁. 头颈部开窗减压治疗L1型激素性股骨头坏死：单中心前瞻性临床研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 906-911.
[4]	蒋欣, 乔良伟, 孙东, 李明, 房军, 曲青山. 肾移植患者血清中长链非编码RNA PGM5-AS1表达及调控人肾小球内皮细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 741-745.
[5]	聂慧娟, 黄织春. 转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 754-760.
[6]	杨鑫, 金喆, 冯旭, 卢兵. 沈阳市居民对器官、眼组织及遗体捐献的认知及意愿调查[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 779-784.
[7]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[8]	曾祥洪, 梁博伟. 股骨头坏死保髋治疗的新策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 431-437.
[9]	阮光萍, 姚翔, 刘高米洋, 蔡学敏, 李自安, 庞荣清, 王金祥, 潘兴华. 脐带间充质干细胞移植治疗树鼩创伤性全身炎症反应综合征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3994-4000.
[10]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[11]	陈晓, 郭智, 陈丽娜, 刘玄勇, 张弋慧智, 李旭绵, 王月乔, 韦丽娅, 谢晶, 蔺莉. 自体外周血造血干细胞动员采集的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2958-2962.
[12]	张剑慧, 马贺然, 谭毅, 王芝辉. 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2969-2975.
[13]	张红庆, 谢旭芳, 吴晓牧. 干细胞治疗多发性硬化及视神经脊髓炎谱系疾病的有效性和临床应用限制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3049-3056.
[14]	孙维兴, 赵永超, 赵然尊 . 间充质干细胞移植治疗心肌梗死：问题、症结及新突破[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3103-3109.
[15]	郑维蓬, 魏合伟, 刘治军, 万雷, 陈胜, 廖志浩, 胡伟坚. 三维重建CT与X射线片评价单束前交叉韧带类等长重建后骨隧道及移植物状态的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(18): 2881-2886.