丙酮酸对模型大鼠移植小肠细胞间黏附分子表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：小肠移植过程中移植肠不可避免地要受到缺血再灌注的损害，而小肠又对缺血再灌注损伤特别敏感。前期研究证实丙酮酸对小肠和移植小肠缺血再灌注损伤具有保护作用，并探讨了部分相关机制。
目的：在前期研究基础上，进一步证实探讨丙酮酸对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用与移植小肠组织中细胞间黏附分子表达的关系。
方法：选用近交系成年雄性SD大鼠，按随机数字表法分为3组：假手术组行剖腹、左侧肾切除作为对照；移植小肠缺血再灌注组和丙酮酸处理组均建立小肠移植缺血再灌注动物模型，分别于供体小肠阻断血流、灌洗前10 min向肠腔内注入10 mL含有多聚葡萄糖的营养液或含有分析纯丙酮酸的营养液。分别留取缺血45，90 min和再灌注30，180 min小肠组织标本，光镜下观察小肠组织损伤病理变化，免疫组化法检测小肠组织中细胞间黏附分子1的表达。
结果与结论：缺血再灌注不同时相移植小肠缺血再灌注组小肠组织损伤程度均重于其他2组，而丙酮酸处理组小肠组织损伤程度与假手术组相似。缺血期间小肠组织中细胞间黏附分子1的表达均不明显，呈弱阳性；再灌注后移植小肠缺血再灌注组细胞间黏附分子1的表达迅速增加，高于与假手术组及丙酮酸处理组(P < 0.01)，而丙酮酸处理组细胞间黏附分子1的表达变化不明显(P > 0.05)。说明丙酮酸作用下大鼠移植小肠缺血再灌注过程中细胞间黏附分子1的表达减少，可能是丙酮酸保护大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的重要环节之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 移植, 丙酮酸, 移植小肠, 缺血再灌注损伤, 保护作用, 细胞间黏附分子, 模型, 动物, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Grafted small bowels are sensitive to ischemia-reperfusion injury, which is inevitable during transplantation process. Our previous study found the protective effect of pyruvate to rat grafted small bowel and investigated the underlying mechanisms.
OBJECTIVE: To study the relationship between pyruvate protective effect on ischemia-reperfusion injury and expression of intercellular adhesion molecular 1 of grafted small bowel.
METHODS: Adult male Sprague-Dawley rats of inbred line were randomly divided into three groups. Sham operation group: Rats underwent the laparotomy and the left nephrectomy. Ischemia/reperfusion group and pyruvate group: Ischemia/reperfusion rat models of small bowel transplantation were established and received lavage injection of nutrient solution only or nutrient solution with pyruvate, before donor intestinal blocking blood flow. Small intestinal tissue was harvested at 45, 90 minutes after ischemia and 30, 180 minutes after reperfusion. The pathological changes of small intestinal injury were observed under light microscope. The expression of intercellular adhesion molecular 1 was detected by immunohistochemistry in the small intestine tissue samples.
RESULTS AND CONCLUSION: The pathological injury of small intestine tissue at different time points of ischemia/reperfusion was severer in the ischemia/ reperfusion group than that in sham operation group and pyruvate group, and there was no significant difference in the latter two groups. The expression of intercellular adhesion molecular 1 stayed at a low level during ischemia period, and appeared sharp rise during reperfusion period, which was higher than that in the sham operation group and pyruvate group (P < 0.01). No significant differences were found between sham operation group and pyruvate group in the expression (P > 0.05). We conclude that pyruvate can afford protective effect to ischemia/reperfusion injury of grafted small bowel. The mechanism of protective effect of pyruvate is associated with decrease expression of intercellular adhesion molecular 1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Pyruvate, Reperfusion Injury, Intercellular Adhesion Molecular 1, Small Intestine, Transplantation, Models, Animal

中图分类号:

R318

郝志强，张涛，李孟彬，王为忠，张洪伟. 丙酮酸对模型大鼠移植小肠细胞间黏附分子表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 783-787.

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图/表（结果） 1

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引言

小肠移植难度大、成功率低，主要的限制因素在于：小肠是人体最大的免疫器官，移植后的排斥反应十分明显；小肠在移植过程中不可避免的要受到缺血再灌注损伤的损害，而小肠又对缺血再灌注损伤特别敏感，缺血再灌注不仅损伤肠黏膜屏障，而且导致肠内细菌毒素移位，可能诱发全身炎性反应综合征导致多脏器功能衰竭，进而导致移植失败^[1]。因此防止和减轻小肠在移植过程中的缺血再灌注损伤是小肠移植成功的关键，也是小肠移植研究的热点内容之一。

丙酮酸是一种弱的有机酸，它是糖代谢中具有关键作用的中间产物，在糖、脂肪、氨基酸代谢联系中起着重要的枢纽作用^[2-3]。近年来，大量的研究证实丙酮酸对机体的各脏器如小肠、脑、肺脏等的缺血再灌注损伤具有保护作用，并且可以改善严重休克的预后^[4-9]。但丙酮酸的这种对再灌输损伤保护的机制尚不十分清楚，据推测可能与丙酮酸具有抗氧化、抑制氧自由基，提供能量等有关。

作为机体正常生理能量代谢的中间产物，丙酮酸在超生理浓度下对防止和减轻组织缺血再灌注损伤有确实的保护作用，且无免疫原性和毒副作用，所以，研究丙酮酸在小肠移植中的保护作用具有乐观临床应用前景。Petrat等^[10]研究发现丙酮酸灌注对大鼠严重肠缺血再灌注损伤具有保护作用，其主要机制有：影响糖代谢、抑制氧自由基损伤及炎症递质活化、减少中性粒细胞浸润等。韩鑫等^[11]通过建立急性阻塞性肠缺血再灌注大鼠模型，观察丙酮酸干预的效果，并比较幼龄大鼠与成年大鼠的区别，结果发现，丙酮酸可以减轻再灌注损伤，其机制与其减轻再灌注时氧自由基大量产生有关，在相同条件下，幼龄大鼠比成年大鼠对肠缺血再灌注更为敏感。

细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)是参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子，是一类独立的分子结构，是通过识别与其黏附的特异性受体而发生相互间的黏附现象。大量研究显示，黏附分子在心肌^[12-13]、肝^[14-15]、脑^[16-17]、肺^[18-19]、肾^[20-21]，视网膜等缺血再灌注损伤中发挥着重要的作用^[22-23]，但是在小肠移植中缺血再灌注损伤与黏附分子之间的关系研究较少。

作者的前期研究显示，在再灌注期间，丙酮酸降低大鼠移植小肠缺血再灌损伤中核转录因子κB的活性，起到保护作用^[24-25]。那么，本研究进一步探讨丙酮酸的这种保护作用与移植小肠组织中细胞间黏附分子表达的关系及可能的机制。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2003年10月至2004年4月在解放军第四军医大学西京医院胃肠外科实验室(生物安全防护水平：adsl-2)完成。

材料：

实验动物：选用近交系成年雄性SD大鼠54只，体质量200-250 g，由解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号SCKK(军)2002-05。大鼠置于无病原的环境中饲养，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

实验用试剂：丙酮酸，Sigma公司产品；含有0.26 g多聚葡萄糖的营养液，商品名能全力，由纽迪希亚制药(无锡)有限公司提供；兔抗大鼠NF.Kt3多克隆抗体，试剂盒由武汉博士得生物工程有限公司提供。

实验方法：

动物分组：将78只近交系成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组：①假手术组6只，行剖腹、左侧肾切除与移植组对照。②移植小肠缺血再灌注组36只(12只供体，24只受体)，于供体小肠阻断血流、灌洗前10 min向肠腔内注入含有0.26 g多聚葡萄糖的营养液10 mL(能全力)。③丙酮酸处理组36只(12只供体，24只受体)，于供体小肠阻断血流、灌洗前10 min向肠腔内注入含有0.32 g分析纯丙酮酸的营养液10 mL。

动物模型建立：大鼠于术前12 h禁食。以2℅盐酸氯胺酮75 mg/kg腹腔内麻醉，分离肠系膜上动脉，用动脉夹夹闭肠系膜上动脉5 min，再开放5 min，反复3次，制成缺血预处理模型。

参照Wallander等^[11]的方法建立移植小肠缺血再灌注动物模型，利用聚乙烯CUFF套管行移植肠门静脉和受体左肾静脉套袖式吻合，将供体肠系膜上动脉根部的腹主动脉修剪成Carrel补片，缝至受体肾下腹主动脉上。冷缺血时间约1.5 h。

移植小肠缺血再灌注组和丙酮酸处理组分别于冷保存45，90 min和再灌注30，180 min四个时间点取材，留取移植肠组织标本，每个时间点各取6只大鼠。

小肠黏膜组织细胞间黏附分子1检测：取长约1.5 cm全层小肠组织，修剪后以体积分数为10%的甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察组织学改变。各组的组织切片通过SABC法进行免疫组化染色及封片镜检并作病理学观察。兔抗大鼠NF.Kt3多克隆抗体染色，按说明书操作。

结果观察：黄褐色颗粒为阳性产物，在显微镜400倍下用HPIAS-1000型医学彩色图像分析系统测量吸光度值(每张切片取2个视野)，然后计算吸光度值的均值作为不同时相小肠黏膜组织细胞间黏附分子1表达的代表值。

主要观察指标：各组大鼠不同时相小肠黏膜组织细胞间黏附分子1表达的吸光度值。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 10.0软件包进行数据分析，各参数以x(_)±s表示，经单因素方差分析处理数据，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

细胞黏附分子是一类由细胞合成并存在于细胞表面的糖蛋白，其主要作用为促进细胞之间和细胞与组织间的黏附^[26-27]。依据其生化结构可将细胞黏附分子分为5类：①整合素家族。整合素是由α和β两个亚单位形成的异二聚体，迄今已发现16种α亚单位和9种β亚单位，它们按不同的组合构成20余种整合素。整合素(integrin)大多为亲异性细胞黏附分子，其作用依赖于Ca²⁺，介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用。②选择素基因超家族。选择素(selectin)属亲异性细胞黏附分子，其作用依赖于Ca²⁺，主要参与白细胞与脉管内皮细胞之间的识别与黏合。已知选择素有3种：L-选择素、E-选择素及P-选择素。③免疫球蛋白超家族。免疫球蛋白超家族(Ig-superfamily，Ig-SF)包括分子结构中含有免疫球蛋白样结构域的所有分子，一般不依赖于Ca²⁺。除免疫球蛋白外，还包括T细胞受体，B细胞受体，MHC及ICAM等。④钙离子依赖型家族。钙黏素(cadherin)至今已鉴定出30种以上，分布于不同的组织，其作用主要有介导细胞连接、参与细胞分化及抑制细胞迁移。⑤其他黏附分子，如CD44等。其中与缺血再灌注损伤(IRI)密切相关的是前3类。

正常情况下，血管内皮细胞和中性粒细胞(PMN)表面的细胞黏附分子呈低表达状态，中性粒细胞与血管内皮细胞虽然接触，却并不发生黏附。但缺血再灌注损伤后组织局部产生的活性细胞因子一方面刺激组织血管内皮细胞及组织细胞表面选择素家族(E-选择素、P-选择素)和免疫球蛋白家族(ICAM-1/2、VCAM-1)表达上调，另一方面刺激中性粒细胞表面的整合素家族(CD11a/CD18、CD11b/ CD8)表达上调和L-选择素的脱落。然后中性粒细胞与血管1内皮细胞表面的黏附分子相互结合引起中性粒细胞的黏附、聚集。研究表明缺血再灌注损伤早期主要有L-选择素、P-选择素和E-选择素的参与^[28-33]，后期则主要是CD11a/CD18、CD11b/CD18和ICAM-1/2、VCAM-1的参与^[34-36]。

Olanders等^[37]认为多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是通过多因素引起的，其中活化的中性粒细胞与内皮细胞的相互作用起到了核心作用。小肠缺血再灌注组织局部细胞黏附分子表达是中性粒细胞和内皮细胞黏附、激活的基础。细胞黏附分子1存在于多种细胞的表面，缺血再灌注时介导了活化的中性粒细胞黏附和自毛细血管后微静脉向组织的迁移。Olanders等^[37]检测了小肠缺血再灌注后多种器官中细胞黏附分子1的表达，结果发现小肠缺血再灌注后伴有系统性的细胞黏附分子1表达增加，而且这种增加因器官而异，肺、小肠、脑、肌肉中的细胞黏附分子1的含量均显著增高。小肠缺血再灌注后所有被检器官均有白蛋白的泄漏，而且肺组织中髓过氧化物酶的活性增加。表明细胞黏附分子1的表达增加是活化中性粒细胞黏附和迁移的重要环节，并可能与组织损伤的进展有关。

本实验研究显示小肠缺血再灌注损伤后细胞黏附分子1表达于表面上皮和隐窝上皮细胞，也表达于血管内皮细胞，但在小肠黏膜间质小血管内皮中表达更为显著。冷保存缺血期间各组小肠组织中细胞黏附分子1的表达均不明显，仅有弱阳性表达，可能与低温保存条件下蛋白合成受抑制有关。再灌注后移植小肠缺血再灌注组小肠黏膜组织中细胞黏附分子1的表达迅速增加，明显高于假手术组及丙酮酸处理组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。再灌注后丙酮酸处理组小肠组织中细胞黏附分子1的表达变化不明显，与假手术组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果说明丙酮酸对小肠缺血再灌注损伤的保护作用与减少细胞黏附分子1的表达、进而减少中性粒细胞的黏附和激活有关。