骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：多肽水凝胶因为其具有良好的可塑型性，能够与损伤部位很好的无缝隙结合，所以采用该材料作为支架是骨、软骨组织工程中一种可行的探索。
目的：骨髓间充质干细胞联合新型可注射多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损，观察其修复效果。
方法：首先分离培养兔骨髓间充质干细胞，兔左侧膝关节处制备直径5 mm，深3 mm的全层骨-软骨缺损模型；右侧造模后空置作为对照。实验分为3组，单纯自组装多肽凝胶移植组，自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组。采用的成软骨因子包括转化生长因子β1，地塞米松和胰岛素样生长因子1，三者混合后加入到自组装多肽凝胶或骨髓间充质干细胞中。于处理后12周时处死动物行大体及组织学观察、X射线摄片、免疫组织化学法进行组织学评分评估修复情况。
结果与结论：单纯自组装多肽凝胶移植在12周后显示出非常好的修复效果，可见番红O染色，Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色强度以及组织学评分明显高于其他组(P < 0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子组修复效果较好，与自组装多肽凝胶组相似，但其修复区域蛋白聚糖表达比对照组明显升高(P < 0.01)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组修复效果不佳，12周未能完全修复缺损区域，与单纯自组装多肽凝胶组比较骨赘的形成有所增加。结果表明，单纯自组装多肽凝胶能够在原位修复骨软骨缺损并促进软骨修复，提示以自组装多肽凝胶支架移植有望提高目前修复软骨缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 自组装肽凝胶, 骨髓间充质干细胞, 组织工程, 软骨缺损, 支架

Abstract:

BACKGROUND: Peptide hydrogel has good plasticity, and it can fill the injured site very well; therefore, to use this material as a scaffold is a feasible exploration in bone and cartilage tissue engineering.
OBJECTIVE: To test the effect of bone marrow mesenchymal stem cells combined with injectable peptide hydrogel and chondrogenic factors for repair of articular cartilage defects in rabbits.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from rabbits were isolated and cultured. A full-thickness bone-cartilage defect model, 5 mm in diameter and 3 mm in depth, was made on the left knee joint of rabbits, and the right knee joint of rabbits with no treatment was used as control after modeling. There were three experimental groups: self-assembling peptide hydrogel group, peptide hydrogel+chondrogenic factors group, and peptide hydrogel+chondrogenic factors+bone marrow mesenchymal stem cells group. Transforming growth factor β1, dexamethasone and insulin-like growth factor 1 were mixed as chondrogenic factors and added into self-assembling peptide hydrogel or bone marrow mesenchymal stem cells. Twelve weeks after treatment, animals were sacrificed for gross and histological observation, X-ray radiography, and histological evaluation using immunohistochemistry method.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after treatment, the self-assembling peptide hydrogel group showed excellent results in the cartilage repair, and better achievements in safranin-O staining, collagen II immunostaining, and histological scores than the other groups (P < 0.05); the peptide hydrogel+chondrogenic factors group had better repair effects similar to the self-assembling peptide hydrogel group, but the expression of proteoglycans was higher than that in the control group (P < 0.01); there were poorer repair effects and more osteophytes in the peptide hydrogel+chondrogenic factors+bone marrow mesenchymal stem cells group than the the peptide hydrogel+ chondrogenic factors group. Experimental findings indicate that the self-assembling peptide hydrogel can repair cartilage defects in situ and improve cartilage repair, which is expected to improve current repairing effects on cartilage defects.

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Key words: Mesenchymal Stem Cells, Cytokines, Cartilage

中图分类号:

R394.2

王岩，李德华. 骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 30-36.

Wang Yan, Li De-hua. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with peptide hydrogel and chondrogenic factors for repair of articular cartilage defects in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 30-36.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验选用新西兰白兔18只，分为3组，实验过程动物无脱落，24只动物全部进入结果分析。

2.2 各组兔股骨影像学分析结果 影像学检测各组动物在治疗前未发现有任何骨局部硬结出现。治疗后自组装多肽凝胶组未见有明显骨赘出现，而自组装多肽凝胶+成软骨因子显现有轻微骨赘形成。自组装多肽凝胶+成软骨因子+ 骨髓间充质干细胞组可见明显骨赘形成，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 各组兔关节局部大体观察结果 关节修复区未见炎症反应，表明局部无免疫抑制反应发生。各组修复的软骨与周围正常的软骨组织相容度较好，组间差异无显著性意义(P ≥ 0.05)。

从整合度上分析，修复的组织接近周围正常组织，组间比较差异无显著性意义(P ≥ 0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组显示有轻度的骨赘形成，比单纯自组装多肽凝胶组评分高(P < 0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组较未处理组对于软骨下骨有更好的贴附作用(P < 0.05)。总之，治疗组软骨修复的量都大于对侧的空白对照组(P < 0.05)，并且修复的效果也优于对侧的未处理组(P < 0.05)。各组软骨缺损治疗侧都要优于他们各自的对侧未治疗侧(P < 0.05)。软骨缺损治疗侧修复评分高于对侧的软骨缺损未治疗侧(P < 0.05)。见图1，表2。

2.4 各组兔关节软骨组织学检查结果 通过滑膜苏木精-伊红检查显示，各治疗组有轻度的内膜增生和中度的血管化和内膜纤维化，但是各组之间差异无显著性意义(P ≥0.05)。关节软骨的苏木精-伊红染色评分显示，治疗组较对侧关节对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。自组装多肽凝胶和自组装多肽凝胶+成软骨因子组累计的评分高于自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。单纯自组装多肽凝胶组的最终组织学评分是最高的。其他组都有纤维软骨和非软骨细胞出现。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组表面修复平整度较差，可见一些裂缝存在(P < 0.01，表3)，还有一些组织降解的表现。细胞数目也较自组装多肽凝胶和自组装多肽凝胶+成软骨因子组有所减少(P < 0.05，表3)。自组装多肽凝胶+成软骨因子组软骨下骨重建情况优于自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。但是各组均在正常水平以下。治疗组情况普遍优于对侧未治疗组(P < 0.05)，自组装多肽凝胶+成软骨因子组在与周围软骨组织贴合方面评分较高，但组间比较差异无显著性意义(P ≥ 0.05)。见表3。

2.5 各组兔关节软骨组织番红O染色结果 单纯自组装多肽凝胶治疗组番红O染色强度比对侧未处理组关节以及其他两组明显增加(P < 0.05，表3)。

图2可见单纯自组装多肽凝胶治疗组导致了整个修复区域大面积番红O染色阳性表达。自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组软骨修复区域番红O染色很弱，且区域小。在关节周围正常的软骨组织番红O染色成阳性表达。

2.6 各组兔关节软骨组织免疫组织化学结果 自组装多肽凝胶治疗组显示，Ⅱ型胶原染色较对侧的缺损未处理组明显增加(P < 0.05)；尽管自组装多肽凝胶治疗组蛋白多糖免疫染色获得了较高的分数，但是其与对侧关节对照组之间差异无显著性意义(P ≥ 0.05)。这与从番红染色的结果正好相反。自组装多肽凝胶+成软骨因子治疗组发现修复的组织内部蛋白聚糖成分较对侧的未处理组增多(P < 0.05)。此外，虽然自组装多肽凝胶+成软骨因子治疗组型胶原免疫组化染色评分最高，但和其对侧的未处理组相比差异无显著性意义(P≥0.05)。对比所有的缺损，治疗组缺损处较未处理组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达都增多(P < 0.01)。Ⅰ型胶原蛋白也在所有治疗组的缺损处发现和Ⅱ型胶原和蛋白表达相似。这与大体组织观察的评分结果相一致，见表4。

总之，在修复的组织区域，Ⅱ型胶原和蛋白在组织内部表达的明显，而Ⅱ型胶原蛋白在表面表达的多一些。蛋白聚糖的表达比较成均匀分布，但是只在组织内部出现较强的阳性反应。

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引言

材料方法

设计：平行对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年5月至2014年5月在辽宁医学院完成。

材料：

实验动物：选取清洁级雄性12月龄健康新西兰白兔18只，体质量3.5 kg左右。左侧膝关节制作缺损模型，右侧造模后空置作为对照，死亡的动物不进入统计分析。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定：按照文献的方法进行分离培养及鉴定。乙醚麻醉兔子后，通过穿刺针抽取骨髓并分离单个核细胞，采用α-MEM培养基(含体积分数10% FBS，2 μg/L成纤维细胞生长因子2，100 U/mL 青霉素，100 mg/L 链霉素)通过贴壁培养实验进行纯化。倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞汇合约达80%时，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化，以1×10⁴/cm²进行传代接种于75 cm²培养瓶中进行传代培养。当传至第3代时，当细胞扩增到足够的数量进行移植实验。
兔膝关节缺损模型制备：采用乙醚吸入方法麻醉动物。从兔左侧膝盖骨中央切开皮肤，暴露关节面，采用电动骨转在股骨关节面正中沟内转一个直径5 mm，深3 mm的全层关节软骨缺损。采用外科海绵对创口进行止血，确保多肽材料移植时无出血。关节缺损处按照实验分组情况分别给予移植水凝胶，大体观察凝胶直到填充满缺损区域。

实验分组：动物随机分为3组，每组6只。

左侧膝关节为关节缺损模型治疗组：①自组装多肽凝胶组：用10%无菌蔗糖悬浮，使自组装多肽凝胶终浓度为3.2 g/L。②自组装多肽凝胶+成软骨因子组：自组装多肽凝胶多肽(48 μg) 与成软骨因子预先混合，使混合物最终含有1.4 ng肿瘤转化生长因子β1，0.6 ng地塞米松，4.1 ng生物素化的胰岛素样生长因子1。③自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组：自组装多肽凝胶多肽(48 μg)与成软骨因子预先混合，使混合物最终含有1.4 ng肿瘤转化生长因子β1，0.6 ng地塞米松，4.1 ng生物素化的胰岛素样生长因子1；将1.5×10⁵骨髓间充质干细胞包裹入自组装多肽凝胶/成软骨因子混合物中^[12]。如果所有的肿瘤转化生长因子β1从支架中释放出来，其量将达到1 μg/L的浓度(1.4 ng/1.4 mL 关节体积)，而兔关节处的自然浓度为52.3 ng/L^[15]。胰岛素样生长因子1按照1∶1分子比例进行混合。生物素化的胰岛素样生长因子1的量可在局部提供300 μg/L浓度，完全能够满足刺激软骨细胞合成蛋白多糖的剂量(见表1)。动物左侧关节为治疗组，而右侧关节造模后不做处理作为对照组。

放射摄影分析骨修复区：各组处理后12周采用股骨侧截面进行放射摄像和照片。摄像片评分按照细胞溶解度、骨增殖、骨赘、膝盖骨异位等项目进行。将各项分值进行求和计算总的放射线评分。最大值为16，每项分值为0-4分(0=无，1=轻微，2=轻度，3=中等，4=严重)^[15]。此外，动物处死后缺损修复区域的放射线评分采用 (0=无愈合，1=轻微愈合，2=轻度骨填充，3=损伤可见修复但很难进行测量，4=损伤基本愈合)。

关节区的大体病理学观察：对于动物肢体和关节的检测采用盲测法，检测者不清楚实验分组情况。各组处理后12周先剪下肢体并且采用灵活的测量方式在相似的膝关节解剖位置上进行观察。评分体系采用Frisbie等^[7]的研究方法。滑膜组织学观察分离滑膜组织置于体积分数4%中性甲醛溶液中，制成石蜡块，然后切5 μm厚度切片，苏木精-伊红染色后进行观察。采用盲测法对细胞浸润，血管化，内膜增生，内膜下水肿和血管内膜下纤维化进行评分。评分分级为0-4(0=无，1=微，2=轻，3=中，4=重)。

关节软骨组织学和免疫组织化学法检测：

苏木精-伊红染色：组织固定后脱钙，石蜡包埋，切5 μm厚切片，行苏木精-伊红染色或番红，快绿染色(观察蛋白多糖情况)。苏木精-伊红染色评分采用盲测法，采用改良的O’Driscoll 评分系统进行评估^[7]。番红，快绿染色评估采用染色强度进行。

免疫组织化学：5 μm切片脱蜡，水化，过氧化氢去除内源性过氧化酶，抗原修复，正常牛血清封闭。加兔抗Ⅰ和Ⅱ型胶原蛋白抗体(浓度均为1∶200)4 ℃过夜，复温，加入羊抗兔二体30 min，PBS洗3次，经DAB显色，苏木精复染胞核，脱水，封固，镜下观察。免疫组化评分标准为：0=无染色，1=1%-25%，2=26%-50%，3=51%-75%，4=76%-100%。

主要观察指标：①各组兔股骨影像学分析结果。②各组兔关节局部大体观察结果。③各组兔关节软骨组织学检查结果。④各组兔关节软骨组织番红O染色结果。⑤各组兔关节软骨组织免疫组织化学结果。

统计学分析：实验所得数据采用SPSS 16.0统计软件包进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验、方差分析等方法，以P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

3.1 自组装多肽凝胶移植修复兔全层关节软骨缺损的效果 从组织学评分、番红染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫染色上看，采用自组装多肽凝胶治疗全层关节软骨缺损显著提高了软骨的再生。自组装多肽凝胶具有免疫原性小，促进软骨再生以及可以通过关节镜注射的方式进行注射移植手术等优点，所以具有十分方便的优点。向自组装多肽凝胶中添加肿瘤转化生长因子β1，地塞米松和胰岛素样生长因子1虽然导致了蛋白聚糖的增加，但是并未取得比单纯自组装多肽凝胶移植更好的修复效果。当将细胞因子联合骨髓间充质干细胞一同移植的时候，结果发现其修复效果明显比单纯自组装多肽凝胶组合自组装多肽凝胶+成软骨因子要差^[16]。这与一些文献报道移植骨髓间充质干细胞后导致纤维组织形成的负面报道相似^[17]。

在本次实验兔子模型中，由于关节全层缺损的原因，骨髓能够渗透到缺损处^[18]。并成为细胞源，这与磨削性关节成形和微骨折外科手术的原理非常相似。单纯自组装多肽凝胶组的治疗作用表面，自组装多肽凝胶支架支持细胞移动并在体内进一步形成软骨组织。自组装多肽凝胶支架的高空隙性(99.6%为水成分^[19])与近来的Ikeda等^[20]研究结果相似，他们采用了具有孔隙率>85% 特征的支架材料，促进骨髓细胞的移动到多聚支架上来。

自组装多肽凝胶+成软骨因子治疗组结果显示，成软骨因子的剂量对于促进内源性细胞反应以及细胞迁移是否足够？从组织学评分、番红染色、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达情况上看，所有的成软骨因子没有显示出比单纯自组装多肽凝胶组增强软骨形成的作用。这与Holland等^[21]的结果相似，他认为肿瘤转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1在明胶支架中并不能增强修复效果，这与在体外的实验结果不一致。他的实验中也观察了单独给予胰岛素样生长因子1因子能够明显的促进并改善修复效果。此外，其他研究表明，单独在体内应用胰岛素样生长因子1也出现了类似的结果^[22]，然而在本实验中测试单独应用胰岛素样生长因子1的治疗效果。实验结果提示，还需要进一步改善胰岛素样生长因子1细胞因子的组合方式，以便能够达到一个最优的修复效果。

3.2 细胞因子与软骨修复 在关节内使用肿瘤转化生长因子β1是否合适还存在争议，因为常常可以看到滑膜组织发生炎症反应并有渗出物出现。研究发现，肿瘤转化生长因子β1可以和多种关节组织有相互作用，当接触滑膜组织时肿瘤转化生长因子β1能够刺激软骨组织蛋白聚糖的生成，滑膜纤维化随之发生。肿瘤转化生长因子β1也经常会诱导骨赘形成^[23]。

Diao等^[24]研究显示，将带有肿瘤转化生长因子β1的腺病毒载体注射到关节腔后，造成了严重的关节感染，当然，他当时移植的剂量是本实验的6倍多。在本实验中，将肿瘤转化生长因子β1加入到多肽凝胶后并没有发现这种炎症现象发生。与此相反，当肿瘤转化生长因子β1与骨髓间充质干细胞联合移植后，骨赘形成增加，表明肿瘤转化生长因子β1与骨髓间充质干细胞的相互作用使得成骨作用增强，而单纯应用肿瘤转化生长因子β1 没有那么强的成骨作用^[23]。这个发现与近期Guo等^[25]报道的结果相似。

实验还观察到当在同一只兔子身上一侧移植1.4 ng 肿瘤转化生长因子β1+骨髓间充质干细胞而另一侧移植 0.7 ng肿瘤转化生长因子β1+骨髓间充质干细胞时，过多的骨赘形成和正常关节解剖结构的紊乱。令人不解的是给予的肿瘤转化生长因子β1的总剂量在自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组里仅仅是Mi等^[26]的1.5倍，细胞数量是他们的2倍多一点，而在自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组里移植的肿瘤转化生长因子β1的量还要比Mi等^[26]的低。仍然有这样的可能，即肿瘤转化生长因子β1水平如果太高，它和骨髓间充质干细胞联合后不利于软骨化进程^[27]。当然，这还得排除地塞米松的作用，因为地塞米松有促进软骨发生的作用。Fan等^[27]的研究表明，仅仅使用0.8 ng的肿瘤转化生长因子β1与骨髓间充质干细胞与明胶-软骨素-透明质酸复合体支架联合能促进关节软骨损伤的愈合，而骨髓间充质干细胞和肿瘤转化生长因子β1联合使用的效果要差很多^[28]。

综上所述，这些研究表明，采用移植剂量的肿瘤转化生长因子β1联合骨髓间充质干细胞有效的促进了软骨生成，此外还需进一步确定移植的最佳骨髓间充质干细胞的量，还有必须将骨髓间充质干细胞移植会导致滑膜组织间的相互作用因素考虑进去^[29]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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